Антибиотикорезистентность является растущей международной проблемой для общественного здравоохранения. Антибиотики широко применяются не только в медицине, но и в животноводстве для лечения болезней, а также в целях профилактики и для стимулирования роста. Неконтролируемое применение ветеринарных лекарственных средств с противомикробным действием способствует появлению резистентных штаммов и распространению генов антибиотикоустойчивости, которые могут передаваться патогенам. Трансфер антибиотикорезистентных микроорганизмов обычно происходит при употреблении пищевых продуктов, равным образом может осуществляться при непосредственном контакте с животными. Формирование новых возбудителей в объектах окружающей среды путем трансмиссивной антибиотикорезистентности у населяющих их микроорганизмов является угрозой для здоровья населения.
До сих пор в России при определении допустимых суточных доз и обосновании нормируемых величин остатков антибиотиков в пище используются подходы, базирующиеся на изучении минимальных, не оказывающих токсического эффекта концентраций или отсутствии фенотипических признаков селекции резистентных кишечных бактерий. Антибиотики тетрациклиновой группы применяются в наибольшем объеме для профилактики болезней сельскохозяйственных животных. Велика вероятность негативного воздействия их остаточных количеств на микробные экосистемы живых организмов и объектов среды обитания, в том числе пищевых продуктов.
Отсутствие данных о формировании и распространении антибиотикорезистентности в объектах окружающей среды не позволяет подойти к вопросам переоценки принципов гигиенического нормирования остаточных количеств антимикробных веществ в пищевых продуктах. Для научного обоснования указанных принципов и ограничения рисков для потребителей, связанных с возможностью передачи генов антибиотикорезистентности к человеку через потребление пищи, необходимо налаживать контроль выполнения правил использования антибиотиков в сельском хозяйстве, а также мониторинг распространения резистентности не только среди клинических изолятов, но и среди изолятов, выделенных из объектов окружающей среды, включая пищевые продукты.
Цель работы - изучить фенотипические характеристики антибиотикочувствительности штаммов семейства энтеробактерий и энтерококков, выделенных из доброкачественных пищевых продуктов, присутствующих на потребительском рынке Московского региона.
Материал и методы
Исследуемые образцы
Для повышения вероятности выделения микроорганизмов, присущих естественной микрофлоре продуктивных животных, были использованы образцы сырых пищевых продуктов, приобретенных в розничных торговых предприятиях Москвы, в том числе мясо и субпродукты скота и птицы сырые охлажденные и замороженные, сырое молоко. В качестве объектов исследования также использовали продукты, подвергнутые минимальной тепловой обработке (творог, сметана и другие продукты из пастеризованного молока). Сведения о применении антибиотиков при их производстве у продавцов отсутствовали. При выборе объектов исследования учитывали опубликованные данные [1-3] о высоком потенциале приобретенной резистентности, которым обладают представители кишечных бактерий человека и животных из семейства Enterobacteriaceae и рода Enterococcus spp. (являющиеся также распространенными контаминантами пищи) в силу присущих им специализированных механизмов генного транcфера (плазмиды и мобильные генные элементы).
Выделение и идентификация изолятов
Подготавливали пробы к анализу по ГОСТ ISO 7218-2011 [4]. Enterobacteriaceae из пищевых продуктов выделяли путем бактериологического посева на среды Эндо и Кесслер с глюкозой [5]. Первичную идентификацию выделенных культур энтеробактерий проводили с использованием окраски по Граму, теста на наличие оксидазы, а также по способности утилизировать цитраты в качестве единственного источника углеводов. Видовую принадлежность штаммов энтеробактерий определяли с помощью тест-наборов "API 20 E", "API 10 S" и "API RAPID 20E" ("BioMerieux", Франция).
Энтерококки выделяли путем прямого посева на эскулин-канамицин-азидный агар. Идентификацию энтерококков проводили по росту и морфологии колоний на желчно-эскулиновом агаре и с помощью тест-наборов "API 20 STREP" ("BioMerieux", Франция). При необходимости использовали дополнительные тесты Шермена для подтверждения принадлежности к Enterococcus spp. [6].
Антибиотикочувствительность культур
У штаммов энтеробактерий и энтерококков определяли профиль чувствительности к антимикробным препаратам 9 фармакологических групп (β-лактамные антибиотики, цефалоспорины, фторхинолоны, хинолоны, аминогликозиды, гликопептиды, тетрациклины, нитрофураны) диско-диффузионным методом (ДДМ) на агаре Мюллера-Хинтона с помощью диагностических дисков ("Oxoid", Великобритания).
