Система гемостаза выполняет в организме ряд важных функций: поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствуя тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость. При реакциях напряжения происходит ускорение непрерывно протекающего свертывания крови, зачастую проявляющееся тромбогеморрагическими осложнениями [1, 2].
Усилия специалистов в области изучения процессов свертывания крови до сих пор в большей степени были направлены на борьбу с последствиями усиленного тромбиногенеза. В клинической практике широко используются прямые ингибиторы тромбина [3], уже достаточно известные (ацетилсалициловая кислота) и новые антиагреганты, в основе механизма действия которых лежит их способность блокировать рецепторы [4-6] клеточных мембран тромбоцитов.
Вместе с тем применение многих антикоагулянтов и антиагрегантов в профилактических целях ограничивается рядом побочных эффектов [4].
В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, была обоснована возможность снижения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови с помощью неспецифических воздействий, в частности синтетическими и природными антиоксидантами [7].
В естественных условиях антиоксиданты содержатся в источниках растительного и животного происхождения. Среди последних выделяются жиры животного происхождения - природные микст-субстанции, обладающие достаточной концентрацией мононенасыщенных и полиненасыщенных (ω-3 и ω-6) жирных кислот, а также жирорастворимых витаминов.
Учитывая тесную взаимосвязь гемостаза с липопероксидацией [2], данные об антиоксидантных свойствах липидных компонентов медвежьего жира, а также отсутствие сведений об их комплексном влиянии на гемостаз, нам представлялось перспективным изучить характер, направленность, а также возможные механизмы влияния медвежьего жира на непрерывно протекающее свертывание крови в условиях физиологической нормы и при интенсивной индукции тромбиногенеза.
Цель исследования - изучить характер и механизмы влияния медвежьего жира на различные звенья гемостаза при экспериментальной тромбинемии различного происхождения.
Материал и методы
В исследованиях в качестве экспериментальных животных использовали самцов нелинейных белых крыс 3,5-месячного возраста с исходной массой тела 250-300 г, выведенных в питомнике Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, РФ). Число крыс в группах сравнения составляло 14.
Животных содержали на кормовой смеси для лабораторных животных (крыс) [профессиональные экструдированные корма для лабораторных животных, изготовленные в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 и имеющие оптимальное соотношение белков, жиров и углеводов, витаминов и микроэлементов. Состав (в %): пшеничная мука - 30; овсяная мука - 35; кукурузная мука - 15; рыбная мука - 6; молоко коровье сухое - 6; мука кровяная - 2; яичный порошок - 1; дрожжи сухие - 1,5; мел молотый - 1; соль поваренная - 0,5; желатина пищевая - 0,5]. В состав суточных порций опытных групп дополнительно (в качестве основного источника жира) вводили медвежий жир в дозе 0,08 мл на 100 г массы тела животного перорально в течение 14 сут. Дозы изучаемой субстанции для животных были адекватны рекомендуемым дозам для человека, но пересчитывались на массу тела животного. В рацион контрольной группы животных дополнительно (в качестве основного источника жира) вводили растительное масло в таком же количестве.
Экзогенную тромбинемию вызывали внутривенным введением в яремную вену взвеси тромбина (1,67 единиц активности на 100 г массы тела) в физиологическом растворе. Пробы крови отбирали через 0,5 и 1 ч. Эндогенную тромбинемию воспроизводили, используя комбинированный (гипотермия + физическая нагрузка) стресс. Для этого животных помещали в холодную воду (+15 °С) на 30 мин, заставляя их двигаться. Пробы крови отбирали до воздействия, а также спустя 0,1, 1 и 3 ч после его окончания.
Болезненные манипуляции производили, подвергая животных наркозу этоксиэтаном. Отбор проб и их последующая обработка соответствовали требованиям, принятым для коагулологических исследований.
Параметры коагуляционного гемостаза [протромбиновое время (ПТВ), тромбиновое время, активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время (АЧТВ), содержание фибриногена)] оценивали на коагулографе ("Cormay", Польша), определение активности антитромбина III и растворимых комплексов мономерного фибрина проводили согласно инструкциям к наборам ("Технология-стандарт", Барнаул, РФ).
Содержание адреналина в сыворотке крови изучали методом иммуноферментного анализа с использованием наборов ("Биохиммак", РФ).
Количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе "MaxM" ("Coulter", США), а также с помощью прямой микроскопии в камере Горяева. В последнем случае для оценки функционального состояния тромбоцитов изучали содержание дискоцитов и активированных форм (в абсолютных и относительных значениях), а также число клеток, вовлеченных в образование агрегатов (в процентах от общего количества тромбоцитов).
