Метионин - незаменимая протеиногенная аминокислота, содержащаяся во многих пищевых продуктах. В животноводстве она используется как кормовая добавка, в медицине применяется как липотропный фактор. Метаболизм метионина в организме человека включает образование S-аденозилметионина, который далее участвует в многочисленных реакциях трансметилирования. При этом образуется S-аденозилгомоцистеин, гидролизующийся далее до гомоцистеина и аденозина. Гомоцистеин может превращаться обратно в метионин с помощью метионинсинтазы или бетаингомоцистеинметилтрансферазы либо в две реакции образовывать цистеин [1]. Несмотря на то что гомоцистеин является нормальным промежуточным продуктом метаболизма метионина, с повышением его содержания в крови - гипергомоцистеинемией (ГГЦ) - связывают увеличение риска развития ряда заболеваний, таких как неалкогольная жировая болезнь печени [2], ишемическая болезнь сердца, атеросклероз [3]. ГГЦ может развиваться при наследственных дефектах ферментов, участвующих в метаболизме гомоцистеина (метилентетрагидрофолатредуктазы, цистатионин-β-синтазы, реже - метионинсинтазы [4]), при гиповитаминозах В6 и В12, почечной недостаточности, алкоголизме или приеме некоторых лекарственных средств (метотрексата, метилпреднизолона, теофиллина и др.). Повышение уровня гомоцистеина в значительной степени связано с неправильным питанием. Принципиально можно вызвать ГГЦ и избыточным приемом метионина, хотя в отсутствие вышеперечисленных факторов для этого требуются очень высокие дозы аминокислоты. Так, известны модели ГГЦ на крысах, получаемые исключительно путем введения метионина [5].
Одним из органов, наиболее чувствительных к ГГЦ, можно считать печень. Механизмы повреждающего действия гомоцистеина на этот орган до конца неясны. Большинство исследований посвящено изучению эндотелиальной дисфункции, вызываемой избыточным уровнем гомоцистеина, в то же время эта аминокислота присутствует внутри клеток различных органов, где она может разрушать дисульфидные связи в белках, нарушать реакции трансметилирования, усиливать перекисное окисление липидов и белков [6]. Имеются данные о том, что гомоцистеин способен снижать эффект оксида азота (NO) [7], однако механизм такого действия не установлен. Также известно, что повышенный уровень гомоцистеина вызывает митохондриальную дисфункцию [6]. С чем связано нарушение функционирования митохондрий: с прямым действием гомоцистеина на клетки или же с нарушением кровотока в органе за счет уменьшения чувствительности эндотелия к сосудорасширяющим факторам, - неясно. Возможно, такой эффект гомоцистеина опосредован его влиянием на метаболизм NO, так как последний является регулятором функций митохондрий - в них NO ингибирует аконитатгидратазу и цитохром с-оксидазу, а действие его на другие гемсодержащие белки все еще изучается [8].
Целью исследования стало изучение взаимосвязи функционального состояния митохондрий клеток печени и уровня метаболитов NO в них при экспериментальной ГГЦ, вызванной избыточным приемом метионина.
Материал и методы
Объектом исследования служили 17 крыс-самцов линии Вистар. Работа с животными осуществлялась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), приказом Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики" и приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных". Крыс содержали в стандартных условиях вивария, в качестве пищи они получали корм "Чара" ("Ассортимент-Агро", РФ), содержащий 0,7% метионина-цистина в пересчете на сухое вещество, все витамины группы B, в том числе B6 - 28 мг/кг, B9 - 64 мг/кг, B12 - 0,13 мг/кг. Крысы были разделены на 2 группы.
1-я группа (n=9) использовалась для моделирования ГГЦ. С этой целью применяли метод С.Г. Емельянова и соавт. [5] в нашей модификации: в течение 21 дня крысам внутрижелудочно (через зонд) вводили 25% суспензию метионина в дозе 1,5 г метионина на 1 кг массы тела 2 раза в сутки, при этом вместо питьевой воды животные получали 1% водный раствор метионина при свободном доступе к поилкам [9]. Выпиваемый в сутки объем раствора метионина составил 17,2 (15,5; 18,1) мл. В эксперимент были взяты 8 животных с развившейся тяжелой ГГЦ (>100 мкмоль/л), 1 особь была исключена из эксперимента, так как имела умеренную форму ГГЦ. Вторая группа (n=8) была контрольной. Этим крысам вводили суспензионную основу, не содержащую метионин (состав по массе: 10% твина-80, 1% крахмала, 89% воды). Животных умерщвляли под эфирным наркозом путем вскрытия брюшной полости и перерезания брюшной аорты. При этом отбирали кровь и часть печени. Печень отмывали от крови и гомогенизировали на гомогенизаторе "Potter S" ("Sartorius", ФРГ) в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,001 М ЭДТА и 0,05 М трис-буфер, рН 7,4 [10]. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования при 11 000g [11]. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в среде выделения, не содержащей ЭДТА. Для анализа использовали суспензию митохондрий и сыворотку крови.
