Жирные кислоты (ЖК), активно участвующие в жизнедеятельности организма, играют большую роль в развитии многих заболеваний, в частности атеросклероза, сахарного диабета, стеатоза печени и др. В настоящее время на основании многих исследований установлено, что ЖК разной степени насыщенности (насыщенные - НЖК, полиненасыщенные - ПНЖК) являются основными компонентами клеточных мембран и предшественниками молекулярных медиаторов - эйкозаноидов [1-5, 10]. Состав ЖК пищи способен существенно изменять жирнокислотный профиль полярных и нейтральных липидов, активность ферментов синтеза насыщенных НЖК и ПНЖК, эйкозаноидов [3, 4, 10, 12]. Регулирующее действие ЖК пищи на метаболизм липидов реализуется на уровне модуляции экспрессии особых факторов транскрипции, участвующих в метаболизме липидов - PGC-1β (peroxisome-proliferator-activated receptorgamma co activator 1 beta), HNF4 (hepatocyte nuclear factor 4), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), SREBP1 (sterol regulatory element-binding protein) [13, 14].
Однако сегодня подвергается сомнению связь между увеличенным потреблением НЖК и развитием гиперлипидемии, атеросклероза и ишемической болезни сердца. В некоторых работах показано, что потребление триацилглицеридов (ТГ), богатых пальмитиновой кислотой, не влияет на уровень холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) и общего холестерина (ОХС) в крови [11]. Есть данные, что стеариновая кислота снижает уровень холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) [10]. В то же время установлено, что увеличение потребления НЖК, наблюдающееся при депрессии апоВ- и Е-рецепторов ЛПНП, способствует накоплению ОХС и ХС ЛПНП, что приводит к развитию гиперхолестеринемии [4]. Одновременно в опытах на крысах с жировым поражением печени обнаружено, что введение в диету животных НЖК предотвращает некроз тканей и воспаление [14]. Дискуссионными остаются вопросы об особенностях липидного метаболизма при высокожировой нагрузке и механизмах действия НЖК пищи в модуляции состава липидов сыворотки и плазмы крови, а также клеточных мембран.
Целью настоящего исследования было выявление характера перераспределения состава ЖК между липидными фракциями плазмы и эритроцитов крови у крыс в условиях длительной высокожировой нагрузки.
Материал и методы
Исследование проводили на 40 половозрелых белых крысах-самцах Вистар с начальной массой тела 173±5,6 г. Были сформированы 4 группы животных по 10 особей в каждой: контрольная группа - интактные крысы, находившиеся в течение всего эксперимента (30, 60 или 180 сут) на стандартном полноценном рационе и 3 опытные группы - крысы, содержавшиеся на экспериментальном рационе в течение 30 сут (1-я группа), 90 сут (2-я группа) и 180 сут (3-я группа). Экспериментальный рацион был высокожировым и включал топленое говяжье сало (19% от общей массы рациона) и холестерин (ХС, 2% от общей массы рациона) [9]. Умерщвление животных проводили через 30, 90 и 180 сут эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 ЕЕС [8]. Кровь для исследования брали у крыс утром натощак из шейной вены во время декапитации.
Липидный спектр сыворотки крови исследовали на биохимическом анализаторе FP-901 фирмы "Labsistems" (Финляндия). Определяли уровень ОХС, ТГ, ХС ЛПВП. Концентрацию ХС ЛПНП и холестерина липопротеидов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) рассчитывали по формуле Фридвальда:
ХС ЛПНП = ОХС - ХС ЛПОНП - ХС ЛПВП, ХС ЛПОНП = ТГ/2,2.
Результаты выражали в моль/л. Рассчитывали индекс (коэффициент) атерогенности (ИА) по формуле: ИА = (ОХС - ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП [1].
