Остеопороз - широко распространенное системное заболевание, которое характеризуется повреждением костной системы вследствие преобладания процессов резорбции костной ткани над процессами ее синтеза, снижением костной массы и нарушениями микроархитектоники костной ткани с последующим развитием хрупкости кости и увеличением риска переломов [1]. В качестве фенотипа при оценке остеопороза обычно используется показатель минеральная плотность кости (МПК). Всемирная организация здравоохранения определяет остеопороз как уровень МПК≥2,5 стандартных отклонения ниже ее среднего уровня, измеренного у молодых взрослых методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA) [2]. Патофизиология остеопороза сложна и включает многочисленные факторы, как эндогенные (генетические и гормональные), так и факторы риска окружающей среды (диета, образ жизни, использование лекарственных средств, физиологическое состояние организма). Исследования, проведенные у близнецов и среди членов одной семьи, показали, что генетические факторы объясняют 50-80% вариабельности МПК у взрослых молодых людей [3-5].
В последние годы в различных популяциях был выявлен целый ряд однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с остеопорозом [6-8], которые могут рассматриваться в качестве факторов риска развития этого заболевания [7]. Выявление генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском развития остеопороза, позволяет начать профилактику остеопороза и связанных с ним осложнений еще до того, как снижение степени минерализации костей станет очевидным.
Особое внимание в этих исследованиях отводилось гену рецептора кальцитонина (CALCR) [7-10]. Кальцитонин - гормон щитовидной железы, синтезирующийся в ее парафолликулярных клетках, один из основных регуляторов кальций-фосфорного обмена [11]. Органом-мишенью для него служит костная ткань, а основным биологическим действием является торможение костной резорбции. Кальцитонин ингибирует активность остеокластов и снижает скорость костной резорбции, стимулирует деятельность остеобластов, синтез костного матрикса и отложение кальция в костях, снижает уровень кальция в крови, стимулируя поступление его в костную ткань. Кроме того, он подавляет распад коллагена. Кальцитонин является функциональным антагонистом паратиреоидного гормона. Его рецепторы обнаружены в остеокластах, остеобластах, моноцитах, почках, мозге, гипофизе, плаценте, половых железах, легких и печени [11].
Рецептор кальцитонина относится к субсемейству рецепторов, связанных с G-белком (G protein-coupled receptors) [12]. Нарушение функции кальцитониновых рецепторов, расположенных на остеокластах, может приводить к увеличению костной резорбции и развитию остеопороза. CALCR, местоположение 7q21.3, кодирует изоформу-1 высокоаффинного рецептора для гормона кальцитонина. Замена цитозина на тимин (С>Т) в экзоне 17 гена CALCR в положении 1340 (rs1801197), что ведет к замене аминокислоты пролина (ССG) на лейцин (CTG) в положении 463 молекулы белка-рецептора, по свидетельству некоторых авторов, влияет на плотность костной ткани [13, 14].
Результаты исследований, посвященных изучению ассоциации полиморфизма rs11801197 гена CALCR с МПК, довольно противоречивы и варьируют от популяции к популяции.
В частности показано, что преобладание того или иного генотипа данного полиморфизма гена зависит от этнических особенностей популяции. Так, в популяции японцев преобладает генотип СС, частота которого достигает 70% [14, 15]. Высокая частота генотипа СС (83,8%) имела место также у китайских женщин в пре- и постменопаузе [16]. В то же время исследования у европейских женщин [13, 17] не выявили значительной распространенности генотипа СС (6,5%), но обнаружили значительную частоту генотипа ТС [13].
Распределение генотипов полиморфизма rs11801197 гена CALCR в Северо-Западном регионе России показало его сходство с европейской популяцией [10]. Примечательно, что внутри российской популяции обнаружена различная частота встречаемости генотипов полиморфизма rs11801197 гена СALCR между женщинами русской и татарской национальности [18].
Вместе с тем в ряде исследований показана связь снижения МПК с высокой частотой генотипа СС [8, 9, 19]. Однако в других исследованиях эта связь не подтверждена или, наоборот, показано, что генотип СС связан с более высокой МПК [8, 10, 16].
