Жиры рыб применяются с лечебными и профилактическими целями в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Рыбий жир получают в результате переработки либо печени рыб (семейства тресковых, акулы, палтуса), либо рыбы целиком (сельди, сардины, анчоуса). Во втором случае часто используют термин "рыбный жир", подчеркивающий, что источником получения является не печень, а мышцы рыб.
Рыбий жир является богатым источником витаминов А, Е и D3, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейства ω-3 - эйкозапентаеновой и докозагексаеновой. Жир, получаемый из печени рыб, содержит больше витаминов А и D, чем жир из мышц или цельной рыбы, который, в свою очередь, содержит больше ПНЖК. Известно также, что жиры рыб северных широт богаче ценными компонентами, чем жиры рыб, обитающих в теплых водах [1].
Рыбий жир применяют для получения лекарственных препаратов, биологически активных добавок (БАД) к пище, функциональных пищевых продуктов (ФПП), а также в ветеринарии. В каждой отрасли (медицинской, пищевой) действуют свои регулирующие документы, нормативы и требования, не всегда идентичные, а иногда и противоречивые. Рыбий жир в целом имеет низкую токсичность. Вместе с тем нутриенты рыбьего жира являются фармакологически активными соединениями. Возможные негативные последствия применения рыбьего жира могут быть связаны с риском избыточного потребления жирорастворимых витаминов [2].
Целью данного исследования был сравнительный анализ требований к качеству рыбьего жира (преимущественно по содержанию основных нутриентов) в зависимости от области его применения.
В Российской Федерации для медицинского применения разрешен рыбий жир очищенный для внутреннего применения (Oleum jecoris Aselli, ГФ Х, ст. 476, МНН рыбий жир из печени тресковых рыб - Cod liver oil) в виде масла для приема внутрь и в виде капсул [3]. Также допускается к применению рыбий жир тресковый витаминизированный [4, с. 487], получаемый добавлением к рыбьему жиру субстанций витамина А (ретинола пальмитата или ацетата) и эргокальциферола (витамина D2). Препараты относятся к группе витаминов и регуляторов витаминно-кальциево-фосфорного обменов. Показаны для профилактики и лечения гипо- и авитаминоза А, рахита, как общеукрепляющее средство, для ускорения сращения костных переломов и при других показаниях к применению витаминов А и D.
Рыбий жир очищенный для внутреннего применения получают из печени тресковых рыб: трески атлантической (Gadus morhua L.), трески балтийской (Gadus morhua callarias L.), пикши (Melanogrammus aeglefinus L.), путассу северной (Micromesistius poutassou; R.) семейства тресковых (Gadidae); макруруса тупорылого (Coryphaenoides rupestris G.) семейства Macrouridae [5].
Монографии на рыбий жир включены практически во все ведущие фармакопеи. В табл. 1 приведены требования к качеству рыбьего жира по основным показателям (подлинность, количественное определение), включенные в различные нормативные документы [4, 6, 7]. В Российской Федерации рыбий жир тресковый стандартизируют по содержанию витамина А - не менее 350 МЕ/г, Рыбий жир тресковый витаминизированный должен содержать витамина А 1000 МЕ/г (±15%), витамина D - 100 МЕ/г (±20%) [4, 5].
