Расширение ассортимента отечественных продуктов, в том числе специализированного назначения, -одна из приоритетных задач пищевой и перерабатывающей промышленности, что определяется указами Президента РФ и постановлениями Правительства РФ [1]. Основное внимание направлено на обеспечение качества и безопасности разрабатываемой продукции, формирующей здоровье нации [2].
Одной из востребованных групп продуктов функционального назначения являются тонизирующие напитки, объем производства которых неуклонно растет как в нашей стране, так и за рубежом. Отличительная особенность безалкогольных тонизирующих напитков -их способность оказывать стимулирующее действие на организм человека в целом и на функциональную активность отдельных органов и тканей [3]. В частности кофеин способен улучшать настроение и когнитивные функции [4], а экстракт женьшеня оказывает модулирующее действие на фагоцитарную активность лейкоцитов, пролиферацию лимфоцитов и выработку антител [3, 5]. Являясь адаптогенным средством растительного происхождения, препараты женьшеня оказывают стимулирующее воздействие на центральную нервную систему и метаболические процессы в организме, поэтому они широко используются для повышения умственной и физической работоспособности, лечения амнезии [6], улучшения мнестических процессов при старении и ишемических повреждениях головного мозга [7, 8].
Однако, несмотря на широкое применение тонизирующих компонентов женьшеня и многочисленные исследования, остается нерешенным вопрос о безопасности длительного употребления тонизирующих напитков, содержащих растительные адаптогены. В связи с этим необходима не только оценка влияния на организм, отдельные органы и ткани разового употребления определенных доз и концентраций тонизирующих напитков, более актуальна разработка способов прогнозирования безопасности длительного употребления различных доз тонизирующих напитков, в частности прогнозирование риска развития цитолиза в различных органах и тканях.
Цель исследования - оценить риск развития цитолиза в сердце, печени, головном мозге и скелетных мышцах при длительном употреблении тонизирующего напитка с экстрактом женьшеня и возможность его математического прогнозирования.
Материал и методы
Исследование выполнено на половозрелых крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 461±23 г (n=30) в соответствии с принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) о гуманном обращении с животными, используемыми для экспериментов или в иных научных целях.
Животные были разделены на 2 группы: опытную (n=15) и контрольную (n=15), животным которой вместо тонизирующего напитка вводили соответствующий объем водопроводной воды, очищенной с помощью бытового фильтра "Барьер".
Тонизирующие напитки готовили в соответствии с ГОСТ Р 52844-2007 с использованием сухого экстракта женьшеня (ЗАО "Лекарственные травы", РФ). Приготовленный напиток, содержащий 46 мг/л панаксозидов, вводили из расчета 15 мкг на 1 кг массы тела глоточным зондом троекратно (в 9.00, 13.00 и 17.00 ч) ежедневно на протяжении 21 сут.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации после предварительной ингаляции диэтилового эфира. Смешанную кровь отбирали в стерильные пробирки с ЭДТА-К3 и центрифугировали (10 мин, 4000 об/мин, центрифуга СМ-12 с угловым ротором с крутящим моментом 2100g). До проведения анализа плазму крови хранили (3-5 сут) в морозильной камере при -18 °С. Плазма подвергалась только однократному замораживанию-оттаиванию.
Активность ферментов - маркеров цитолиза определяли спектрофотометрически на СФ-2000 (ЗАО "ОКБ Спектр", РФ) при 37 °С с использованием наборов реактивов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) (ООО "Ольвекс Диагностикум", РФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (АО "ДИАКОН-ДС", РФ) и креатинкиназы (КК) ("HUMAN", Германия).
Прогноз риска развития цитолиза при длительном употреблении тонизирующего напитка с экстрактом женьшеня оценивали методом трехфакторного регрессионного анализа с построением математической модели средствами пакета анализа в Microsoft Office Excel 2010, который позволяет:
1. Производить расчет различного вида регрессионных моделей.
2. Проверять гипотезу адекватности модели имеющимся наблюдениям.
3. Использовать модель для прогнозирования значений зависимой переменной при новых значениях независимой переменной.
Результаты и обсуждение
При употреблении крысами тонизирующего напитка с экстрактом женьшеня в течение 21 сут не произошло таких изменений активности аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и кератинкиназы (КК), которые отражают цитолиз (табл. 1), что свидетельствует о биологической безопасности длительного употребления данного напитка. Это подтверждается также отсутствием достоверных различий активности ферментов -маркеров цитолиза с таковыми у животных контрольной серии, которые вместо тонизирующего напитка получали очищенную воду.