При изучении генетического полиморфизма другого гена, связанного с кальций-фосфорным обменом -а1-цепи коллагена 1-го типа (COL1A1), была выявлена положительная, однако не достигающая статистической значимости ассоциация аллеля Т полиморфизма rs1800012 у небеременных и у беременных женщин с риском снижения КП (OR=2,143, при р=0,31 и OR=1,227, при р=0,55 соответственно). У детей школьного возраста выявлена статистически значимая обратная ассоциация аллеля Т c риском снижения костной прочности (OR=0,621 при р=0,037), имеющаяся на уровне тенденции и у детей дошкольного возраста [20].
В связи с этим представляет интерес оценка генетического полиморфизма гена СALCR в популяции московских женщин и детей дошкольного и школьного возраста, для которых характерно нарушение метаболических процессов в костной ткани и риск развития остеопороза, обусловленного интенсивными процессами роста и развития костной ткани в период беременности, грудного вскармливания, в дошкольном и школьном возрасте. Подобные исследования по изучению генетического полиморфизма rs1801197 гена CALCR и его возможной связи с прочностью костной ткани у детей дошкольного и школьного возраста и у женщин в сочетании с беременностью и кормлением грудью, изученной с помощью метода ультразвуковой денситометрии, ранее в Российской Федерации не проводились.
Цель работы - изучение ассоциации полиморфизма rs11801197 гена CALCR со снижением костной прочности у детей и женщин Москвы.
Материал и методы
Исследование костной прочности (КП) и генетического полиморфизма rs11801197 гена CALCR проведено у 422 человек, среди которых было 269 детей: 76 детей в возрасте от 2 до 6 лет, 193 ребенка - от 7 до 16 лет, и 153 женщины (18-45 лет), из них 96 беременных женщин, 29 - кормящих со сроком лактации 1-12 мес и 28 небеременных женщин репродуктивного возраста. У 2 дошкольников, 2 школьников и 9 кормящих женщин отсутствовали данные по КП, поэтому анализ их данных по полиморфизму изученных генов включен только в расчет частоты встречаемости генотипов и аллелей у всех обследованных.
Обследование беременных и кормящих женщин проводили на базе московской женской консультации с октября 2012 г. по март 2013 г.
Обследование детей проводили на базе школы № 2006 ЮЗАО, "Школа здоровья" № 661 ЦАО и ДОУ № 1271 ЮВАО с апреля 2012 г. по апрель 2014 г.
Биологические образцы для проведения исследования забирали после подписания участниками исследования или ответственными за них лицами информированного согласия и одобрения протокола исследования этическим комитетом ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии".
Выделение ДНК из образцов буккального эпителия и лейкоцитов периферической крови проводили с помощью набора ДНК-сорб ("AmpliSens biotechnologies", РФ). Генотипирование проводили с применением аллель-специфичной амплификации с детекцией результатов в режиме реального времени и использованием TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК, используя тест-систему ("Applied Biosystems", США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени проводили на амплификаторе CFx96 "Real-Time System" ("Bio-Rad", США) согласно протоколу "Applied Biosystems" для генотипирования rs11801197.
Изучение КП проводили с помощью ультразвукового денситометра Sunlight Omnisense 7000 ("BeamMed", Израиль). При этом оценивали скорость прохождения ультразвуковой волны вдоль кортикального слоя в виде интегрального показателя Z-скор (число стандартных отклонений от среднего для данной возрастной группы), который рассматривается как норма при отклонении менее чем на 1 SD, как сниженный - при снижении более чем на 1 SD.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel for Windows 2007 и SPSS 20.0. Использовали двусторонний критерий Фишера. Для выявления риска снижения КП использовали формулу расчета относительного риска при помощи программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия). Риск снижения КП оценивали в значениях показателя соотношения шансов (odds ratio -OR). OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию (фактор повышенного риска) и OR<1 - как отрицательную ассоциацию (фактор пониженного риска). Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Результаты
Изучение КП у женщин, дошкольников и школьников с помощью ультразвукового денситометра показало значительную распространенность ее снижения у обследованных женщин и детей. Нормальные значения КП (Z-скор>-1) имели место лишь у 40% женщин, 46% дошкольников и 52% школьников; значительно сниженные (Z-скор<-2) - у 10% женщин, 23% дошкольников и 16% школьников. Для оценки ассоциации полиморфизма rs11801197 гена CALCR со снижением КП у детей и женщин Москвы и в соответствии с показателями Z-скор все обследованные были разделены на 2 группы: лица с Z-скор>-2 и с Z-скор<-2.
