Influence of the concentrate of red wine polyphenols on glutamate neurotoxicity

• A.Ya. Shurygin
• L.V. Shurygina
• N.M. Ageeva
• Yu.V. Gaponenko
• V.A. Markosov

Abstract

The purpose of the work was to assess the influence of the concentrate of red table wine Saperavi on the cultivated nerve cells exposed to glutamate. The selection of Saperavi as the source of phenolic compounds was not accidenta: this type of grapes in the Krasnodar region has the highest content of them – up to 4–5 g/dm3 and more. Polyphenol concentrate was prepared by pre-distillation of ethanol using vacuum, evaporation of red table wine with a rotary vaporizer, with the subsequent lyophilic drying. By the methods of voltammetry and chemiluminescence an antioxidant activity, and a quantity of antioxidants in the concentrate have been determined. By HPLC it was established that a large group of phenolic compounds with high antioxidant activity was present in the concentrate of polyphenols: procyanidins (total concentration up to 425 mg/dm3), quercetin (21.8–32.6 mg/dm3), gallic acid (124.2–164.7 mg/dm3), resveratrol (6.26–13.22 mg/dm3), catechins (1026–1480 mg/dm3). Effect of red wine Saperavi concentrate on glutamate cytotoxicity was studied in the neuron culture of the cerebellum of 7–9-day-old rats. It was shown that the presence of antioxidants reduced the intensity of chemiluminescence in model systems that generate free radicals. It was established that quenching of chemiluminescence in the system ≪citrate-phosphate-luminol≫ composed 68.43%, and in the system of the yolk lipoproteins – 86.36%. The application of concentrate Saperavi significantly increased the survivability of neurons: at the doses 5, 10 and 30 mcg/ml the number of intact neurons was respectively 38.6; 41.5 and 37.1%. The dose 20 mcg/ml was the most effective – the proportion of live neurons comprised 47.4%. The obtained results can be explained by the high antioxidant activity of concentrate flavonoids, including high content of biologically active compounds – catechins, quercetin, rutin, resveratrol. Thus, the consumption of red wine in quantities that exclude harmful effects, can have a positive impact on human health and the brain in particular.

Keywords:red fault, flavonoids, antioxidants, antioxidant activity, free radicals, glutamate neurotoxicity, oxidation, the chemiluminescence

Известно, что употребление красного вина в строго нормируемых количествах оказывает положительное влияние на здоровье человека [1, 2]. Виноградные вина рекомендуются при упадке сил, малокровии, ослабленным и истощенным больным в стадии выздоровления после тяжелых болезней, ранений или операций, а также для снятия стрессовых ситуаций. Многогранное действие вина на человеческий организм определяется его сложным химическим составом, в том числе наличием комплекса биологически активных веществ - флавоноидов (ресвератрол, фенолкарбоновые кислоты, проантоцианидины), природных антиоксидантов, микроэлементов, витаминов.

По-видимому, многие полезные свойства красного вина обусловлены содержащимися в нем полифенолами с антиоксидантным действием, например флавоноидами [3, 4]. Поскольку развитие многих патологических процессов в организме связано с гиперпродукцией свободных радикалов, именно способность нейтрализовать эти активные кислородные метаболиты играет крайне важную роль в процессе лечения. Для фенольных соединений установлена способность нейтрализовать радикалы кислорода [5, 6].

Концентрация и качественный состав флавоноидов, а также специфика их действия обусловливаются технологией производства вина. Как показали исследования, высокая концентрация сахаров в вине, по-видимому, может свести на нет многие его положительные свойства. Так, красный портвейн (с массовой концентрацией сахаров 70 г/дм3), содержащий флавоноиды в количестве, сходном с красным столовым вином, в отличие от последнего не способен защитить нейроны гиппокампа от повреждения, вызванного этанолом. Как считают исследователи, эти отличия могут быть связаны не только с видом содержащихся в портвейне флавоноидов, но и с большим содержанием в нем сахаров, которые обладают мощным проокислительным эффектом [7]. В исследованиях, проведенных на крысах, показано, что применение флавоноидов, входящих в состав красного столового вина, предотвращает накопление липофусцина в нейронах животных, получавших алкоголь [8], что свидетельствует об антиоксидантном действии флавоноидов красного вина.