)
Однако, несмотря на отсутствие различий, нельзя с полной уверенностью исключить возможность развития цитолиза при других вариантах потребления тонизирующих напитков, так как при повышении концентрации или объема потребляемого напитка вследствие увеличения стимулирующего действия возможно такое возрастание функциональной активности гепатоцитов, кардиомиоцитов, клеток крови, головного мозга и скелетных мышц, которое может привести к их цитолизу. Поэтому для математической оценки прогноза развития цитолиза с использованием математических моделей была выбрана модель, в которой в качестве функции отклика определяется общая активность ЛДГ.
При этом авторы исходили из того, что ЛДГ является внутриклеточным ферментом, который имеется практически во всех клетках организма, но представлен в них в виде пяти различных изоферментов с достаточно выраженной тканевой и органной специфичностью. Повышение в крови активности изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2 отражает преимущественно цитолиз кардиомиоцитов, ЛДГ3 - клеток легочной ткани, ЛДГ4 и ЛДГ5 - гепатоцитов и скелетных мышц. Эти свойства отличают ЛДГ как фермент -маркер цитолиза от других ферментов-маркеров с более узкой специфичностью. Поэтому представлялось целесообразным оценить корреляционную зависимость между изменениями общей активности ЛДГ как интегрального маркера цитолиза и активности других маркеров (АЛТ, АСТ и КК) при длительном потреблении тонизирующего напитка с экстрактом женьшеня.
Построение трехфакторной модели сводится к выводу нелинейного уравнения регрессии, которое определяет эмпирическую зависимость функции отклика общей активности ЛДГ (Y) от независимых факторов активности ферментов АЛТ (X1), АСТ (Х2), КК (Х3) и их взаимодействий. Вид и численные значения параметров уравнения регрессии устанавливают с помощью метода наименьших квадратов отклонений эмпирических данных от выравненных (восстановленных модельных данных).
Факторный эксперимент характеризуется количественными показателями, выраженными в Ед/л: X1 - АЛТ; Х2 - АСТ; Х3 - КК; функция отклика Y - ЛДГ (табл. 2). Целью регрессионного анализа является определение такого сочетания факторов Х1, Х2, Х3, при котором значение функции отклика принимает значение в референтных пределах.
В результате моделирования уравнение изменения активности ЛДГ у крыс, потреблявших тонизирующий напиток с женьшенем, имеет вид:
Y = 9,19X1 + 1659,88X2 - 3,75X3 - 0,55Х23 - 34977,11;
31,4≤X1≤34,6; 29,7≤X2≤33,3; 10≤X3≤15.
Регрессионная статистика дала высокую оценку качества модели. Значение множественного коэффициента детерминации R2=0,97 показывает, что 97% общей вариации активности ЛДГ у крыс объясняется вариацией факторных признаков. Выбранные факторы оказывают существенное влияние на изменение ЛДГ у крыс. Уровень значимости 3х108 подтверждает значимость коэффициента детерминации и уравнения изменения активности ЛДГ у крыс, потреблявших тонизирующий напиток с экстрактом женьшеня.
Показатель средней ошибки аппроксимации 3,49% характеризует достаточно высокую адекватность полученного уравнения. Отметим статистическую значимость всех параметров: стандартные ошибки параметров уравнения меньше соответствующих коэффициентов.
Таким образом, полученная модель позволяет адекватно оценить изменение активности ЛДГ у крыс, потреблявших тонизирующий напиток с экстрактом женьшеня, при изменении факторов в референтных диапазонах (рис. 1).
)
Поверхность отклика позволяет сделать вывод, что у крыс, потреблявших тонизирующий напиток с экстрактом женьшеня, значения ЛДГ изменяются в пределах референтных значений (170-480 Ед/л).
Для определения максимального (минимального) значения ЛДГ в областях изменения активности ферментов АСТ, АЛТ, КК решалась задача нелинейного программирования методом обобщенного приведенного градиента:
Y=9,19X1+1659,88X2-3,75X3 -0,55X23-34977,11→max (min);
31,4≤X1≤34,6; 29,7≤X2≤33,3; 10≤X3≤15.
