Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) в настоящее время являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в развитых и развивающихся странах: на их долю приходится более 70% летальных исходов [1, 2]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в Плане действий по осуществлению Глобальной стратегии профилактики и борьбы с неинфекционными заболеваниями обращает внимание на быстроту, с которой ССЗ негативно влияют на состояние здоровья и трудоспособность населения [3]. Растущую значимость для общественного здравоохранения в последние десятилетия приобретает метаболический синдром (МС) в связи с высоким риском развития у таких пациентов ССЗ и сахарного диабета типа 2 [4].
В соответствии с современными представлениями, МС - кластер сложных кардиометаболических нарушений, таких как гипергликемия, дислипидемия, воспаление, абдоминальное ожирение, коагулопатии и артериальная гипертензия (АГ), наличие которых повышает риск развития ССЗ [5, 6]. Взаимосвязь между чувствительностью к инсулину, ожирением и гомеостазом глюкозы была впервые обнаружена шведским врачом E. Kylin, который описал синдром, включающий гипергликемию, АГ и гиперурикемию, и предложил резистентность к инсулину в качестве возможной причины [7]. На основании вышеуказанных критериев почти 30% взрослого населения планеты и 45% лиц старше 60 лет имеют МС [8]. По статистике, МС удваивает риск развития ССЗ в течение ближайших 5-10 лет, также у таких пациентов увеличивается уровень смертности от ССЗ [6-10]. Наряду с высокой распространенностью ССЗ пациенты с МС более подвержены риску развития сахарного диабета типа 2, синдрома поликистозных яичников, жирового гепатоза, бронхиальной астмы, некоторых опухолей, таких как рак молочной, поджелудочной и предстательной желез [11, 12]. Поэтому главной медико-социальной задачей в настоящее время является своевременное выявление МС, а также ранняя коррекция его возможных проявлений и осложнений.
Накопление жировых клеток приводит к нарушению регуляции образования адипокинов, которые запускают развитие МС. В настоящее время механизм, посредством которого накопление жировой ткани проясняет дизрегуляцию, изучен не до конца. Однако доказано, что частично это происходит из-за системного окислительного стресса [13]. Малоновый диальдегид, конечный продукт перекисного окисления липидов (ПОЛ), который повышается в отмеченных условиях ожирения и резистентности к инсулину, способен усиливать экспрессию провоспалительных цитокинов, что приводит к субклиническому воспалению и системному повреждению [14]. В связи с указанным вариантом развития актуальным профилактическим и лечебным методом воздействия является использование у пациентов с МС препаратов с высоким содержанием полифенолов, известных своими антиоксидантными возможностями [15]. В связи с этим цель исследования - изучить влияние полифенольных продуктов переработки винограда на клинические параметры, а также активность неспецифических протеиназ и показатели ПОЛ в крови при моделировании МС у экспериментальных животных.
Материали методы
Исследование проведено в эксперименте на 54 белых крысах-самцах с исходной массой тела 190-210 г (возраст - 10-12 нед). Исследование проведено в соответствии с Положением об этических принципах. Для моделирования МС использовали модель с кормлением фруктозой [16]. Экспериментальные животные получали 10% раствор фруктозы в качестве питьевой воды в течение 8 нед наряду с приемом стандартной пищи. Контроль (n=12) составили животные, которые в течение этого же периода употребляли обычную воду. Выбор самцов в качестве объекта исследования обусловлен тем, что самки крыс имеют более низкую склонность к формированию МС, которая связана с гормональным статусом, низкой скоростью липогенеза, а также более высоким митохондриальным окислительным потенциалом [17].
У животных в динамике (1 раз в 2 нед определяли) массу тела и окружность живота на уровне середины туловища для оценки степени абдоминального ожирения и сравнения с контрольной группой. Кровь для подтверждения МС брали в начале эксперимента, через 2, 4, 6 и 8 нед из хвостовой вены у животных контрольной и экспериментальных групп [определяли в сыворотке крови уровень глюкозы, холестерина, триглицеридов, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП)]. Выбор сроков исследования согласуется с данными литературы по моделированию экспериментального МС [18]. Заключительный сравнительный анализ проводили через 8 нед от начала эксперимента (в эти строки осуществляли эвтаназию): к вышеописанным параметрам дополнительно определяли массу абдоминальной жировой клетчатки и внутренних органов (печени и почек).