Известно, что гибель нейронов при таких патологических состояниях, как ишемия или гипоксия, связана с накоплением в синаптическом пространстве избытка глутамата. В условиях продолжительной активации глутаматом NMDA-рецепторов и энергетического дефицита внутриклеточное депо неспособно аккумулировать поступающий в клетку кальций, что приводит к резкому повышению его концентрации в цитоплазме [9]. В этих условиях возрастает активность кальций-зависимых ферментов (протеазы, фосфолипазы), которые начинают разрушать клетку. Ситуация усугубляется и возрастающим количеством свободных радикалов, которые могут непосредственно повреждать липидный слой мембраны и повышать доступность содержащихся в ней ненасыщенных жирных кислот для липолитических ферментов. Все эти процессы приводят к отсроченной гибели нейронов. Необходимо отметить, что, например, при инсульте именно нейроны, находящиеся в зоне так называемой полутени и гибнущие в течение первых часов после инсульта, можно спасти, значительно снизив последствия данной патологии. Возрастание свободнорадикального окисления наблюдается при различных видах стресса, что также повреждает нейроны и может приводить к гибели.

В этой связи представляет интерес исследование влияния веществ, содержащихся в красном вине, на гибель нервных клеток. Ранее нами было установлено защитное действие различных препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, при глутаматной нейротоксичности [9, 10].

Цель работы - оценить влияние концентрата красного столового вина Саперави на культивируемые нервные клетки, подвергнутые воздействию глутамата. Выбор Саперави в качестве источника фенольных соединений не случаен: этот сорт винограда в Краснодарском крае обладает наибольшим технологическим запасом фенольных соединений - до 4-5 г/дм3 и более [11].

Материал и методы

Концентрат красного столового вина Саперави был получен путем предварительной отгонки этилового спирта с применением вакуума, препятствующего разрушению фенольных соединений. Кроме того, была обеспечена герметичность, в связи с чем кислород не поступал к компонентам вина, сохраняя их в неокисленном виде. Упаривание до половины первоначального объема проводили также под вакуумом на ротационном испарителе с последующей лиофильной сушкой. В дальнейших экспериментах использовали водные растворы полученного концентрата.

Качественный и количественный состав полифенолов в концентрате определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы "Agilent 1100" ("Agilent Technologies", США) с диодно-матричным детектором.

Антиоксидантную активность концентрата определяли вольтамперометрически с применением прибора "Цвет-Яуза" (НПО "Химавтоматика", РФ) [12]. Антиоксидантные свойства концентрата изучали с использованием модельных систем, генерирующих свободные радикалы: система "цитрат-фосфат-люминол" (ЦФЛ) и система липопротеидов желтка яиц (ЖЛП). Система ЦФЛ состояла из цитрата натрия (4 мМ), фосфатного буфера (105 мМ КСl, 20 мМ КН2Р04, рН 7,45), люминола (10 мМ). В данной модели окисление ионов железа в присутствии ортофосфата и цитрата сопровождается образованием радикалов, при этом возникает хемилюминесценция (ХЛ), избирательно усиливающаяся люминолом, которая подавляется в присутствии антиоксидантов [13]. Система ЖЛП представляла собой желток куриного яйца, разведенный фосфатным буфером. Суспензия ЖЛП как модельная система отличается от других липид-содержащих систем доступностью получения, высокой стабильностью и относительно хорошей окисляемостью [14]. Образование радикалов инициировали введением при постоянном перемешивании 1 мл 35 мМ раствора сернокислого железа (FeS04×7H20) в 19 мл среды. Концентрация экстракта Саперави NR (номерной резерв) в пробе составляла 0,01% (0,1 мг/мл).

ХЛ регистрировали с помощью экспресс-анализатора ХЛ-003 (ФГБОУ ВПО "Уфимский авиационный технический университет", РФ) в течение 5 мин для ЦФЛ и 10 мин для ЖЛП. Определяли светосумму ХЛ. Результаты экспериментов оценивали по интенсивности ХЛ (в усл. ед.) и рассчитывали снижение ХЛ в процентах от контроля (ХЛ модельной системы без препарата), принятого за 100%.