Нейтральные и полярные липиды плазмы крови разделяли методом одномерной микротонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с закрепленным слоем силикагеля. В качестве системы растворителей использовали смесь гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (80:20:1, по объему). Зоны силикагеля, содержащие фосфолипиды (ФЛ), ТГ (триацилглицерины) и эфиры стеринов (ЭС), собирали шпателем, липиды элюировали смесью хлороформ-метанол (1:1). Количественное содержание отдельных фракций определяли в процентах от общей суммы липидов [7]. Экстракцию липидов из эритроцитов производили методом Блайя-Дайера [6]. Для разделения полярных липидов использовали двухмерную микротонкослойную ТСХ на стеклянных пластинках 66 см с закрепленным слоем силикагеля и гипса. Количественный анализ отдельных классов ФЛ после ТСХ проводили по методу В.Е. Васьковского и соавт. [17]. Содержание каждого компонента представляли в процентах от общей суммы ФЛ. Метиловые эфиры ЖК липидов эритроцитов и плазмы крови получали по методу Карро-Дюбак [7] и анализировали на газожидкостном хроматографе Shimadzu GC-17A (Япония) с пламенно-ионизационным детектором и системой обработки данных Chomatopak - CR3А. Идентификацию пиков проводили с использованием стандартных смесей ЖК и по значениям эквивалентной длины цепи [16]. Результаты выражали в процентах от общей суммы ЖК.
Таблица 1. Липиды сыворотки крови и фосфолипиды эритроцитов крыс при содержании их на высокожировом рационе (M+/-m)
Для статистического анализа полученных данных использовали прикладную программу "Statistiсa", версия 6,1 (серия 1203С для Windows). Статистическую значимость различий средних величин определяли с помощью критерия Стьюдента после проверки на нормальность распределения.
Результаты и обсуждение
Результаты анализа липидов сыворотки крови представлены в табл. 1. Показано, что через 30 сут жировой нагрузки в крови крыс повышались уровни ОХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП и уменьшалось содержание ХС ЛПВП (р<0,001 для всех показателей по сравнению с контрольной группой), что закономерно приводит к повышению индекса атерогенности. На 90-е сутки жировой нагрузки динамика показателей липидного обмена в сыворотке крови имела несколько иную направленность. Выявлено снижение концентрации ТГ на 59% (р<0,001) и ХС ЛПОНП на 58% (р<0,001), повышение уровня ХС ЛПНП и индекса атерогенности в 3,1 (р<0,001) и в 2 раза (р<0,05) соответственно. Концентрации ОХС и ХС ЛПВП не отличались от наблюдавшейся у животных контрольной группы. Через 180 сут нахождения на экспериментальном высокожировом рационе в сыворотке крови крыс повышалось содержание ОХС, ХС ЛПНП (р<0,001) и снижался уровень ХС ЛПОНП (р<0,001) по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе.
Полученные данные свидетельствуют о том, что НЖК пищи проявляют ярко выраженный гиперлипидемический эффект только на 30-е сутки эксперимента. Пролонгирование высокожировой диеты до 90 и 180 сут не приводит к накоплению ТГ и ХС ЛПОНП в крови и не влияет на содержание ХС ЛПВП. Подобные изменения в уровне атерогенных липопротеидов сыворотки крови, наблюдаемые на 90-е и 180-е сутки эксперимента, могут быть следствием нарушения синтеза и сборки ЛПОНП в печени [11]. Поскольку ЛПОНП являются активными транспортерами ТГ, при недостаточном их синтезе происходит накопление ТГ в различных паренхиматозных тканях, в том числе жировой и печеночной, что приводит к снижению концентраций ТГ и ХС ЛПОНП в крови. Концентрация же ХС ЛПНП в крови определяется активностью образования его из ХС ЛПОНП и эффективностью захвата из потока крови ХС ЛПНП апоВ-100 рецепторами гематогенных клеток. Механизмами, способствующими накоплению ХС ЛПНП в крови и межклеточной жидкости, могут быть блокада активного поглощения его клетками (путем апоВ-100 рецепторного эндоцитоза), а также ингибирование процесса гидролиза ТГ, входящих в состав ЛПОНП [4]. Маркером таких нарушений является увеличение концентрации ХС ЛПНП в крови. Поскольку основная роль ЛПНП состоит в переносе к клеткам ПНЖК в форме неполярных эфиров ХС, эндогенная блокада их активного поглощения клетками приводит к клеточному дефициту ПНЖК. Прямым доказательством такого нарушения должно стать повышение уровня циркулирующих в крови липидов, богатых ненасыщенными ЖК, при одновременном дефиците последних в мембранах клеток.