Начиная с 5-й недели МС крысам ежедневно перорально вводили концентраты полифенольных соединений ФЭНОКОР, ЭНОАНТ и экстракт полифенолов винограда (ЭПВ) в дозе 2,5 мл/кг (в среднем 0,05 мл/ животное) вместе с водой (0,05 мл). Вышеуказанные продукты переработки винограда представляют собой пищевые концентраты полифенолов винограда сорта "Каберне-совиньон", выращиваемого в Крыму. Крысам контрольной группы и с МС без введения препаратов в те же сроки вводили воду в соответствующем объеме (0,1 мл). Были сформированы следующие группы: контрольная (обычный режим), с МС 8 нед (n=12), 1-я - МС + ЭНОАНТ (n=10), 2-я - МС + ЭПВ (n=10), 3-я - МС + ФЭНО-КОР (n=10). Суточное поступление суммы полифенолов из расчета на одно животное составило: в 1-й группе -1 мг, во 2-й группе - 1,1 мг, в 3-й группе - 4 мг.
Определение трипсино- (ТПА) и эластазоподобной активности (ЭПА) неспецифических протеиназ и их тканевых ингибиторов - кислотостабильных ингибиторов (КСИ) проводили энзиматическими методами в сыворотке крови крыс [19].
Состояние процессов ПОЛ в сыворотке крови оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов (ТБК-АП), уровень которых определяли по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в присутствии ионов Fe3+ [20]. Изучение антиоксидантного гомеостаза крови включало оценку уровня церулоплазмина (ЦП) и активности супероксиддисмутазы (СОД) [21].
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием методов вариационной статистики и непараметрического критерия Томпсона и f-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
У животных экспериментальной группы использование 10% раствора фруктозы в течение 2 мес от начала эксперимента сопровождалось развитием МС (рис. 1).
)
Об этом свидетельствовало увеличение окружности живота, которая была достоверно выше исходных значений на 25%. Отмечались также более высокие по сравнению с исходными параметрами концентрации глюкозы и триглицеридов. Так, через 2 мес регулярного применения 10% раствора фруктозы взамен питьевой воды гликемия крови крыс возрастала на 68% (табл. 1), а уровень триглицеридов в крови повышался на 54%.
У экспериментальной группы крыс с моделью МС имели место достоверно большая масса жировой клетчатки и висцеральных органов: на 25% выше контрольных параметров, масса тела и уровень общего холестерина. Через 8 нед применения фруктозы масса тела животных экспериментальной группы достоверно возросла на 12% (см. рис. 1). На фоне увеличения концентрации атерогенных триглицеридов у крыс с МС наблюдалось снижение антиатерогенных липопротеинов - ЛПВП, уровень которых через 2 мес от начала эксперимента снизился на 22% (см. табл. 1).
)
Использование раствора фруктозы экспериментальными животными в течение 8 нед вместо питьевой воды способствовало достоверному росту ТПА на 20% (рис. 2). ЭПА при этом также увеличивалась на 18%. Ингибиторный потенциал при экспериментальном МС сохранялся на достаточно высоком уровне. В частности уровень КСИ был на 32% выше контрольных значений.
)
При экспериментальном МС произошла активация ПОЛ крови крыс: имел место рост уровня ТБК-активных продуктов на 50% в сравнении с аналогичным показателем у интактных животных (рис. 3). Наряду с увеличением вторичных продуктов ПОЛ наблюдался рост концентрации ЦП в сыворотке крови на 38% в сравнении с показателем контроля.
Моделирование МС в эксперименте сопровождалось снижением активности локальных антиокислительных ферментов. Активность СОД при экспериментальном МС уменьшалась на 15%, что, по-видимому, свидетельствует об усиленном расходовании антиоксидантов для предотвращения чрезмерного накопления свободных радикалов кислорода.
Таким образом, результаты эксперимента продемонстрировали рассогласованность в системах протеазы-ингибиторы протеиназ и продукты ПОЛ-антиоксиданты, что может быть ключевым фактором повреждения при МС. Активированные протеиназы способны разрушать коллаген и эластин, приводят к преждевременному старению, АГ и прогрессированию атеросклеротических эффектов в артериальной стенке. На этом фоне дополнительная активация ПОЛ создает провоспалительную микросреду, которая модифицирует внеклеточный матрикс, облегчает ремоделирование (способствует фиброзу и кальцинозу), что, в свою очередь, тесно связано с уменьшением эндотелиальной вазодилатации и увеличением жесткости.
