Method of determination organic iodine (iodotyrosines) in food
AbstractIt is important to control the substances of the synthesis of biologically active supplements, based on organic forms of iodine (iodotyrosines). But it is no less important to control the content of iodotyrosines in foods. The developed method is sensitive and selective and can determine iodotyrosines with a lower limit of detection (1 ppb). Iodotyrosines have been determined by HPLC-MS/MS. The article contains parameters for chromatographic separation of 3-iodo-L-tyrosine and 3.5-diiodo-L-tyrosine and parameters of the electrospray ionization (ESI) mass spectrometry, describes the methodology of sample preparation and solid phase extraction. The article substantiates the use of mass spectrometry as the most sensitive and selective method for determining the organic iodine as compared to HPLC with UV detection. The enzymatic hydrolysis with proteolytic enzymes has been used for sample preparation in iodothyronine analyses. Solid phase extraction was performed using C18 cartridge. For HPLC-MS/MS analysis iodothyronine derivatives were obtained with a mixture of butanol-acetyl chloride. Degree of iodotyrosine extraction from the matrix of the foodstuffs was not less than 85%, the correlation coefficient of the calibration curve in the concentration range of 1-2000 ng/mL was 0.999, reliable determination of iodine content in foods in the range from 10 to 20 000 mcg/kg.
Keywords:iodotyrosines, organic iodine, high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection, food products
Вопр. питания. 2016. № 4. С. 91-98.
В настоящее время широкое распространение получили биологически активные добавки (БАД) на основе органической формы йода. В основе процесса получения органической формы йода лежит процесс ферментативного йодирования аминокислотных остатков сывороточных белков коровьего молока с последующей дополнительной очисткой от неорганического йода с помощью ультрафильтрации, а также сублимационной и распылительной сушкой [1]. Йодированные молочные белки используются для обогащения йодом пищевых продуктов, однако содержание органической формы этого микроэлемента в продукте не контролируется из-за отсутствия стандартизированных методик определения органического йода.
Существующие методики определения йода основаны на вольтамперометрическом определении неорганической формы йода [2, 3]. Метод основан на способности иодид-ионов накапливаться на поверхности ртутно-пленочного электрода в виде малорастворимого соединения с ртутью при определенном потенциале с последующим катодным восстановлением осадка при изменении потенциала [4]. Данный метод не применим для подтверждения подлинности БАД на основе йодированного молочного белка, так как необходимо определить органическую форму йода в виде йодтиро-зинов. Титрометрический метод определения йода не применим для обогащенных пищевых продуктов, так как предел количественного определения составляет около 50 мг/кг, что на 2 порядка выше содержания йода в обогащенных продуктах [5].
В 2012 г. во ВНИИМП им. В.М. Горбатова была разработана и аттестована методика контроля содержания йодтирозинов в биологически активных добавках (МИ 103.5-132-2012) [6], позволяющая определять органическую форму йода в виде йодтирозинов. Ключевым этапом является ферментативное расщепление белковой части пробы протеазой и последующая очистка ультрацентрифугированием, идентификацию осуществляют методом обращенно-фазовой хроматографии с классическим ультрафиолетовым детектором (УФ-детектором) поглощения. Однако применить данный метод для обогащенных продуктов невозможно вследствие низкой чувствительности УФ-детектора [7, 8]. Наиболее информативны для этих целей методы тандемной жидкостной масс-спектро-метрии, времяпролетной масс-спектрометрии и мат-рично-активированной лазерной десорбции/ионизации, позволяющие с высокой точностью определять структурные фрагменты, аминокислотную последовательность, посттрансляционные модификации белков и аминокислот, молекулярную массу белков в широком их диапазоне [9, 10].
Целью работы была разработка методики определения йодтирозинов в пищевых продуктах методом тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии. В результате проведенных исследований были выбраны оптимальные условия ферментативного гидролиза, изучена и установлена степень гидролиза и стабильность аналитического сигнала в сложных матрицах, подобраны параметры хромато-масс-спектрометрической идентификации.
Материал и методы
В процессе разработки методики определения органического йода был апробирован вольтамперометричес-кий метод определения йода в пищевых продуктах [11]. Для разрушения органической формы йода пробы предварительно подвергали сухой минерализации в муфельной печи ПМ-16П-1200 (ОАО "Электроприбор", Россия), в качестве стабилизатора использовали 0,5 М раствор нитрата калия, количество образующегося комплекса йодид-ионов определяли на полярографе "Вольта АВС-1.1" (НТФ "Вольта", Россия). Объектами исследований являлись обогащенные в соответствии с рекомендациями [11] добавкой "Йодказеин" хлеб, молоко и кисломолочные продукты. Искомые концентрации находились в диапазоне 80-100 мкг/кг (в пересчете на йод). По результатам анализа не получены сходимые результаты, предположительно это связано с возможными потерями в ходе подготовки проб, так как йод - летучий элемент. В случае обогащения неорганической формой йода погрешность данного метода в диапазоне концентраций 80-100 мкг/кг не превышала 30%.