Средние показатели Z-скор в подгруппах обследованных женщин и детей представлены в табл. 1.
Примечательно, что, как видно из данных табл. 1, показатель Z-скор у беременных и кормящих женщин несколько ниже по сравнению с таковым у небеременных женщин, что, по всей видимости, отражает вклад физиологического состояния в снижение МПК женщин.
Результаты изучения частоты встречаемости генотипов и аллелей генетического полиморфизма rs11801197 гена CALCR у всех обследованных детей и женщин приведены в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, в обследованной нами когорте преобладает генотип ТС, частоты генотипов СС и ТТ одинаковы. Одинаково и распределение частот аллелей С и Т. Частота встречаемости аллеля С согласуется с данными лаборатории "ИНВИТРО" - 46-58% [19].
Результаты изучения частот генотипов и аллелей полиморфизма rs11801197 гена CALCR у московских женщин при различном уровне КП приведены в табл. 3.
Как видно из данных табл. 3, у обследованных женщин с КП Z>-2 все генотипы полиморфизма rs11801197 гена CALCR представлены примерно с одинаковой частотой. Частота аллелей С и Т также одинакова и составляет 50%, что совпадает с данными, полученными нами для всей обследованной когорты, включающей женщин и детей (см. табл. 2). Таким образом, частота генотипа СС (33%), выявленная нами у женщин Московского региона, намного выше, чем его частота у женщин во Франции и Италии [13, 17].
)
Установлена статистически достоверная положительная ассоциация аллеля С с риском снижения КП у всех обследованных женщин (OR=2,034 при р=0,02). Однако положительная ассоциация аллеля С с риском снижения КП у отдельных категорий обследованных женщин - небеременных, беременных и кормящих женщин, статистической достоверности не достигала.
Результаты изучения частоты генотипов и аллелей полиморфизма rs11801197 гена CALCR у московских детей при разном уровне их КП приведены в табл. 4.
Как видно из данных табл. 4, в группе дошкольников с показателями КП Z-скор>-2 преобладает генотип ТТ в отличие от всей когорты обследованных. При снижении КП у дошкольников до уровня Z-скор<-2 наблюдалось увеличение частоты аллеля С и генотипа СС с параллельным снижением частоты аллеля Т и генотипа ТТ. Как и у обследованных женщин, обнаружена положительная ассоциация аллеля С с риском снижения КП (OR=1,880 при р=0,104), однако не достигающая степени достоверности.
)
У обследованных нами детей школьного возраста с уровнем КП Z-скор>-2 в отличие от женщин и детей дошкольного возраста преобладающим является генотип ТС при примерно одинаковой частоте генотипов СС и ТТ. Частоты аллелей С и Т при этом близки и совпадают с данными литературы [19].
Обратная ассоциация аллеля С c риском снижения КП не достигала уровня статистической значимости. Таким образом, нами не было выявлено связи аллеля С с риском снижения костной прочности у детей школьного возраста.
Обсуждение
В нашем исследовании была изучена КП у женщин и детей Московского региона методом ультразвуковой денситометрии, проанализирован ее уровень при различных физиологических состояниях (беременность, лактация) у женщин детородного возраста и в разном возрасте у детей (дети дошкольного и школьного возраста).
Установлено, что у 10% женщин, 23% дошкольников и 16% школьников значения КП значительно снижены (Z-скор<-2).
Одновременно мы провели генотипирование всех участников исследования по полиморфизму rs1801197 гена CALCR. В обследованной когорте жителей Московского региона (женщин и детей обоих полов) преобладающим является генотип ТС (38%), частоты генотипов СС и ТТ одинаковы (31%).
По частоте встречаемости генотипа ТС изученного полиморфизма гена CALCR наши данные согласуются с данными лаборатории "ИНВИТРО" и с данными литературы для европейской популяции [13, 17, 19]. В то же время частота генотипа СС (31%) у них существенно превышает таковую для европейской популяции (от 6,5 до 20%) [10, 13, 17, 19]. Учитывая то обстоятельство, что в обследованную нами когорту вошли и представители европейской и представители азиатской популяции, выявленные частоты генотипов СС и ТТ на уровне 31°%, по всей видимости, отражают смешанный характер обследованной популяции.