Изучение состава ЖК полярных и нейтральных липидов плазмы и эритроцитов крови крыс подтвердило высказанную гипотезу. Качественный состав ЖК липидов эритроцитов и плазмы крови крыс был представлен компонентами с длиной углеродной цепи от С10 до С24 (как четных, так и нечетных) нормального и изостроения, насыщенных, моноеновых и полиеновых. В табл. 2 представлены ЖК, наиболее важные в физиологическом плане.
Таблица 2. Жирные кислоты эритроцитов и липидных фракций плазмы крови крыс при высокожировой нагрузке (Mm)
Показано, что на 30-е сутки содержания крыс на высокожировом экспериментальном рационе в липидных фракциях плазмы крови увеличивается уровень насыщенных ЖК - миристиновой (14:0, р<0,05), пентадекановой (15:0, р<0,001) в пуле ФЛ, ТГ и ЭС (см. табл. 2). Доля стеариновой кислоты (18:0) по сравнению с таковой у животных контрольной группы была, напротив, понижена в ТГ (р<0,05) и повышена в ФЛ (р<0,05). Достоверное уменьшение содержания линолевой кислоты (18:2n6) выявлено в ТГ. Во фракциях ТГ и ФЛ на фоне повышенного содержания эйкозапентаеновой кислоты (20:5n3) наблюдался низкий уровень кислоты Мида (20:3n9). Истощение пула арахидоновой кислоты (20:4n6) обнаруживалось во всех исследуемых липидных фракциях плазмы крови. Динамика состава аналогичных кислот в эритроцитах на 30-е сутки эксперимента характеризовалась увеличением доли 14:0, 18:0 НЖК и арахидоновой ПНЖК на фоне снижения содержания линолевой кислоты [15].
Через 30 сут эксперимента выявлено накопление в мембранах эритроцитов фосфатидилсерина (ФС), фосфатидилэтаноламина (ФЭ) (р<0,001) и снижение доли фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилхолина (ФХ) (р<0,001). Дефицит фосфолипидов, формирующих наружный слой липидного каркаса мембраны - ФИ и ФХ, свидетельствует об активации специфичных фосфолипаз, являющихся начальным ферментативным звеном синтеза эйкозаноидов. Снижение уровня ФХ может быть причиной увеличения активности лецитинхолестеринацилтрансферазы (ЛХАТ), осуществляющей перенос ЖК от ФХ к холестерину [15].
На 90-е сутки эксперимента в пуле ЖК, этерифицированых в ФЛ и ЭС, снижалось содержание 15:0 и 20:3n9 (р<0,001). Похожая динамика состава ЖК выявлена и в липидах эритроцитов. Уровень 18:0 ЖК увеличивался во фракции ФС, ТГ плазмы и эритроцитах крови. Дефицит арахидоновой кислоты идентифицировался в ЭС плазмы крови, тогда как в клетках крови увеличивалась доля арахидоновой кислоты (20:4n6, р<0,001), в том числе и ее предшественника - дигомо-γ-линоленовой кислоты (20:3n6, р<0,01). Для линоленовой и дигомо-γ-линоленовой кислот в плазме крови достоверных изменений по сравнению с контролем не обнаружено. В эритроцитах выявлено падение уровня физиологически важной эйкозапентаеновой кислоты (20:5n3, р<0,05) на фоне повышения ее содержания в ЭС и ТГ плазмы крови. Следовательно, вектор изменений состава биологически активных ПНЖК липидов плазмы и эритроцитов крови на 90-е сутки эксперимента характеризовался увеличением в плазме крови содержания эйкозапентаеновой и олеиновой кислот с одновременным дефицитом этих ЖК в клеточных мембранах. Одновременно наблюдалось увеличение доли стеариновой НЖК в плазме крови и гематогенных клетках.