Для определения места включения йода и подтверждения наличия йодированных аминокислот была разработана методика хромато-масс-спектрометрической идентификации йодтирозинов. Для оценки места включения йода в белки был использован мягкий ферментативный гидролиз йодированного белка и анализ методами хроматографии и масс-спектрометрии.
В качестве стандартных образцов были использованы 3-йод-Ьтирозин (МИТ) и 3,5-дийод-Ь-тирозин (ДИТ) ("Sigma Aldrich", США). Для приготовления градуировоч-ных растворов проводили дериватизацию йодтирозинов (МИТ и ДИТ). Для этого стандартные образцы МИТ и ДИТ массой по 10 мг растворяли в 100 см3 метанола, с применением ультразвуковой ванны "Branson 5510" ("Branson", США). Отбирали 1 см3 раствора и упаривали на роторном испарителе "Laborota 4003" ("Heidolph", Швейцария). Сухой остаток растворяли в 1 см3 смеси бутанол: ацетилхлорид (4:1) и проводили термостати-рование на водяной бане при 60 °С в течение 15 мин. Смесь упаривали и перерастворяли в 10 см3 20% водного раствора ацетонитрила. Градуировочные растворы индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ) доводили до концентрации 10 и 1 нг/мл последующим разведением в 20% растворе ацетонитрила в воде.
Подготовка проб включала ферментативный гидролиз пищевого продукта, извлечение и очистку целевых веществ методом твердофазной экстракции (ТФЭ), с последующей дериватизацией экстракта.
Перед проведением анализа пробу предварительно высушивали в сушильном шкафу при 65-70 °С и обезжиривали на аппарате Сокслета "Behr R 106 S" ("Behr Labor-Technik", Германия). Молоко и молочные продукты не нуждаются в предварительной подготовке. Навеску образца гидролизовали в буферном растворе Трис-HCl, pH 8,0, добавляли протеазу из Streptomyces griseus ("Sigma Aldrich", США) в количестве, составляющем 1/10 от массы пробы белка, и термостатировали не менее 16 ч при 37 °C. Гидролизат центрифугировали и фильтровали, после подвергали очистке методом ТФЭ. Патрон ТФЭ предварительно кондиционировали последовательно 2 см3 метанола и 2 см3 бидистиллированной воды. Отбирали 0,4 см3 гидролизата пробы, добавляли 0,1 см3 ацетонитрила, смесь наносили на патрон. Экстракцию с патрона осуществляли в две стадии последовательным элюированием 1 см3 метанола и 1,5 см3 смеси аце-тонитрил:0,1 М HCl (4:1,8). Элюент упаривали досуха при 60 °С, затем дериватизировали смесью бутанол:хлорис-тый ацетил (4:1) подобно стандартным образцам и перерастворяли в 20% водном растворе ацетонитрила.
Параметры анализа йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
Анализ выполняли методом ВЭЖХ-МС/МС после хро-матографического разделения в установленных условиях на системе ВЭЖХ "Agilent 1200 series" ("Agilent Technologies", США) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) на масс-спектрометре "Agilent 6410 Triple Quadrupole" ("Agilent Technologies", США). Хрома-тографическое разделение гидролизата смеси после дериватизации проводили методом обращенно-фазной хроматографии на колонке с фазой С18 ("Agilent Eclipse XDB C18", 4,6x50 мм, 1,8 мкм) в условиях градиентного элюирования, представленных в табл. 1. Для анализа подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования: температура источника - 100 °С; температура газа десольвации -320 °С; скорость потока газа десольвации - 8 л/мин; давление иглы распылителя - 30 psi.
Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в табл. 2.
Приготовленные стандарты анализировали 5-кратно, затем с помощью программного обеспечения "Masshunter Quantitative Analysis" (Version Build 4.0.225.0) по зависимости площадей MRM-переходов хроматогра-фических пиков стандартных образцов исследуемого соединения от концентрации аналита строили калибровочную кривую. Идентификацию аналитов осуществляли по абсолютному времени удерживания дочерних ионов целевых веществ, регистрируемых в режиме MRM. Нижний предел количественного определения по йодти-розинам (МИТ, ДИТ) составил 1 мкг/кг. Линейный коэффициент корреляции был равен 0,9994 в диапазоне измерений концентраций йодтирозинов от 1 до 2000 нг/мл. За счет использования колонок с мелкозернистым сорбентом (1,8 мкм) время анализа не превышало 5 мин. Полученные хроматограммы стандартных образцов йодтирозинов и калибровочные кривые представлены на рис. 1-3. )
)
)
Результаты и обсуждение
Проблема создания, внедрения и промышленного выпуска йодсодержащих препаратов тесно связана с необходимостью разработки чувствительных методов анализа органических полигалогенидов на различных этапах получения, в БАД и биообъектах. Необходимость контроля содержания йодтирозинов обусловлена как технологическими факторами при производстве пищевых продуктов, так и использованием в рецептуре все большего количества химических соединений, которые могут взаимодействовать с образованием новых веществ.