)
)
Кроме медицинского применения рыбий жир используют для получения БАД к пище и ФПП. В России рыбий жир пищевой выпускают по ГОСТ 8714-72 "Жир пищевой из рыбы и морских млекопитающих". Однако в соответствии с ГОСТ 8714-72 основные параметры (содержание витаминов А, Е, D3, ПНЖК) не контролируют (табл. 1). Это позволяет производителям не анализировать и не указывать в своих продуктах содержание действующих веществ, что влечет за собой опасность передозировки витаминов. Еще один документ, регламентирующий качество пищевого рыбьего жира, -ГОСТ 9393-82 "Жир ветеринарный из рыбы и морских млекопитающих". Он распространяется на жир, изготавливаемый из рыбы и морских млекопитающих с добавлением витаминов, предназначенный для ветеринарных целей и использования в питании сельскохозяйственных животных и птиц. Он регламентирует содержание основных нутриентов рыбьего жира, однако, с одной стороны, часть из них вносят извне (витамин А в виде ретинола ацетата или пальмитата, витамин D в виде эрго- или холекальциферола), с другой стороны, он распространяется на продукцию, имеющую ограниченную область применения (ветеринарную). Основным международным документом, регулирующим качество пищевых продуктов, является Codex Alimentarius (Кодекс Алиментариус, или Пищевой кодекс). Это свод пищевых стандартов и правил по пищевым продуктам, принятых Международной комиссией ФАО/ВОЗ. В ходе работы 24-й сессии Комитета кодекса по жирам и маслам, проходившей в Малайзии в феврале 2015 г., и 38-й сессии Международной комиссией ФАО/ВОЗ, проходившей в Швейцарии в июле 2015 г. [8, 9], был рассмотрен ряд документов, в том числе Стандарт для рыбьих жиров (Proposed draft codex standard for fish oil). Этот документ распространяется на рыбьи жиры, предназначенные для пищевого употребления человеком, содержит перечисление основных видов рыбьих жиров, в нем приведены параметры качества и методы их определения, требования по упаковке и маркировке и др. Согласно этому стандарту, рекомендовано проводить анализ основных нутриентов рыбьего жира - витаминов А и D, ПНЖК; по методикам анализа он ориентирован на рекомендации Европейской фармакопеи (табл. 1).
Необходимо подчеркнуть, что Пищевым кодексом предусмотрено подразделение рыбьих жиров на ряд продуктов: рыбьи жиры, получаемые из определенных видов рыб или таксонов или их смеси (анчоусовый жир, крилевый жир, лососевый и др., п 2.1, 2.2); рыбий жир печени различных пород рыб, в отдельности тресковых (п 2.3, 2.4), а также концентрированные рыбьи жиры, полученные в результате дополнительной обработки и обогащенные эйкозапентаеновой и докопентаеновой кислотами (п 2.5) или этиловыми эфирами жирных кислот (п. 2.6). Это отражается и в нормировании требований к качеству, в особенности к характеристикам жирнокислотного состава. Кодекс содержит сведения о составе рыбьих жиров различных видов рыб, а также жира печени тресковых рыб.
Анализируя данные, представленные в табл. 1, можно заключить, что витамины А и D, а также ПНЖК регламентированы в нормативных документах, относящихся к медицинскому применению; в отношении рыбьего жира для пищевого применения нет единого подхода. Наиболее полный и подробный анализ качества рыбьего жира для пищевого применения предусмотрен Пищевым кодексом, регламентирующим содержание витаминов А, D и ПНЖК. Содержание такого важного действующего вещества, как витамин Е, в нативном рыбьем жире не регламентировано ни одним из рассматриваемых документов. Жиры рыб традиционно не считают богатыми источниками витамина Е, лидирующее положение по содержанию токоферолов занимают растительные масла - масло зародышей пшеницы (133 мг/100г α-токоферола), масло грецкого ореха, подсолнечника (около 50 мг/100 г) и др. [10]. Вместе с тем, по данным литературы [10], содержание α-токоферола в жире печени тресковых рыб составляет около 22 мг/100 г, что авторы считают сравнительно высоким уровнем. Токоферолы и токотриенолы являются природными антиоксидантами, они легко окисляются, и их содержание может снижаться при хранении, что может быть еще одной причиной не включать их в число контролируемых параметров. Во многие продукты на основе рыбьего жира синтетический витамин Е добавляют в качестве антиоксиданта, что обусловливает соответствующие рекомендации по его анализу. Так, Пищевым кодексом предусмотрено определение токоферолов индивидуально или в комбинации (п. 4), их содержание не должно превышать 6000 мг/кг.