В работе были использованы диски с ампициллином (10 мкг), имипенемом (10 мкг), цефотаксимом (30 мкг), цефтриаксоном (30 мкг), ципрофлоксацином (5 мкг), левофлоксацином (5 мкг), налидиксовой кислотой (30 мкг), амикацином (30 мкг), гентамицином (10 мкг), ванкомицином (30 мкг), тетрациклином (30 мкг), доксициклином (30 мкг), хлорамфениколом (30 мкг), нитрофурантоином (300 мкг), линезолидом (30 мкг). Оценку чувствительности штаммов семейства Enterobacteriaceae и Enterococcus spp. проводили в соответствии с рекомендациями EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) [7-9], а также МУК 4.2.1890-04 и ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 [10, 11].
Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) проводили с помощью стрипов "Е-тест" (HiComb MIC Test "HiМedia", Индия) в диапазоне двукратно убывающих концентраций тетрациклина (от 240 до 0,01 мкг), используя в качестве контроля чувствительные культуры E. coli ATCC № 25922 и E. faecalis ATCC № 29212 [7, 9, 10].
Результаты и обсуждение
Всего изучено 68 штаммов - 46 энтеробактерий и 22 энтерококков, изолированных из пищевых продуктов. Характеристики штаммов (источники выделения, видовая принадлежность, частота обнаружения, частота в популяции, количество в 1 г продукта) представлены в табл. 1 и 2.
)
Среди выделенных из пищевых продуктов энтеробактерий и энтерококков встречаемость видов, обладающих высоким потенциалом трансмиссивной антибиотикорезистентности, а именно E. coli и E. faecium, была достаточно высокой и составляла 14-57 и 29-50% соответственно. Молочные продукты из пастеризованного молока и птицепродукты являлись наиболее активными источниками E. coli: ими было загрязнено больше половины образцов в изученных выборках (57 и 89% случаев), кроме того, бактерии данного вида превалировали в общей сумме изолятов энтеробактерий (см. табл. 1). Превалирование E. coli среди других видов энтеробактерий, контаминирующих молочные продукты из сырого и пастеризованного молока, также отмечалось ранее [12]. Частота контаминации мясо- и птицепродуктов E. Faecium достигала 67% (табл. 2).
При этом наибольшие уровни обсемененности E. coli и E. Faecium также регистрировались в молоко- и птицепродуктах. Так, максимальные значения содержания E. coli обнаружены в твороге и в фарше индейки (6,29 и 6,48 lg КОЕ/г соответственно); E. Faecium - в филе индейки и в твороге (3,95 и 6,56 lg КОЕ/г соответственно). При этом в птицепродуктах обнаруживали более широкий видовой спектр контаминантов из числа энтеробактерий и энтерококков, чем в молочных продуктах. Так, из 11 образцов мяса и субпродуктов птицы было выделено 18 штаммов энтеробактерий, тогда как из 21 пробы молока - 21 штамм; из 9 образцов птицепродуктов - 11 штаммов энтерококков, а из 12 образцов молока - 7 штаммов энтерококков.
Удельный вес E. coli и E. Faecium в числе штаммов энтеробактерий и энтерококков, изолированных из мясопродуктов скота, был ниже и составлял 14 и 50% (на группу продуктов по 1-2 изолята), максимальная плотность популяций бактерий этих видов в мясных образцах также была значимо ниже, чем в молоко- и птицепродуктах: 4,48 lg КОЕ/г для E. coli и 5,66 lg КОЕ/г для E. faecium. Чаще мясо и субпродукты скота обсеменяли Citrobacter spp.
Все идентифицированные изоляты подвергнуты скринингу антибиотикочувствительности к клинически значимым препаратам, используемым в современной медицине и ветеринарии. Результаты анализа энтеробактерий представлены на рис. 1.
)
Как видно из рис. 1, среди молочных и мясных изолятов наиболее распространены штаммы, устойчивые и промежуточно устойчивые к антибиотикам широкого спектра действия - доксициклину, тетрациклину, ампициллину, амикацину. Среди этой группы штаммов лидировали штаммы, устойчивые к антибиотикам тетрациклиновой группы (к доксициклину - 42 и 69%, к тетрациклину - 21 и 38% обнаружения среди молочных и мясных изолятов соответственно). Штаммы, не чувствительные к хлорамфениколу, нитрофурантоину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, налидиксовой кислоте, встречались реже - с частотой 11 и 7; 5 и 15; 5 и 13; 5 и 15; 5 и 15% соответственно. Не выявлено штаммов, устойчивых к современным β-лактамным антибиотикам - имипенему, цефтриаксону, цефотаксиму в обеих группах изолятов.