Влияние концентрата красного вина Саперави на глутаматную цитотоксичность изучали в культуре нейронов мозжечка. Культуры получали из мозга 7-9-дневных крысят методом ферментномеханической диссоциации [15]. После 8 дней культивирования культуры клеток подвергали действию глутамата и/или экстракта Саперави NR. Воздействие глутаматом осуществляли в сбалансированном солевом растворе (ССР) следующего состава (мМ): Na2HPO4 - 0,35; CaCl2 - 2,3; NaCl - 136,7; KCl - 5,6; NaHCO3 - 12; глюкоза - 11 (рН 7,5). Длительность воздействия составляла 20 мин, контрольные культуры помещали на 10 мин в ССР без глутамата. Концентрат вносили в культуры нейронов после возвращения их в исходную питательную среду из ССР в концентрациях от 5 до 60 мкг/мл. Затем культуры помещали в СО2-инкубатор на 4 ч и фиксировали. Морфологический анализ культур проводили в фазовом контрасте на инвертированном микроскопе "Invertoscopes ID 03" ("Zeiss", Германия) для оценки количества живых и погибших нейронов. Количество живых нейронов выражали в процентах от общего количества нейронов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Роль свободных радикалов в патогенезе стрессовых расстройств, ишемических, травматических и дегенеративных поражений нервной системы установлена давно. Головной мозг особенно чувствителен к активации свободнорадикального окисления, поскольку обладает более высоким уровнем потребления кислорода и содержит большее количество липидов в сравнении с другими органами [16]. Введение в организм лекарственных препаратов может привести к серьезным изменениям свободнорадикального окисления и антиоксидантного статуса в центральной нервной системе, что делает необходимым детальное изучение антиоксидантных свойств применяющихся препаратов.

В таблице представлен химический состав флавоноидов концентрата красного столового вина, свидетельствующий о наличии биологически активных соединений, проявляющих антиоксидантное действие.

Как показали исследования, концентрат полифенолов обладает антиоксидантной активностью, что проявляется в снижении интенсивности ХЛ в модельных системах, генерирующих свободные радикалы.

Гашение ХЛ в системе ЦФЛ составило 68,43%, в системе ЖЛП - 86,36%. Эти данные свидетельствуют о том, что содержащиеся в концентрате полифенолы обладают высокой антиоксидантной активностью и способны перехватывать активные формы кислорода (система ЦФЛ), а также ингибировать образование липопероксильных радикалов, о чем свидетельствует снижение интенсивности ХЛ в модельной системе ЖЛП.

Исследование влияния концентрата на нейротоксичность глутамата показали следующее. Воздействие глутамата на нейроны мозжечка привело к сокращению доли живых клеток в среднем до 22%. Применение экстракта Саперави значительно повышало выживаемость нейронов. Так, при дозах 5, 10, и 30 мкг/мл количество неповрежденных нейронов составляло соответственно 38,6; 41,5 и 37,1% (см. рисунок). Доза 20 мкг/мл была наиболее эффективной - доля живых нейронов составила 47,4%. Применение более высокой дозы (60 мкг/мл) не повышало выживаемость нейронов после применения глутамата. В отсутствие глутамата концентрат Саперави не влиял на количество живых клеток в культурах нейронов мозжечка крыс. Доля живых нейронов в контрольных культурах и культурах с экстрактом Саперави превышала 95% (данные не показаны).

Полученные результаты могут быть объяснены высокой антиоксидантной активностью флавоноидов, содержащихся концентрате, а также значительным (в сравнении с исходным виноматериалом, свежими ягодами и фруктами) содержанием биологически активных веществ - катехинов, кверцетина, рутина, ресвератрола и др. В литературе имеются данные о протекторном действии различных антиоксидантов при воздействии глутамата на нервные клетки. Поэтому вполне логично предположить, что наблюдаемое нами защитное действие концентрата красного столового вина обусловлено антиоксидантными свойствами его компонентов.

Проведенные нами исследования свидетельствуют, что потребление красного вина (в количествах, исключающих вредные последствия) может оказывать положительное влияние на здоровье человека и на мозг в частности. Кроме того, необходимо учитывать тот факт, что положительное действие на организм оказывают только столовые вина. Проведение исследований влияния соединений, присутствующих в вине и винограде, представляет большой интерес с точки зрения их возможного применения в комплексной терапии при патологиях мозга, поскольку полученные на данный момент времени результаты свидетельствуют о немалой перспективности этого направления. Учитывая общеизвестное положительное действие вина на сердечно-сосудистую систему (так называемый французский парадокс) и тесную взаимосвязь ряда патологических процессов мозга с нарушениями функционального состояния сосудов, можно рассматривать концентраты флавоноидов красных столовых вин как эффективные средства комплексного терапевтического воздействия на мозг.