Интервалы жирнокислотного состава, указанные в монографиях Европейской фармакопеи, Фармакопеи США и Пищевом кодексе (для жира печени трески), аналогичны. Пищевой кодекс предусматривает определение большего числа жирных кислот, включая несколько минорных (содержание от 0-0,5 до 0,5-3,0%), преимущественно ПНЖК (арахидоновая, эйкозатетраеновая, докозапентаеновая и др). В методологии анализа жирнокислотного состава Пищевой кодекс опирается на методы ISO (ISO 5508, ISO 12966-2) или ряд методов AOCS (American oil chemists' society), близких с фармакопейными: анализ состава жирных кислот проводят методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) после гидролиза жиров и получения метиловых эфиров жирных кислот. Фармакопейные методики более узки и однозначны, направлены на анализ определенного типа масел, в то время как методики ISO и AOCS имеют большее разнообразие в части способов метилирования, условий разделения и др. аспектах, поскольку охватывают более широкий круг анализируемых объектов и типов жирных кислот.
В рассмотрение включены такие качественные характеристики масел, как кислотное, перекисное, анизидиновое число, число ТоТох (total oxidation value), в большем или меньшем объеме представленные в документах, относящихся как к медицинскому, так и к пищевому применению. Во всех документах предусмотрено определение кислотного числа, в большинстве документов (трех) предусмотрено определение анизидинового и йодного чисел, число омыления предусмотрено только в Фармакопее СССР, а число ToTox только в Пищевом кодексе. Наибольшее число параметров этой группы содержат Европейская фармакопея и Пищевой кодекс. В целом эти параметры являются важными в обеспечении качества масел, однако не характеризуют напрямую содержание и состав основных нутриентов рыбьего жира.
В табл. 2 представлены данные о декларируемом производителями содержании витамина D в некоторых БАД к пище на основе рыбьего жира, реализуемых в настоящее время на рынке России (согласно базе данных rlsnet.ru и информации изготовителей).
Сравнительный анализ представленных данных позволяет заключить, что во многих случаях в БАД к пище, содержащих рыбий жир, уровень витамина D3 не декларирован и, по-видимому, не контролируется. В ряде случаев имеется указание на витамин D, но без уточнений его формы (D2 или D3). Кроме того, в этих случаях содержание витамина D может варьировать у БАД одного изготовителя в 3-10 раз (см. табл. 2). Например, рыбий жир с различными добавками, выпускаемый одной фирмой-изготовителем, может содержать 8 или 90 МЕ/г витамина D3 в зависимости от добавок. Отсутствие указаний на содержание витамина D можно связать с трудностями его определения. Вариабельность указываемых значений (и отсутствие уточнения о форме витамина D), возможно, связана с тем, что производитель добавляет в рыбий жир субстанцию витамина D2 (эргокальциферол) для обогащения продукции и придания ей D-витаминных свойств.
)
Следует отметить, что данная проблема существует и за рубежом. Так, в Финляндии большой резонанс имели результаты исследований Университета Восточной Финляндии по оценке содержания витамина D в 23 таблетированных БАД к пище [11], согласно которым только в 8 объектах количественное содержание витамина D соответствовало заявленному фирмой-изготовителем.
Необходимо подчеркнуть, что в связи с важными биологическими функциями и выраженной физиологической активностью нутриенты рыбьего жира относят к веществам, для которых существуют нормы суточного потребления. Так, в соответствии с МР 2.3.1.2432-08 [12] физиологическая потребность для взрослого человека в сутки составляет: ПНЖК семейства ω-3 - 2 г, витамина А - 3000 МЕ, витамина Е - 15 мг, витамина D - 10 мкг (400 МЕ). Таким образом, стандартизация рыбьего жира по содержанию основных нутриентов (витаминов А, D и Е, а также ПНЖК) представляется необходимой как для медицинского, так и для пищевого и ветеринарного применения этого ценного сырья.