В результате наибольшее значение активности ЛДГ у крыс при длительном потреблении тонизирующего напитка по оценке полученной модели состав ит 423,9 Ед/л при активности ферментов АЛТ - 34,6 Ед/л, АСТ -31,7 Ед/л, КК - 10 Ед/л. Наименьшее значение активности ЛДГ по полученной модели составит 170 Ед/л при уровне АЛТ - 31,4 Ед/л, АСТ - 29,7 Ед/л, КК 15 Ед/л.
Наибольшее влияние на изменения активности ЛДГ оказывает изменение активности АСТ, увеличение активности АЛТ приводит к увеличению активности ЛДГ, тогда как КК оказывает противоположное действие: увеличение активности КК приводит к снижению активности ЛДГ.
Аналогичным образом проводили построение математической модели для животных контрольной группы (рис. 2).
В результате моделирования уравнение изменения активности ЛДГ у крыс контрольной группы, потреблявших воду, имеет вид:
Y=21,72X1+238,1X2+2,12X3 -0,09Х23-5187,01;
33,7≤X1≤34,3; 29,9≤X2≤31,5; 11≤ X3≤15.
Поверхность отклика позволяет сделать вывод, что у крыс контрольной группы значения ЛДГ варьируют в меньшем диапазоне (270-305 Ед/л).
При решении задачи нелинейного программирования методом обобщенного приведенного градиента наибольшее значение активности ЛДГ у крыс контрольной группы по полученной модели составит 304,9 Ед/л при активности ферментов АЛТ - 34,3 Ед/л, АСТ -29,9 Ед/л, КК - 15 Ед/л. Наименьшее значение активности ЛДГ по полученной модели составит 270 Ед/л при активности АЛТ - 33,7 Ед/л, АСТ - 31,5 Ед/л, КК - 11 Ед/л.
Таким образом, длительное потребление (21 день) тонизирующего напитка с экстрактом женьшеня не сопровождается патогенетически значимым увеличением цитолиза, оцениваемого по изменению активности в крови ферментов - маркеров цитолиза АЛТ, АСТ, КК и ЛДГ в сердце, печени, мозге и скелетных мышцах. Это совпадает с оценкой прогноза цитолиза с помощью трехфакторных математических моделей. Вместе с тем разработанные математические модели позволили установить, что при изменении режима дозирования и концентрации напитка возможно повышение активности ЛДГ, соответствующее таковому при цитолизе.
Литература
1. Тутельян В.А., Смирнова Е.А. Роль пищевых ингредиентов в создании современных продуктов питания // Пищевые ингредиенты в создании современных продуктов питания : монография (сборник статей) / под ред. В.А. Тутельяна, А.П. Нечаева. М. : ДеЛи плюс, 2014. С. 10-24.
2. Покровский В.И., Романенко Г.А., Княжев В.А., Герасименко Н.Ф., Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. и др. Политика здорового питания. Федеральный и региональный уровни : монография. Новосибирск : Сибир. унив. изд-во, 2002. 344 с.
3. Rajput Z.I., Hu S., Xiao C. et al. Adjuvant effects of saponins on animal immune responses // J. Zhejiang Univer. Sci. B. 2007. Vol. 8, N 3. P. 153-161.
4. Застрожин М.С., Дрожжина Н.А. Эпидемиологические аспекты потребления энергетических напитков на территории Российской Федерации // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 2. С. 19-24.
5. Scaglione F., Ferrara F., Dugnani S. et al. Immunomodulatory effects of two extracts of Panax ginseng C.A. Meyer // Drugs Exp. Clin. Res. 1990. Vol. 16, N 10. P. 537-542.
6. Tohdaa C., Kuboyamaa T., Komatsua K. et al. Search for natural products related to regeneration of the neuronal network // Neurosignals. 2005. Vol. 14. P. 34-45.
7. Zhong Y. M., Nishijo H., Uwano T. et al. Ginseng ameliorated place navigation deficits in young rats with hippocampal lesions and aged rats // Physiol. Behav. 2000. Vol. 69. P. 511-525.
8. Mook-Jung I., Hong H.S., Boo J.H. et al. Ginsenoside Rb1 and Rg1 improve spatial learning and increase hippocampal synaptophysin level in mice // J. Neurosci. Res. 2001. Vol. 63. P. 509-515.