Контроль качества пищевых продуктов на содержание йода в органической форме требует использования методов хроматографии, тандемной масс-спектрометрии. Основными критериями доказательства подлинности йодированных молочных белков является подтверждение наличия йодированных аминокислот, в частности йодтирозинов, и определение степени их йодирования. Идентификация йодтирозинов в сложных пищевых матрицах, обогащенных органической формой йода (мясомолочная продукция, хлебобулочная продукция, консервированные соки и др.), требует применения техники ВЭЖХ-МС/МС. Поведенные исследования показали, что при кислотном гидролизе (при 110 °С в течение 24 ч) йодированные аминокислоты, в частности йодти-розины, неустойчивы в присутствии концентрированной соляной кислотой. При щелочном гидролизе происходит рацемизация некоторых аминокислот и разрушение аргинина, лизина, цистина и цистеина. Гидролиз белков, осуществляемый с помощью протеолитических ферментов, лишен недостатков кислотного гидролиза. При ферментативном гидролизе были получены частичные гидролизаты, содержащие в различных соотношениях как малые пептиды, так и аминокислоты, в том числе триптофан. Для гидролиза использовали ферменты: папаин, панкреатин, протеазу. Максимальная степень гидролиза была достигнута при использовании протеазы из Streptomyces griseus.
Степень извлечения йодтирозинов из матрицы пищевого продукта составила не менее 85% (находилась в пределах 85-90%). Вследствие чего при вычислении массовой доли йодтирозинов, был введен эмпирический коэффициент 0,85, учитывающий потери йодтиро-зинов на стадии пробоподготовки.
Хроматограммы пробы пищевого продукта, обогащенного йодтирозинами, представлены на рис. 4
)
Установлено, что методы тандемной хромато-масс-спектрометрии в целях контроля качества обогащенной продукции (после внесения функциональных добавок, содержащих йодированные молочные белки) позволяют достоверно идентифицировать форму органического йода и контролировать ее количество (в виде йодтиро-зинов) в пищевых продуктах в диапазоне содержания от 10 до 20 000 мкг/кг. По результатам проведенных исследований разработан ГОСТ 33422 -2015 "Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором".
Работа выполнена в рамках, гранта Российского научного фонда № 15-16-10000.
Литература
1. Томчани О.В. Разработка технологий йодказеина и молочных продуктов, обогащенных йодированным белком : автореф. дис. ... канд. тех. наук. Обнинск, 2002. 36 с.
2. AOAC (2005). Official method of Analysis. 18th ed. Washington, DC : Association of Officiating Analytical Chemists, method 935.14 and 992.24.
3. AOAC (2007). Official method of Analysis (18th ed.). Washington, DC: Association of Officiating Analytical Chemists, method 992.22.
4. Жукова Г.Ф., Савчик С.А., Хотимченко С.А. Методы количественного определения йода в пищевых продуктах и продовольственном сырье // Вопр. питания. 2004. № 5. С. 42-48.
5. МУК 4.1.1106-02. "Определение массовой доли йода в пищевых продуктах и сырье титриметрическим методом". М., 2002. 10 с.
6. МИ 103.5-132-2012/01.00225-2011 "Определение содержания йодтирозинов в йодированных молочных белках и БАДах на их основе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии". М., 2012. 16 с.
7. Judprasong K., Jongjaithet N., Chavasit V. Comparison of methods for iodine analysis in foods // Food Chem. 2016. Vol. 193. P. 12-17.
8. Nitschke U., Stengel D.B. A new HPLC method for the detection of iodine applied to natural samples of edible seaweeds and commercial seaweed food products // Food Chem. 2015. Vol. 172. P. 326-334.
9. Comprehensive Handbook of Iodine. Determination of Iodine In Vivo and In Vitro by X-Ray Fluorescence Analysis: Methodology and Applications. Elsevier, 2009. P. 29.
10. Чернецова Е.С., Корякова А.Г. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией для исследования новых лекарственных веществ// Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7, № 2. С. 101-112. 11. MP 2.3.7.1916-04 "Применение йодказеина для предупреждения йоддефицитных заболеваний в качестве средства популяционной, групповой и индивидуальной профилактики йодной недостаточности". М., 2004. 12. МУК 4.1.1187-03. "Вольтамперометрическое определение йода в пищевых продуктах", М., 2003. 23 с.
All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)
© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.