Расчет OR при носительстве аллеля С полиморфизма rs1801197 гена CALCR показал достоверное увеличение риска снижения КП у обследованных женщин в 2,034 раза (р=0,02). Полученные нами данные у лиц, проживающих в Московском регионе, совпадают с данными литературы [9, 18, 19] и с учетом данных ультразвуковой денситометрии прямо указывают на то, что аллель С является аллелем риска, а носители этого аллеля полиморфизма rs1801197 гена CALCR имеют более высокий риск снижения КП. Обращает на себя внимание существенно более высокая частота генотипа СС у женщин Московского региона (31%) по сравнению с таковой у жительниц Франции (6,5%) [17] и Италии (20%) [13], а также женщин Северо-Западного региона РФ (8,4%) [10]. По всей видимости, миграционные процессы привели к обогащению генофонда Центрального округа генотипами, характерными в большей степени для азиатской популяции. Двукратное увеличение при этом риска снижения КП указывает на необходимость проведения адресной профилактической работы по укреплению костного здоровья женщин - носителей аллеля С и представительниц азиатской этнической принадлежности.
Важно отметить при этом выявленное нами по показателям ультразвуковой денситометрии снижение уровня КП у беременных и кормящих женщин по сравнению с небеременными женщинами (см. табл. 2). При этом наиболее высокое OR при носительстве аллеля С наблюдалось у небеременных женщин (OR=6,905, p=0,09 при n=28). Величина OR, оставаясь >1, снижалась у беременных и кормящих женщин (OR=1,902, p=0,09 при n=96 и OR=1,308, p=0,731 при n=29 соответственно), что может свидетельствовать как о влиянии таких физиологических состояний, как беременность и кормление грудным молоком, связанных с необходимостью обеспечения интенсивных процессов роста и развития костной ткани плода и новорожденного ребенка, на снижение уровня КП в организме женщины, так и снижение связи генетических факторов с КП при этих состояниях.
При изучении частот встречаемости генотипов полиморфизма rs1801197 гена CALCR у дошкольников в зависимости от уровня КП было выявлено, что они сходны с частотой встречаемости этих генотипов у обследованных женщин. Расчет OR при наличии аллеля С показывает увеличение риска снижения КП почти в 1,9 раза, не достигая, однако, уровня статистической значимости (p=0,104).
У школьников же распределение аллелей СиТ и генотипов отличалось от такового у женщин и детей дошкольного возраста. Выявлена обратная ассоциация аллеля С c риском снижения КП (OR=0,866 при р=0,595), не достигающая, однако, степени достоверности. Отсутствие связи аллеля С с риском снижения КП у школьников, возможно, так же как и беременность и кормление грудным молоком, отражает более выраженное, чем генетическая предрасположенность, влияние физиологического состояния, а именно начало пубертата у части обследованных школьников, на уровень их КП.
Заключение
Таким образом, выявлено существенное снижение уровня КП у женщин и детей Московского региона.
Установлено, что аллель С полиморфизма rs1801197 гена CALCR является аллелем риска снижения КП (OR=2,034 при р=0,02) у всех обследованных нами женщин и на уровне тенденции у детей дошкольного возраста в Московском регионе.
Частота встречаемости генотипа СС полиморфизма rs1801197 гена CALCR у женщин и детей Московского региона (31%) существенно превышает частоту встречаемости данного генотипа в Европейском регионе (6,5-20%), что может свидетельствовать об увеличении риска развития остеопороза у жителей Московского региона - носителей аллеля С.
У детей школьного возраста, беременных и кормящих женщин не выявлено ассоциации полиморфизма rs1801197 гена CALCR с риском снижения КП.
Риск развития снижения КП у носителей аллеля С полиморфизма rs1801197 гена CALCR зависит от физиологического состояния (беременность, лактация, пубертат).
Литература
1. NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis Prevention, Diagnosis and Therapy. Osteoporosis prevention, diagnosis, and therapy // JAMA. 2001. Vol. 285, N 6. P. 785-795.