В сыворотке крови определяли концентрацию гомоцистеина набором для иммуноферментного анализа ("Axis Shield", Великобритания).
В суспензии митохондрий измеряли общий белок методом Лоури с помощью коммерческого набора ("Экосервис", РФ), концентрацию метаболитов NO - методом в модификации В.А. Метельской [12], активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [11], активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - по снижению концентрации НАДН в реакции восстановления пирувата с помощью коммерческого набора ("Diasys", ФРГ), активность Н+-АТФазы - измеряя содержание неорганического фосфата методом Боданского после остановки реакции [13], активность супероксиддисмутазы (СОД) - по торможению реакции аутоокисления кверцети-на [14], уровень Ca2+ - по реакции с арсеназо III с помощью коммерческого набора ("Diasys", ФРГ). Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [15], который основан на реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Затем рассчитывали доли ранних и поздних маркеров окислительной деструкции белков, а также анализировали резервно-адаптационный потенциал [16].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statplus 2009 Portable. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку распределение отличалось от нормального, для проверки достоверности отличий значений в контрольной и опытной группах использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты представлены в форме медианы (1-й квартиль; 3-й квартиль).
Результаты и обсуждение
За 3 нед эксперимента масса крыс, получавших метионин, увеличилась с 246 (229; 262) до 302 (283; 311) г, а животных контрольной группы - с 256 (231; 264) до 307 (275; 314) г. Статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группами в приросте массы тела крыс отсутствовали.
Введение метионина в дозе 3 г на 1 кг массы тела в течение 3 нед с добавлением его в питьевую воду вызвало у крыс развитие тяжелой ГГЦ - уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных увеличился более чем в 50 раз (табл. 1).
)
У крыс экспериментальной группы наблюдалось резкое повышение активности митохондриальных оксидоредуктаз, участвующих в энергетическом обмене, - ЛДГ и СДГ (табл. 2). При этом значительно возрастала и активность Н+-АТФазы (см. табл. 2), что указывает на интенсификацию процесса окислительного фосфорилирования.
Также отмечалось снижение содержания в митохондриях метаболитов NO (см. табл. 2), что, скорее всего, свидетельствует об уменьшении его продукции. Невысокий уровень NO может быть одной из причин, обусловливающих усиление процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях (этот низкомолекулярный регулятор известен как ингибитор ферментов дыхательной цепи и цикла Кребса).
На фоне этих, казалось бы, позитивных эффектов ГГЦ вызывает и негативные явления в митохондриях гепатоцитов. Так, увеличивается степень карбонилирования белков (рис. 1, табл. 3), несмотря на рост активности СОД (см. табл. 2) - одного из ключевых ферментов антиоксидантной защиты митохондрий, обезвреживающего наиболее часто образующийся в результате деятельности дыхательной цепи радикал - супероксидный анион.
)
)
При этом доля кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) - маркеров агрегации белков - возрастает на 6,46% (p=0,0163) по сравнению с долей альдегиддинитрофенилгидразонов (АДНФГ) - маркеров фрагментации белков (рис. 2).
Трехнедельное введение высоких доз метионина привело к снижению резервно-адаптационного потенциала белков митохондрий как в отношении процесса агрегации (на 31,62%; p=0,0039), так и в отношении фрагментации белков (на 17,64%; p=0,5218), что выражается в увеличении соотношения показателей спонтанной ОМБ к ОМБ, индуцированной реакцией Фентона (рис. 3).
)
Одной из причин описанного выше окислительного повреждения белков может быть снижение синтеза NO, ведь известно, что в малых концентрациях эта молекула оказывает антиоксидантный эффект, в отношении окислительного повреждения белков обусловленный главным образом конкуренцией NO за связывание с металлами переменной валентности и торможением реакции Фентона, в результате которой образуется сильнейший окислитель - гидроксильный радикал [17]. Также дефицит NO, возможно, вызывает повышение продукции дыхательной цепью активных форм кислорода. Это может быть единым порочным кругом патогенеза, так как увеличение содержания активных форм кислорода способствует скорейшей инактивации NO.