Выявленный в данном исследовании дисбаланс стал основой для пересмотра терапевтической стратегии, в качестве основной цели которой было выбрано ингибирование протеолитических ферментов и избытка свободных радикалов полифенольными продуктами переработки винограда.
Следует отметить, что использование полифенольных концентратов при МС в эксперименте способствовало обратному развитию его ключевых клинических признаков у животных по сравнению с группой без применения комплексов. Так, через 4 нед применения полифенольных комплексов масса тела животных с моделью МС практически не отличалась от исходных значений (см. рис. 1). Аналогичная динамика наблюдалась и в отношении окружности живота и массы абдоминальной жировой клетчатки и висцеральных органов. Также наблюдались достоверно более низкие значения содержания глюкозы и общего холестерина на фоне увеличения уровня ЛПВП (см. табл. 1). Выявленные положительные свойства полифенольных комплексов из продуктов винограда позволяют рассматривать их в качестве агентов, модифицирующих течение МС.
Использование при МС полифенольных продуктов в 1-й группе достоверно уменьшало активность трипсиноподобных протеаз на 14% по сравнению с животными, которые не получали продукт, при этом уровень ТПА был незначительно выше контрольных параметров (см. рис. 2). ЭПА в 1-й группе снижалась на 8%, однако эти изменения не достигали уровня статистической значимости. Во 2-й группе антипротеазная активность была выражена в большей степени. Так, во 2-й группе применение полифенолов способствовало понижению активности трипсиноподобных протеиназ на 18%. ЭПА также уменьшалась более значительно: на 13% ниже уровня животных с МС без применения полифенолов. Наиболее эффективным в отношении снижения протеолитической активности было использование продукта с большим содержанием полифенолов в 3-й группе. Снижение ТПА и ЭПА превысило 20%, при этом активность обеих протеаз была ниже, чем у животных с МС без коррекции. Следовательно, использование продуктов переработки винограда, насыщенных полифенольными соединениями, способствовало нормализации протеаз крови экспериментальных животных.
Положительные эффекты богатых полифенолами концентратов винограда были выявлены и в отношении повышения ингибиторного потенциала сыворотки крови крыс, хотя их эффективность была различной (см. рис. 2). Так, в 1-й и 2-й группах введение полифенолов незначительно увеличивало уровень КСИ. В 3-й группе использование более высоких доз полифенолов было значительно более эффективным и способствовало достоверному увеличению уровня КСИ на 21% по сравнению с показателями животных с МС без коррекции.
Полифенольные продукты переработки винограда оказывали положительное влияние на состояние окислительно-антиоксидантного гомеостаза при экспериментальном МС (см. рис. 3). Так, в 1-й группе имело место достоверное понижение уровня вторичных продуктов ПОЛ на 19%. Во 2-й группе снижение уровня ТБК-активных продуктов было более выраженным - на 30% ниже показателей животных, не получавших лечение. Как и в отношении показателей протеолиза, наибольшее влияние на уровень ТБК-активных продуктов наблюдалось в 3-й группе: снижение составило 34%, т.е. было несколько ниже контрольных параметров.
Применение продуктов переработки винограда при МС в 1-й группе достоверно повышало активность СОД на 14%, во 2-й группе - на 24% по сравнению со значениями у экспериментальных животных с МС, не получавших полифенолы. Использование продуктов переработки винограда в 3-й группе сопровождалось более значительными изменениями активности СОД, которая была на 38% выше, чем показатель у животных без коррекции. При МС введение полифенолов в 1-й и во 2-й группах незначительно увеличивало уровень ЦП крови по сравнению с животными, не получавшими препараты. При экспериментальном МС наблюдалось уменьшение активности СОД на фоне увеличения уровня ЦП, в 3-й группе обнаруживалось некоторое понижение содержания ЦП на фоне активации СОД.
Таким образом, анализ результатов исследования позволяет сделать вывод о том, что использование полифенольных концентратов переработки винограда препятствует активации неспецифических протеаз и активных форм кислорода, а также способствует укреплению ингибиторного и антиокислительного потенциала в условиях моделирования МС.