Результаты анализа энтерококков представлены на рис. 2. Установлено, что все культуры энтерококков в определенной степени сохраняют чувствительность к ампициллину и имипенему (100%), левофлоксацину (от 80 до 95%), хлорамфениколу (90-100%). Отмечена высокая частота культур с промежуточной резистентностью к ципрофлоксацину (80-90%), ванкомицину (30% в молочных, 80% в мясных продуктах), частота резистентности к нитрофурантоину у молочных изолятов 30%. Здесь, как и в случае энтеробактерий, наибольший процент всех изолированных культур проявляет устойчивость к антибиотикам тетрациклиновой группы - доксициклину (30%) и тетрациклину (30-40%). Все культуры, имеющие промежуточную резистентность к доксициклину, были чувствительны к тетрациклину.
)
Важно отметить, что среди изолятов энтеробактерий обнаружено 8 штаммов (17,4% от изученной популяции), резистентных к 3 и более антибиотикам, а 2 штамма одновременно проявили устойчивость к 6 и более антибиотикам. Так, Klebsiella pneumoniae, выделенная из творога, была устойчива к ампициллину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, налидиксовой кислоте, гентамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, нитрофурантоину; а E. coli из фарша индейки - к ампициллину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, налидиксовой кислоте, гентамицину, тетрациклину.
Частота встречаемости проявляющих резистентность штаммов была сопоставлена отдельно среди источников выделения. Эти данные показаны на рис. 3.
Как оказалось, встречаемость энтерококков, устойчивых к антибиотикам тетрациклиновой группы, среди молочных и мясных изолятов была почти одинаковой. Тогда как штаммов, устойчивых к ципрофлоксацину, гентамицину среди молочных изолятов, и, наоборот, к нитрофурантоину среди мясных, не обнаруживалось.
У мясных изолятов энтеробактерий самый высокий уровень резистентности выявлен к доксициклину (73%), тетрациклину (38%), ампициллину (53%); у молочных - к доксициклину (42%) ампициллину (27%), тетрациклину (21%). Скорее всего, такая ситуация отражает различия в применении определенных антимикробных средств в ветеринарной практике для лечения различных заболеваний у лактирующего и мясного скота.
В то же время высокая частота встречаемости резистентных штаммов к тетрациклинам может свидетельствовать как об их широчайшем применении в сельском хозяйстве, так и о возможном легко воспроизводимом механизме распространения данной резистентности по сравнению с другими антибиотиками.
В связи с указанным представляло интерес охарактеризовать штаммы, устойчивые к антибиотикам тетрациклиновой группы, по уровню проявления резистентности. Для этого культуры, резистентные и промежуточно резистентные к тетрациклину по данным ДДМ, проанализированы в тестес МИК (табл. 3). Интерпретация результатов проводилась в соответствии с CLSI (2014) и МУК 1980-04: штаммы семейства энтеробактерий с уровнем МИК≥4 мг/л считали промежуточно устойчивыми, с уровнем МИК≥8 мг/л - резистентными. Для энтерококков использованное пограничное значение резистентности составляло ≥4мг/л [7, 9, 13].
)
Как показало количественное тестирование, среди отобранных изолятов из молока превалировали промежуточно устойчивые к тетрациклину штаммы с уровнем МИК до 5 мг/л. В изученной выборке таких было 5 из 11 (45,5%). Из числа энтеробактерий один штамм был высокорезистентным к тетрациклину, остальные - промежуточно устойчивые. Это меньше, чем показал скрининг, поскольку метод МИК для ряда препаратов обладает большей разрешающей способностью. Тем не менее озабоченность вызывает то, что все резистентные штаммы были выделены из готовых к употреблению пастеризованных молокопродуктов, поэтому они могут попадать в пищеварительный тракт в живом виде.
Отмечено также, что среди молочных изолятов энтеробактерий резистентность к тетрациклину чаще фиксировалась у цитратассимилирующих представителей - клебсиелл и энтеробактеров (4 штамма из 5), чем у E. coli (1 из 12), а у мясных штаммов - среди энтерококков. Так, к роду клебсиелл принадлежали единственный высокорезистентный среди молочных изолятов K. Pneumonia из сметаны (МИК 60 мг/л), а также полирезистентный штамм K. pneumoniae (устойчив против 8 антибиотиков), по уровню МИК к тетрациклину (5 мг/л) являющийся промежуточно устойчивым. Для объяснения такой тенденции, безусловно, необходимо изучение большего объема выборки.