Результаты исследований, имеющие цифровое выражение, анализировали методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с использованием программы Microsoft Excel, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и среднеквадратичное отклонение (σ). Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стьюдента (t) и степень вероятности (р). Различия считали статистически значимыми при степени вероятности р<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате внутривенного введения в яремную вену взвеси тромбина (экзогенная тромбинемия) у контрольных животных через 0,5 ч наблюдалась гипокоагулемия потребления (табл. 1). Удлинились все клоттинговые тесты (р<0,05): ПТВ - на 11,1%, АЧТВ - на 13,4%, тромбиновое время - на 16,8%. Содержание фибриногена упало в 1,9 раза, что сопровождалось приростом уровня растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) на 91,6% (р<0,05) и снижением активности антитромбина III на 20,2% (р<0,05).
)
Одновременно развилась выраженная тромбоцитопения с увеличением относительного числа активированных форм (на 73,1%; р<0,05) (рис. 1) и уменьшением содержания дискоцитов (в 6,8 раза), в 10,2 раза увеличилось относительное содержание клеток, вовлеченных в агрегаты.
)
Через 1 ч у животных контрольной группы нивелирования признаков гипокоагулемии не наблюдалось: содержание фибриногена осталось на прежнем уровне при удлиненном тромбиновом времени (рис. 2) и признаками продолжающегося потребления антитромбина III.
В группе опытных животных через 0,5 ч также наблюдалась коагулопатия потребления, но степень ее была менее выражена, чем в контроле: оставались неизменными ПТВ, тромбиновое время и содержание фибриногена, а активность антитромбина III оказалась выше, чем в контрольной группе. Прирост РКМФ составил лишь 28% (р<0,05) (в контроле - 92%; р<0,05).
Со стороны тромбоцитарного гемостаза через 0,5 ч снизилось содержание тромбоцитов, но в значительно меньшей степени, чем в контрольной группе (лишь на 45,4%), ниже оказался прирост содержания активированных форм (рис. 1б), а уровень дискоцитов уменьшился всего в 2,9 раза (в контроле - в 6,8 раза). Количество клеток, вовлеченных в образование агрегатов, выросло в 4,9 раза, т.е. значительно в меньшей степени, чем в контроле.
Через 1 ч у крыс, получавших медвежий жир, обнаружилось незначительное снижение концентрации фибриногена (рис. 2а), что сопровождалось удлинением АЧТВ. В целом же потенциал гемостатического каскада, как и противосвертывающей системы, оставался высоким (судя по тестам ПТВ, тромбинового времени и содержанию антитромбина III).
Воспроизведение апробированной модели комбинированного стресса (эндогенная тромбинемия) показало следующее.
Выявлено, что через 0,1 ч после окончания воздействия (гипотермия + физическая нагрузка) у животных контрольной группы произошла существенная интенсификация тромбиногенеза. На фоне укорочения АЧТВ (на 24,9%; р<0,05) и ПТВ (на 16,8%; р<0,05) наблюдалось удлинение тромбинового времени. На 52% выросла концентрация РКМФ (р<0,05) и снизилась концентрация фибриногена. Компенсаторно увеличилась активность антитромбина III (на 52,8%; р<0,05).
К 1 ч признаки гипокоагулемии усугублялись в еще большей степени (по тестам ПТВ и тромбинового времени), одновременно обнаружилось интенсивное потребление антитромбина III (снижение активности по сравнению с 0,1 ч - в 2,3 раза).
К 3 ч на фоне нормального (исходного) содержания фибриногена и активности антитромбина III, показатель тромбинового времени оставался повышенным на 39,3% (р<0,05), что связано с высоким содержанием продуктов паракоагуляции.
У животных, получавших медвежий жир, последствия стресс-воздействия со стороны коагуляционного гемостаза были выражены в меньшей степени. Через 0,1 ч, как и в течение всего эксперимента, АЧТВ не отличалось от исходных цифр. Содержание РКМФ и показатель тромбинового времени на всех этапах были меньше, чем в контрольной группе, а к 3 ч оба достигли первоначальных значений. Уровень фибриногена не возрастал (рис. 3). Изначально высокий потенциал антитромбина III расходовался адекватно, препятствуя запредельному ускорению непрерывно протекающего свертывания крови в плазме крови опытных животных.
)
Со стороны тромбоцитарного гемостаза у контрольных животных наблюдалось повышение содержания тромбоцитов, которое сохранялось к 1 ч и превосходило исходный показатель на 34,3% (р<0,05). Несмотря на это, относительное количество дискоцитов на первых двух этапах эксперимента было сниженным, а содержание активированных форм увеличивалось на 71,7% (р<0,05). Кроме того, до 1 ч сохранялось повышенным число агрегатообразующих клеток.