Полифенолы представляют собой группу химических веществ, широко распространенных в растительном мире и присутствующих в рационе питания людей [22]. Основными источниками полифенолов являются фрукты, овощи и напитки (вино, фруктовые соки, чай, кофе и шоколад). Результаты исследований влияния полифенолов в отношении профилактики развития ССЗ демонстрируют их высокую эффективность в условиях модели атеросклероза благодаря удалению активных форм кислорода, гиполипидемическому и антифибринолитическому действию [23]. На современном этапе установлено, что продукты с высоким содержанием полифенолов играют важную роль в профилактике ССЗ, однако механизмы и молекулярные мишени представляют значительный научный интерес. Актуальность изучения влияния полифенольных продуктов переработки винограда на клинические параметры, а также активность протеаз и показатели ПОЛ при МС тесно связана с ролью МС в структуре заболеваемости и смертности во всем мире [24].
Экспериментальными исследованиями на модели МС у крыс была установлена активация неспецифических протеаз сыворотки крови на фоне изменения ингибиторного профиля. Также была установлена достоверная корреляционная связь между активностью сывороточных протеаз и окружностью живота, что позволяет предположить, что МС способствует активации провоспалительных факторов. Более того, выявленный дисбаланс в системе протеолиза, по нашему мнению, является важнейшим звеном патогенеза различных звеньев МС. Полученные экспериментальные результаты согласуются с данными литературы, согласно которым повышенная протеолитическая активность способствует развитию эндотелиального воспаления, увеличивает сосудистую проницаемость, агрегацию тромбоцитов и создает условия для прогрессирования процессов апоптоза [25]. Кроме того, активация протеаз принимает участие в патогенезе АГ, способствует увеличению содержания активных форм кислорода на фоне снижения биодоступности оксида азота, что в свою очередь усугубляет эндотелиальную дисфункцию [26, 27]. Такое ремоделирование артериальной стенки создает благоприятную почву для ускорения атерогенеза: протеазы способствуют росту и уязвимости бляшек и катализируют прогрессирование атеросклероза [28].
Применение полифенольных продуктов переработки винограда оказывало положительное влияние на протеолитический профиль экспериментальных животных с моделью МС. Наибольший эффект в отношении нормализации протеиназ-ингибиторного дисбаланса продемонстрировал ФЭНОКОР, который превосходил другие концентраты по суммарному содержанию полифенолов.
Наряду с исследованием протеолитической активности нами было проведено изучение состояния процессов ПОЛ, поскольку известно, что у пациентов с высоким кардиоваскулярным риском имеется корреляция между активностью протеиназ и уровнем активных кислородных радикалов [29]. В результате проведенных экспериментов вышеописанный эффекта подтвердился: при МС регистрировали активацию ПОЛ на фоне истощения локального антиокислительного потенциала. Продукты переработки винограда с высоким содержанием полифенолов продемонстрировали выраженную антиоксидантную активность, а также положительное влияние на эндогенный антиоксидантный профиль.
Заключение
Таким образом, полученные в эксперименте данные дополняют современные представления о патогенезе МС. Полученные результаты позволяют предположить хроническое увеличение активности протеаз в качестве центрального звена структурной перестройки артерий, а также других проявлений МС, таких как АГ и атеросклероз. В противоположность этому ингибирование избыточной протеолитической активности позволяет снизить повреждающие эффекты, препятствует свободнорадикальному повреждению и ремоделированию. Протекторные свойства полифенольных комплексов -продуктов переработки винограда - позволяют рассматривать их в качестве факторов, модифицирующих течение МС, благодаря влиянию на центральное звено патогенеза.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Минобрнауки России. Уникальный идентификатор ПНИ RFMEFI60414X0077 при подписании
Соглашения № 14.604.21.0077.
Литература
1. Yusuf S., Reddy S., Ounpuu S., Anand S. Global burden of cardiovascular diseases: Pt II: variations in cardiovascular disease by specific ethnic groups and geographic regions and prevention strategies //Circulation. 2001. Vol. 104, N 23. P. 2855-2864.
2. World Health Organization. Global status report on noncommu-nicable disease 2010. Geneva : World Health Organization, 2011. 176 p.
3. World Health Organization. 2008-2013 Action plan for the global strategy for the prevention and control of noncommunicable diseases // Working in partnership to prevent and control the four noncommunicable diseases - cardiovascular diseases, diabetes, cancers and chronic respiratory diseases and the four shared risk factors - tobacco use, physical inactivity, unhealthy diets and the harmful use of alcohol. Geneva : World Health Organization, 2009. 42 p.