Таким образом, установлено защитное действие концентрата красного столового вина Саперави на нейроны мозжечка при токсическом воздействии глутамата. Наше исследование наряду с результатами, полученными другими авторами [16-18], свидетельствует о наличии у экстракта красного вина, кроме положительного действия на сосуды, нейропротекторных свойств.

Статья выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России. Уникальный идентификатор ПНИ RFMEFI60414X0077 при подписании Соглашения № 14.604.21.0077.

Литература

1. Холмгрин Е., Литвак В. Компоненты вина и здоровье // Виноделие и виноградарство. 2002. № 2. С. 8-10.

2. Vinson J.A., Momdaranao M.A., Shuta D.L., Baqohi M., Baqohi D. Beneficial effects of a novel 1H 636 grape seed proanthocyanidin extract and a niacin-bound ehromium in a hamster aterosclerosis model //Mol. Cell. Biochem. 2002. Vol. 240. Р. 99-103.

3. Огай Ю.А., Валуйко Г.Г., Загоруйко В.А., Костогрыз А.М. Пищевой концентрат полифенолов винограда "Эноант", достижения и перспективы производства и применения в питании // Биологически активные природные соединения винограда: перспективы производства и применения в медицине и питании : материалы международной научно-практической конференции. Симферополь : Сонат, 2001. С. 60-62.

4. Kaur Ch., Kapoor H.C. Antioxidant activity and total phenolic content of some Asian vegetables // Int. J. Food. Sci. Technol. 2002. Vol. 37, N 2. P. 153-161.

5. Сarneiro A., Assuncao M., De Freitas V., Paula-Barbosa M.M. et al. Red wine, but not port wine, protects rat hippocampal dentate gyrus against ethanol-induced neuronal damage - relevance of the sugar content // Alcohol Alcohol. 2008. Vol. 43, N. 4. P. 408-415.

6. Rice-Evans C.A., Miller N.J. Antioxidant Activities of Flavonoids as Bioactive. 2008. 370 p.

7. De Freitas V., da Silva Porto P., Assuncao M., Cadete-Leite A. et al. Flavonoids from grape seeds prevent increased alcohol-induced neuronal lipofuscin formation // Alcohol Alcohol. 2004. Vol. 39, N 4. Р. 303-311.

8. Большаков А.П. Глутаматная нейротоксичность: нарушение ионного гомеостаза, дисфункция митохондрий, изменение активности клеточных систем // Нейрохимия. 2008. Т. 25, № 3. С. 157-169.

9. Шурыгин А.Я., Скороход Н.С., Злищева Э.И., Андросова Т.В. и др. Влияние полипептидной фракции СК, выделенной из кумыса, на нейритный рост и глутаматную цитотоксичность в культуре нервной ткани // Наука Кубани. 2010. № 3. С. 32-35.

10. Шурыгин А.Я., Кравцов А.А., Батсурен Д., Тунсаг Ж. и др. Сравнительное изучение защитного действия экстракта корней Astragalus mongolicus Bunge и Astragalus membranceus (Fischer) Bunge на зернистые нейроны мозжечка крыс в условиях глутаматной токсичности // Наука Кубани. 2009. № 3. С. 46-49.

11. Агеева Н.М., Маркосов В.А., Гублия Р.В. Биологическая ценность виноградных вин // Виноделие и виноградарство. 2008. № 3. С. 24-25.

12. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И. Антиоксиданты в красном вине и их определение амперометрическим методом // Виноделие и виноградарство. 2007. № 6. С. 22-23.

13. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. Оценка антиокислительных свойств плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. 1988. № 3. С. 59-62.

14. Кравцов А.А., Шурыгин А.Я., Абрамова Н.О., Скороход Н.С. и др. Влияние хронической свинцовой интоксикации на радикалообразование в мозге и глутаматную нейротоксичность в культуре нейронов мозжечка // Изв. высш. учеб. заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2009. № 5. С. 97-99.

15. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М. : Знание-М. 2000. 344 с.

16. Soleas G.J., Diamandis E.P., Goldberg D.M. Wine as a biological fluid: history, production, and role in disease prevention // J. Clin. Lab. Anal. 1997. Vol. 11. P. 287-313.

17. Агеева Н.М., Маркосов В.А., Бессонов В.В., Ханферьян Р.А. Антиоксидантные и антирадикальные свойства красных виноградных вин // Вопр. питания. 2015. № 2. С. 63-67.

18. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995. 90 с.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.