У животных, получавших медвежий жир, прироста содержания тромбоцитов не наблюдалось. Относительное количество дискоцитов уменьшилось в меньшей степени, чем в контроле, а абсолютное содержание активированных форм повысилось лишь на начальном этапе эксперимента. Число агрегатообразующих клеток не изменялось.
Известно, что важнейшим индуктором образования тромбина в условиях стресса является избыточный выброс катехоламинов. Нами оценено в динамике содержание адреналина в сыворотке крови животных обеих групп наблюдения.
Установлено что 30-минутное воздействие комбинированного стресса активирует повышенный выброс и последующее расходование пула катехоламинов в контрольной группе. Через 0,1 ч концентрация адреналина снизилась в 2,1 раза, в дальнейшем возрастала, а к 3 ч превосходила исходные значения на 25,2% (рис. 4).
)
Иная реакция наблюдалась у животных опытной группы. На протяжении всех временных точек адреналинемия оставалась на постоянном уровне. При этом исходное содержание стрессорного гормона (т.е. до воздействия) в опытной группе оказалось ниже на 44,6%, чем в контроле.
Из этого следует, что компоненты медвежьего жира ограничивают выброс стресс-реализующих гормонов. Таким образом, одним из механизмов протективного влияния медвежьего жира на параметры гомеостаза является их антистрессорная способность.
После детального анализа состава медвежьего жира становится очевидно, что противосвертывающий механизм данной добавки преимущественно обусловлен ее антиоксидантными свойствами. Суммарное содержание насыщенных (в наибольшем количестве представлены пальмитиновая и стеариновая кислоты) и мононенасыщенных (олеиновая) жирных кислот по отношению к полиненасыщенным (линолевая и линоленовая) в жире составило 1,4, что связано с относительно высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот. Еще больший антиоксидантный эффект обусловлен достаточно высоким содержанием витаминов А и Е. Как известно, все эти липидные компоненты потенциально обладают способностью ингибировать свободнорадикальные процессы [7, 8]. Это позволило предположить, что введение данной биологически активной добавки, как и других, ранее изученных антиоксидантов, может оказать влияние на интенсивность постоянно протекающего свертывания крови в условиях тромбинемии.
Заключение
Введение в рацион медвежьего жира взамен растительного масла ограничивает у животных последствия экзо- и эндогенной тромбинемии. Это связано со способностью медвежьего жира уменьшать поступление в кровоток тромбопластических субстанций (за счет антиоксидантных свойств) и ограничивать реализацию возмущающих стресс-реакций. Существенно, что точками приложения медвежьего жира в этих условиях являются все компоненты гемостаза. Характерная направленность и динамика ряда показателей (содержание адреналина, фибриногена, продуктов паракоагуляции, антитромбина III, эритроцитов, тромбоцитов и их активированных форм) позволяет утверждать, что защитный эффект медвежьего жира при различных видах тромбинемии реализуется за счет их антистрессорного эффекта.
Литература
1. Датиева Ф.С., Хетагурова Л.Г., Хестанов А.У. Диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови - типовой патологический процесс в системе гемостаза // Владикавказский медико-биологический вестн. 2011. № 20/21. С. 73-82.
2. Rau J.C. et al. Serpins in thrombosis, hemostasis and fibrinolysis. XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis // J. Thromb. Haemost. 2007. Vol. 5, suppl. 1. Р. 102-115.
3. Crawley J.T.B. et al. The central role of thrombin in hemostasis. XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis // J. Thromb. Haemost. 2007. Vol. 5, suppl. 1. Р. 95-101.
4. Шилов А.М. Аспирин - антиагрегант в практике лечения сердечно-сосудистых заболеваний // Рус. мед. журн. 2012. № 4. С. 182-186.
5. Goto S.H. et al. Double-blind, placebo-controlled Phase II studies of PAR-1 antagonist E555 (atoxapar) in Japanese patients with ACS or high-risk CAD // Eur. Heart J. 2010. Vol. 31. Р. 2601-2613.
6. Зиганшин А.У. Новые антиагреганты - блокаторы тромбоцитарных Р2-рецепторов // Казан. мед. журн. 2010. Т. 91, № 1. С. 73-77.
7. Barden A. et al. The effects of oxidation products of arachidonic acid and n3 fatty acids on vascular and platelet function // Free Radic. Res. 2011. Vol. 4. Р. 469-476.
8. Богданова А.С., Дубских И.А., Шумасова А.Ш. Влияние перекисного окисления липидов на агрегационную активность тромбоцитов у больных с артериальной гипертензией - работников железнодорожного транспорта // Медицинская наука и образование Урала. 2012. Т. 13, № 1. С. 11-14.