Изменения фосфолипидного состава эритроцитов крыс, находящихся 90 сут на высокожировом рационе, имели ту же направленность, что и у крыс 1-й группы. Исключением было только повышение уровня ФИ (р<0,05) относительно такового в 1-й группе. Последнее возможно лишь при достаточной активности ферментативных систем антиоксидантной защиты, которые предотвращают окисление высоконенасыщенных жирных кислот, этерифицированных в ФИ [12]. Выявленный факт можно расценивать как компенсаторную реакцию клетки в условии алиментарной жировой нагрузки.
Жирнокислотный профиль липидов плазмы крови через 180 сут содержания животных на высокожировом рационе характеризовался уменьшением доли 14:0, 15:0 в нейтральных и полярных липидах. Пул полиеновых кислот был обеднен 18:2n6 кислотой (кроме ФЛ), недостаток которой компенсировался увеличением содержания 18:1n9. Дефицит арахидоновой кислоты обнаруживался в ЭС. Уровень эйкозапентаеновой кислоты повышался в триацилглицериновой фракции липидов. Это, парадоксальное на первый взгляд, явление четко вписывается в концепцию нарушения транспорта ЖК, оно обусловлено изменением рецепторного захвата клетками липопротеидов, богатых эссенциальными ПНЖК, с последующим дефицитом этих кислот в цитоплазматических мембранах и компенсаторной активацией пассивного транспорта неэстерифицированных НЖК. Действительно, модификация состава ЖК эритроцитов на 180-е сутки жировой нагрузки характеризовалась повышением уровней насыщенных ЖК (14:0, 16:0, 18:0), снижением содержания линолевой (18:2n6) и эйкозапентаеновой (20:5n3) кислот. Маркером клеточного дефицита кислот ПНЖК семейств ω-6 и ω-3 стало увеличение в мембранах эритроцитов кислоты Мида.
На 180-е сутки эксперимента в составе ФЛ эритроцитов идентифицировано увеличение доли ФС (р<0,001) и сфингомиелина (СМ) на 23% (р<0,001) по сравнению контрольной группой. В силу высокой насыщенности СМ в кластеры, образуемые им фосфолипидом в мембране клеток, встраивается большое количество ХС, что влечет за собой уменьшение проницаемости клеточной мембраны и нарушение процессов активного транспорта ЖК [4, 5]. С одной стороны, это свидетельствует о структурно-функциональной несостоятельности клеточной мембраны, а с другой - о временном увеличении содержания СМ, необходимого для сохранения целостности мембраны и поддержания нормального ее строения. Ценой этой компенсации является блокада рецепторопосредованного трансфера ЖК в составе ЛПНП, приводящая к дефициту ПНЖК в мембранах крови [4].
Известно, что для синтеза ТГ, ФЛ и ЭС в организме существуют 2 основных пула ЖК - плазменных свободных и синтезирующихся de novo в печени [13]. Поскольку в высокожировом рационе наблюдается дефицит физиологически важных ПНЖК, в организме включается компенсаторный синтез эндогенных ЖК. Происходит активация экспрессии генов синтеза ферментов элонгаз и десатураз: это находит подтверждение в публикациях зарубежных коллег [14]. Влияние липидов пищи на экспрессию генов представляет собой адаптивный ответ на изменение количества и типа поглощаемого жира. Прямое влияние НЖК обусловлено взаимодействием с факторами транскрипции. Высокожировая диета, содержащая большое количество насыщенных жиров (14:0, 16:0, 18:0), индуцирует экспрессию липогенетических генов PGC-1β, SREBP 1c. Эти гены ответственны за синтез ЖК de novo и их элонгацию, но при этом ингибируют сборку ТГ-ЛПОНП через подавление синтеза мРНК апо-белков [10, 14].