Среди исследованных ДДМ энтеробактерий, изолированных из мяса и птицы, высоко резистентными оказалось 2 штамма (12,5%) - E. coli из фарша индейки (полирезистентный к 8 антибиотикам) и штамм E. coli из печени скота, значения их МИК составляли 120 и 30 мг/л. Так, МИК для тетрациклина у E. coli в 15 и 4 раза превышала установленное пограничное значение.
Таким образом, показатели частоты резистентности к антибиотикам тетрациклинового ряда варьировали в зависимости от типа пищевых продуктов от 26 до 37,5% среди энтеробактерий, от 17 до 40% среди энтерококков.
В целом эти данные согласуются с результатами изучения резистентности к антибиотикам у штаммов, выделенных в странах Европейского союза из птицы, мяса свиней и крупного рогатого скота (от 11,1 до 56,6%), особенно в случае резистентности к тетрациклинам (от 17,5 до 32,6%) [3].
В то же время они меньше аналогичных показателей, регистрируемых в США, как по частоте, так и по уровням устойчивости. Так, исследования частоты встречаемости E. coli в животном сырье, проведенные в Америке, показали, что более 78, 47 и 41% от E. coli, выделенных соответственно от свиней, кур, индеек, обладали высокой резистентностью к тетрациклину. При этом МИК тетрациклина для 61, 29 и 29% кишечных палочек, изолированных соответственно от свиней, кур и индеек, составлял >233 мг/л [2].
Выводы
1. Частота обнаружения штаммов E. coli и E. faecium, обладающих механизмами для трансмиссивной передачи генного материала, выше в молочных продуктах из пастеризованного молока и птицепродуктах сырых по сравнению с таковой в мясе скота.
2. По данным скрининга профилей чувствительности к 17 современным антимикробным препаратам, среди неклинических изолятов энтеробактерий и энтерококков превалирует устойчивость к антибиотикам тетрациклиновой группы.
3. Различия в устойчивости энтерококков и кишечных палочек молочного и мясного происхождения к антибиотикам различных фармакологических групп, скорее всего, отражают различия в применении этих средств в ветеринарной практике для лечения разных заболеваний у лактирующего и мясного скота.
4. Среди пищевых изолятов семейства Enterobacteriaceae штаммы, обладающие мультирезистентностью, встречаются с частотой 17,4%, в том числе в готовых к употреблению продуктах.
Это свидетельствует о необходимости исследования природы резистентности пищевых штаммов и наличия у них мобильных генных элементов.
Автор выражает благодарность научному руководителю, доктору медицинских наук С.А. Шевелевой за ценные консультации, доктору биологических наук Н.Р. Ефимочкиной - за предоставленные идентифицированные штаммы энтеробактерий.
Литература
1. Sengelov G., Halling-Sorensen B., Aarestrup F.M. Susceptibility of Escherichia coli and Enterococcus faecium isolated from pigs and broiler chickens to tetracycline degradation products and distribution of tetracycline resistance determinants in E. coli from food animals // Vet. Мicrobiol. 2003. Vol. 95, N 1. P. 91-101.
2. Bryan A., Shapir N., Sadowsky M.J. Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse, nonselected, and nonclinical Escherichia coli strains isolated from diverse human and animal sources // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 4. P. 2503-2507.
3. Authority E.F.S. et al. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013 // EFSA J. 2015. Vol. 13, N 1. Article ID 3991.
4. ГОСТ ISO 7218-2011. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям.
5. ГОСТ 32064-2013. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae.
6. ГОСТ 28566-90. Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков.
7. Matuschek E., Brown D.F.J., Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories // Clin. Microbiol. Infect. 2014. Vol. 20, N 4. P. O255-O266.
8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 24th informational supplement. CLSI document M100-S24. Wayne, Pa : CLSI, 2014.
9. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing et al. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 5.0, January. 2015. URL: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_5.0_Breakpoint_Table_01.pdf
10. Семина Н.А. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические рекомендации // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2004. Т. 6, № 4. С. 1890-1904.
11. ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест- системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Ч. 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни.
12. Шевелева С.А. Анализ микробиологического риска как основа для совершенствования системы оценки безопасности и контроля пищевых продуктов : дис. - д-ра мед. наук. М., 2007. 329 с.
13. Feedap E. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance // EFSA J. 2012. Vol. 10, N 6. Article ID 2740.