Кроме того, у крыс, получавших метионин, наблюдается нарушение депонирования Ca2+ в митохондриях гепатоцитов.
Таким образом, высокие дозы метионина способны не только стимулировать энергетический обмен митохондрий, но и вызывать в них оксидативный стресс и нарушать депонирование Ca2+, что может привести к митохондриальной дисфункции. Указанный эффект метионина скорее всего обусловлен высокими концентрациями образующегося из него гомоцистеина.
Заключение
Гипергомоцистеинемия, вызванная введением высоких доз метионина, приводит, с одной стороны, к интенсификации энергетического обмена в митохондриях клеток печени крыс, что выражается в повышении активности ЛДГ, СДГ и Н+АТФазы, с другой - к нарушению депонирования Ca2+ и усилению карбонилирования белков митохондрий с преобладанием процесса агрегации и снижением резервно-адаптационного потенциала, несмотря на увеличение активности СОД. Одной из причин указанных изменений в митохондриях может служить снижение продукции NO.
Литература
1. Мирошниченко И.И., Птицына С.Н., Кузнецова Н.Н. и др. Гомоцистеин - предиктор патологических изменений в организме человека // Рус. мед. журн. 2009. № 4. С. 224-228.
2. Глущенко С.В. Гипергомоцистеинемия как предиктор развития и прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени // Проблеми безперервної медичної освiти та науки. 2014. № 2. С. 89-92.
3. Костюченко Г.И. Гипергомоцистеинемия: клиническое значение, возрастные особенности, диагностика и коррекция // Клин. геронтология. 2007. Т. 13. № 4. С. 32-40.
4. Гречанина Е.Я. Метионин - незаменимая аминокислота // Клiнiчна генетика I перинатальна дiагностика. 2013. № 1 (2). С. 19-35.
5. Пат. 2414755. Способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции / С.Г. Емельянов, М.В. Корокин, М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Юго-Западный государственный университет"; № 2009138369/14; опубл. 20.03.2011, Бюл. № 8. 4 с.
6. Arun K., Lijo J., Shuvadeep M. et al. Converging evidence of mitochondrial dysfunction in a yeast model of homocysteine metabolism imbalance // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, N 24. P. 21779-21795.
7. Puddu P., Puddu G. M., Cravero E. et al. The emerging role of cardiovascular risk factor-induced mitochondrial dysfunction in atherogenesis // J. Biomed. Sci. 2009. Vol. 16, N 1. P. 112-118.
8. Martinez-Ruiz A., Cadenas S., Lamas S. Nitric oxide signaling: classical, less classical, and nonclassical mechanisms // Free Radic. Biol. Med. 2011. Vol. 51, Is. 1. P. 17-29.
9. Медведев Д.В., Звягина В.И., Фомина М.А. Способ моделирования тяжелой формы гипергомоцистеинемии у крыс // Рос. медико-биологический вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2014. № 4. С. 42-46.
10. Колесник М.Ю., Беленичев И.Ф., Дзяк Г.В. и др. Особенности функционирования митохондрий миокарда у крыс со спонтанной гипертензией (SHR) на фоне экспериментального сахарного диабета и атеросклероза // Запорож. мед. журн. 2012. № 2 (71). С. 26-30.
11. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. Л. : Изд-во Ленинград. ун-та, 1982. 327 с.
12. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке // Клин. лаб. диагностика. 2005. № 6. С. 15-18.
13. Биоэнергетика клетки. Химия патологических процессов / под ред. В.Ю. Сереброва, Г.А. Сухановой. Томск : Сибир. гос. мед. ун-т, 2008. С. 79-82.
14. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. мед. химии. 1990. № 2. С. 88-91.
15. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб. : Медицинская пресса, 2006. С. 276-282.
16. Пат. 2524667 РФ, МПК 11, G01N33/52. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях / заявители: Фомина М.А., Абаленихина Ю.В., Фомина Н.В., Терентьев А.А.; патентообладатель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU); № 2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014; Бюл. № 21. 9 с.
17. Wink D. A., Miranda K. M., Espey M. G. et al. Mechanisms of the antioxidant effects of nitric oxide // Antioxidants Redox Signaling. 2001. Vol. 3, N 2. P. 203-213.