Таким образом, несбалансированное питание, богатое ХС и НЖК способствует компенсаторному синтезу полиеновых кислот, что нашло свое подтверждение в увеличении пула олеиновой, дигомо-γ-линоленовой, эйкозапентаеновой и арахидоновой кислот в липидах плазмы крови. В то же время, возможно, вследствие нарушения активного апоВ-100 рецепторного транспорта ЖК в составе ЛПНП синтезированные в печени de novo полиеновые кислоты не захватываются клетками периферических органов. В пользу этого факта свидетельствует выявленный в эксперименте дефицит ПНЖК семейств ω-3 и ω-6 в эритроцитах при одновременном накоплении их в липидных фракциях плазмы крови. Маркером рецепторного нарушения блокады липопротеидов, транспортирующих в организме полиеновые ЖК от печени к другим органам, является увеличение содержания ХС ЛПНП в сыворотке. Полученные данные позволяют расширить представление о роли алиментарных факторов в физиологии и патофизиологии клетки, в модуляции метаболизма липидов. Выявленные в эксперименте особенности метаболизма ЖК могут стать основой для понимания механизмов развития многих видов алиментарно-зависимой патологии, в том числе атеросклероза, метаболического синдрома, сахарного диабета.
Литература
1. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды. - СПб.: Питер Ком, 1999. - 512 с.
2. Новгородцева Т.П., Караман Ю.К., Антонюк М.В. и др. // Клин. мед. - 2009. - № 5. - С. 33-37.
3. Рыжинков В.Е. // Вопр. питания. - 2002. - № 3. - С. 40-45.
4. Титов В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот. Биологические основы теории атерогенеза. - М.: Алтус, 2002. - 495 с.
5. Эндакова Э.А., Новгородцева Т.П., Светашев В.И. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях. - Владивосток: Дальнаука, 2002. - 296 с.
6. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - Vol. 37, N 8. - P. 911-917.
7. Carreau J.P., Duback J.P. // J. Chromatogr. - 1978. - Vol. 151. - P. 3 8 4 - 3 9 0 .
8. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. - Strasburg: Council of Europe, 1986. - 51 p.
9. Fan J. // World J. Gastroenterol. - 2003. - Vol. 9(9). - P. 2 0 4 5 - 2 0 4 9 .
10. Fernandez M.L., West K.L. // J. Nutr. - 2005. - Vol. 135. - 2075-2078.
11. Gibbons G.F., Wiggins D., Brown A.M., Hebbachi A.M. // Biochem. Soc. Trans. - 2004. - Vol. 32. - P. 59-64.
12. Hu F.B., Manson J.E., Willett W.C. // J. Am. Coll. Nutr. - 2001. - Vol. 20. - P. 5-19.
13. Jung H.R., Turner S.M., Neese R.A. et al. // Biochem. J. - 1999. - Vol. 343(2). - P. 473-478.
14. Oosterveer M.H., van Dijk T.H., Tietge U.J. et al. // PLoS One. - 2009. - Vol. 4 (6). - Р. 60-66. 15. Phinney S.D., Odin R.S., Johnson S.B. et al. // Am. J. Clin. Nutr. - 1990. - Vol. 51. - 385-392.
16. Stransky K., Jursik T., Vitek A. et al.. // J. High Re s . Chr oma to gr. - 1992. - Vol. 15. - P. 730-740.
17. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.X., Vasendin J.M. // J. Chromatogr. - 1975. - Vol. 111. - P. 129-141.