Общепринятые методики анализа жирорастворимых витаминов в жиросодержащих лекарственных препаратах, пищевых продуктах и БАД к пище чаще всего предусматривают гидролиз (омыление) проб с последующим анализом методами спектрофотомерии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [4, 6, 7, 13-15]. К числу их недостатков относят длительность и трудоемкость выполнения, а также сравнительно высокие погрешности получаемых результатов (на уровне 10-15% и выше) [14-16]. По мнению ряда авторов [16], к проблемам этой группы методик относятся необходимость их валидации для разных типов объектов (в обсуждаемом случае для рыбьего жира и продуктов на его основе), а также аспект, связанный с существованием витаминов в различных формах, например D2 и D3 для витамина D. В ряде случаев методики предусматривают анализ только одной формы; их разделение затруднительно, и необходимы дополнительные стадии очистки (усугубляющих перечисленные недостатки) или применения более селективных способов детектирования [например, масс-спектрометрического (МС)]. О низкой вопроизводимости свидетельствуют, например, данные [16]: по результатам анализа витамина D в 5 контрольных пищевых объектах в 6 различных лабораториях относительное стандартное отклонение результатов (RSD, %) составило 35-50%, а по данным [14] допустимые внутрилабораторные расхождения результатов измерений для методик анализа жирорастворимых витаминов находятся на уровне 20-35%, межлабораторные - на уровне 30-55%.
В связи с этим публикаций, посвященных вопросам совершенствования методов анализа витамина D в различных объектах, достаточно много. В обзоре [17] собрана информация о различных аспектах совершенствования анализа витамина D в молочных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), включая особенности подготовки проб (горячее и холодное омыление, экстракция и др.), условий хроматографического анализа (нормально и обращенно-фазовая ВЭЖХ, размеры хроматографических колонок, тип детектирования). Авторы отмечают, что только в двух работах методики анализа витамина D были валидированы.
В табл. 3 сопоставлены основные валидационные параметры (линейность, точность, предел детектирования -LOD и предел количественного определения - LOQ) некоторых методик анализа витамина D в различных объектах (преимущественного пищевого применения), имеющиеся в доступной литературе. Большинство методик основано на применении ВЭЖХ с ультрафиолетовым (УФ-) или МС-детектированием. Вместе с тем методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) [18] можно достичь уровней линейности и чувствительности, сопоставимых с результатами ВЭЖХ, по крайней мере с УФ-детектированием. Точность различных методик в целом сопоставима и колеблется в диапазоне 90-110%. Применение ВЭЖХ с МС/МС-детектированием обеспечивает максимальную чувствительность (до 0,1-1 нг/мл) [26, 27].
Таким образом, проведенный анализ требований к качеству рыбьего жира и методов его стандартизации свидетельствует не только об актуальности совершенствования применяемых методик и поиска новых аналитических подходов, но и их валидации, включающей оценку межлабораторной воспроизводимости. Последующее сопоставление валидационныхи метрологических характеристик представляется необходимым обоснованием выбора методики для ее дальнейшего практического применения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России (Соглашение № 14.576.21.0010 от 17 июня 2014 г, Уникальный идентификатор прикладных, научных. исследований RFMEFI57614X0010).
Литература
1. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих. М. : Пищ. пром-ть, 1976. 475 с.
2. Коденцова В.М. Градации уровней потребления витаминов: возможные риски при чрезмерном потреблении // Вопр. питания. 2014. № 3. С. 41-51.
3. Регистр лекарственных средств России, 2012. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. URL: www.rlsnet.ru. (дата обращения: 26.04.2013).
4. Государственная Фармакопея СССР / МЗ СССР. 10-е изд. М. : Медицина, 1989. 1077 с.
5. Машковский М.Д. Лекарственные средства : в 2 т. М. : Новая волна, 2002. 608 с.