2. Nguyen T., Sambrook P., Kelly P. et al. Prediction of osteoporotic fractures by postural instability and bone density // BMJ. 1993. Vol. 307, N 6912. P. 1111-1115.
3. Gueguen R., Jouanny P., Guillemin F. et al. Segregation analysis and variance components analysis of bone mineral density in healthy families // J. Bone Miner. Res. 1995. Vol. 10, N 12. P. 2014-2022.
4. Sangalli A., Malerba G., Xumerle L. et al. Linkage and association analysis of estrogen receptor α, collagen type I, calcitonin receptor, and vitamin В receptor genes with bone mineral density in Italian families // Курский научно-практический вестник "Человек и здоровье". 2011. № 2. C. 22-29.
5. Styrkarsdottir U., Cazier J.B., Kong A. Linkage of osteoporosis to chromosome 20p12 and association to BMP2 // PLoS Biol. 2003. Vol. 1. P. 351-360.
6. Батурин А.К., Сорокина Е.Ю., Погожева А.В., Тутельян В.А. Генетические подходы к персонализации питания // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 6. С. 4-11.
7. Yong-Jun Liu, Hui Shen, Peng Xiao et al. Molecular genetic studies of gene identification for osteoporosis: A 2004 Update // J. Bone Miner. Res. 2006. Vol. 21, N 10. P. 1511-1535.
8. Xiong Q., Xin L., Zhang L., Mao Z., Tang P. Association between calcitonin receptor AluI gene polymorphism and bone mineral density: A meta-analysis // Exp. Ther. Med. 2015. Vol. 9, N 1. P. 65-76.
9. Зиновьева А.И., Атрушкевич В.Г., Поляков А.А. и др. Генетические параллели в мультифакторных моделях пародонтита с агрессивным течением и остеопороза // Рос. стоматология. 2011. № 6. С. 34-40.
10. Москаленко М.В. Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека : автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб., 2011. 19 с.
11. Purdue B.W., Tilakaratne N., Sexton PM. Molecular pharmacology of the calcitonin receptor // Receptors Channels. 2002. Vol. 8, N 3-4. P. 243-255.
12. Booe J.M., Walker C.S., Barwell J., Kuteyi G., Simms J., Jam-aluddin M.A. et al. Structural basis for receptor activity-modifying protein-dependent selective peptide recognition by a G protein-coupled receptor // Mol. Cell. 2015. Vol. 58, N 6. P. 10401052.
13. Masi L., Becherini L., Gennari L. et al. Allelic variants of human calcitonin receptor: distribution and association with bone mass in postmenopausal Italian women // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 245, N 2. P. 622626.
14. Nakamura M., Zhang Z., Shan L., Hisa T., Sasaki M., Tsukino R. et al. Allelic variants of human calcitonin receptor in the Japanese population // Hum. Genet. 1997. Vol. 99, N 1. P. 38-41.
15. Ross P.D., Fujiwara S., Huang C., Davis J.W., Epstein R.S., Wasnich R.D. et al. Vertebral fracture prevalence in women in Hiroshima compared to Caucasians or Japanese in the US // Int. J. Epidemiol. 1995. Vol. 24, N 6. P. 1171-1177.
16. Zhao H.Y., Liu J.M., Ning G., Zhang L.Z., Jiang L., Dai M. et al. Association of calcitonin receptor gene polymorphism with bone mineral density in Shanghai women // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2003. Vol. 25, N 3. P. 258-261.
17. Taboulet J., Frenkian M., Frendo J.L., Feingold N., Julliene A., Vernjoul M.C. Calcitonin receptor polymorphism is associated with a decreased fracture risk in post-menopausal women // Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7, N 13. P. 2129-2133.
18. Мальцев А.В. Исследование генетических факторов развития постменопаузального остеопороза в Волго-Уральском регионе : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Уфа, 2014, 24 с.
19. URL: https://www.invitro.ru/
20. Шилина Н.М., Сорокина Е.Ю., Иванушкина Т.А., Сафронова А.И., Гмошинская М.В., Конь И.Я. Изучение полиморфизма rs1800012 гена alpha1-цепи коллагена 1-го типа у женщин и детей г. Москвы с различным уровнем костной прочности // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 74-82.