6. European Pharmacopoeia. 8th ed. / European Pharmacopoeia Commission, Council of Europe. Strasbourg : EDQM, 2014.
7. USP 38/NF33 The United States Pharmacopeia. The National Formulary / United States Pharmacopeial Convention. Rockville, MD, 2014.
8. Report of the twenty forth session of the Codex Committee on fats and oils. Codex Alimentarius Commission. Melaka, Malaysia, 9-13 February 2015. 66 p.
9. Joint FAO/WHO Food Standards programme Codex Alimentarius commission. Report of the 38ht Session, Geneva, 6-11 July 2015. 82 p.
10. Vitamin E in Health and Diseases / eds L. Paker, J. Fuch. New York : Marcel Dekker, 1993. 985 p.
11. Uutiset News. Finnish uni finds D vitamin supplements deficient. October 25, 2012.
12. МР 2.3.1.2432-08 "Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации".
13. Blake C.J. Committee on food nutrition // J. AOAC Int. 2007. Vol. 90. P. 18B-21B.
14. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М. : Брандес-Медицина, 1998. 340 с.
15. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. М. : Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 240 с.
16. Byrdwell W.C., DeVries J., Exler J. et al. Analyzing vitamin D in foods and supplements: methodologic rtiallenges // Am. J. Clin. Nutr. 2008. Vol. 88. P. 554S-557S.
17. Perales. S., Alegria A., Barbera R., Farre R. Determination of Vitamin D in dairy products by high performance liquid chromatography // Food Sci. Technol. Int. 2005. Vol. 11, N 6. P. 451-462.
18. Demchenko D.V., Pozharitskaya O.N., Shikov A.N., Makarov V.G. Validated HPTLC method for quantification of Vitamin D3 in fish oil // J. Planar Chromatogr. 2011. Vol. 24, N 6. P. 487-490.
19. Oldezka I., Kowalski P., Baluch A. et al. Quantification of the level of fat-soluble vitamins in feed based on the novel microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) method // J. Sci. Food Agric. 2014. Vol. 94. P. 544-551.
20. Al-Qadi E., Battah A., Hadidi K. Development of high-performance liquid chromatographic method for vitamin D3 analysis in pharmaceutical preparation // Jordan J. Pharm. Sci. 2010. Vol. 3, N 2. P. 78-86.
21. Пирогов А.В., Бендрышев А.А., Свидрицкий Е.П., Шпигун О.А. Определение жирорастворимых витаминов в зерновых премиксах, блендах, таблетированных биологически активных добавках и медпрепаратах методом ВЭЖХ // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2008. Т. 74, № 3. С. 3-9.
22. Ramadan M.F., Morsel J.T. Direct isocratic normal-phase HPLC assay of fat-soluble vitamins and β-carotene in oilseeds // Eur. Food Res. Technol. 2002. Vol. 214. P. 521-527.
23. Barba F.J., Esteve M.J., Frigola A. Determination of vitamins E (a-, c- and d-tocopherol) and D (cholecalciferol and ergocalciferol) by liquid chromatography in milk, fruit juice and vegetable beverage // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 232. P. 829-836.
24. Laleye L.C., Wasese A.A.H., Rao M.V. A study on vitamin D and vitamin A in milk and edible oils available in the United Arab Emirates // Int. J. Food Sci. Nutr. 2009. Vol. 60. P. 1-9.
25. Bartolucci G., Giocaliere E., Boscaro F. et al. Vitamin D3 quantification in cod liver oil-based supplement // J. Pharm. Biomed. Anal. 2011. Vol. 55, N 1. P. 64-70.
26. Trenerry C., Plozza T., Caridi D., Murphy S. The determination of vitamin D3 in bovine milk by liquid chromatography mass spectrometry // Food Chem. 2011. Vol. 125. P. 1314-1319.
27. Schadt H.S., Gossl R., Seibel N., Aebischer C.-P. Quantification of vitamin D3 in feed, food, and pharmaceuticals using high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry // J. AOAC Int. 2012. Vol. 95, N 5. P. 1487-1494.