4. Guh D.P., Zhang W., Bansback N. et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and metaanalysis // BMC Public Health. 2009. Vol. 9, N 88. doi: 10.1186/14712458-9-88
5. Eckel R.H., Grundy S.M., Zimmet P.Z. The metabolic syndrome // Lancet. 2005. Vol. 365, N 9468. P. 1415-1428.
6. Grundy S.M. A changing paradigm for prevention of cardiovascular disease: emergence of the metabolic syndrome as a multiplex risk factor // Eur. Heart J. 2008. Suppl. 10B. P. 16-23.
7. Kylin E. Studienuber das hypertonie-hyperglykamie-hyperurikamie-syndrom // Zentrablfinnere Med. Leipz. 1923. Vol. 81. P. 105-127.
8. Alberti K.G., Zimmet P., Shaw J. Metabolic syndrome - a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation // Diabet. Med. 2006. Vol. 23, N 5. P. 469480.
9. Kovell L.C., Ahmed H.M., Misra S. et al. US Hypertension Management Guidelines: A Review of the Recent Past and Recommendations for the Future // J. Am. Heart Assoc. 2015. Vol. 4, N 12. Article ID e002315. doi:10.1161/JAHA.115.002315
10. Dilip C., Cholamugath S., Baby M., Pattani D. Prevalence of cardiovascular risk factors and management practices of acute coronary syndrome in a tertiary care hospital // J. Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 2015. Vol. 26, N 6. P. 547-554.
11. Shin J.A., Lee J.H., Lim S.Y. et al. Metabolic syndrome as a predictor of type 2 diabetes, and its clinical interpretations and usefulness // J. Diabetes Investig. 2013. Vol. 4. P. 334-343.
12. Bhandari R., Kelley G.A., Hartley T.A., Rockett I.R. Metabolic syndrome is associated with increased breast cancer risk: a systematic review with meta-analysis // Int. J. Breast Cancer. 2014. Article ID 189384. doi: 10.1155/2014/189384
13. Furukawa S., Fujita T., Shimabukuro M.et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome // J. Clin. Invest. 2004. Vol. 114, N 12. P. 1752-1761.
14. Raghavan S., Subramaniyam G., Shanmugam N. Proinflammatory effects of malondialdehyde in lymphocytes // J. Leukoc. Biol. 2012. Vol. 92, N 5. P. 1055-1067.
15. Авиздба А.М., Кубышкин А. В., Гугучкина Т.И. и др. Антиокси-дантная активность продуктов переработки красных сортов винограда "Каберне-совиньон", "Мерло", "Саперави" // Вопр. питания. 2016. № 1. С. 99-109.
16. Решетняк М.В., Хирманов В.Н., Зыбина Н.Н. и др. Модель метаболического синдрома, вызванного кормлениемфруктозой: патогенетические взаимосвязи обменных нарушений // Мед. акад. журн. 2011. № 3. С. 23-27.
17. Mukherjee R., Choi J.W., Choi D.K. et al. Gender-dependent protein expression in white adipose tissues of lean and obeserats,fed a high fat diet // Cell Physiol. Biochem. 2012. Vol. 29, N 3-4. P. 617-634.
18. deMoura R.F., Ribeiro C., de Oliveira J.A. et al. Metabolic syndrome signs in Wistar rats submitted to different high-fructose ingestion protocols // Br. J. Nutr. 2009. Vol. 101, N 8. P. 1178-1184.
19. Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. Эластолитическая активность бронхоальвеолярного лаважа при моделировании воспалительного процесса в легких // Укр. бюх1м. журн. 2008. № 1. С. 89-95.
20. Андреева Л.Н. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. 1988. № 11. С. 41-43.
21. Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело. 1983. № 10. С. 30-33.
22. Chen D., Milacic V., Chen M.S. et al. Tea polyphenols, their biological effects and potential molecular targets // Histol. Histopathol. 2008. Vol. 23, N 4. P. 487-496.
23. Vinson J.A., Teufel K., Wu N. Green and black teas inhibit atherosclerosis by lipid, antioxidant, and fibrinolytic mechanisms // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, N 11. P. 3661-3665.
24. Wilson P.W., D'Agostino R.B., Parise H. et al. Metabolic syndrome as a precursor of cardiovascular disease and type 2 diabetes mellitus // Circulation. 2005. Vol. 112, N 20. P. 3066-3072.
25. Nagareddy P.R., Rajput P.S., Vasudevan H. et al. Inhibition of matrix metalloproteinase-2 improves endothelial function and prevents hypertension in insulin-resistant rats // Br. J. Pharmacol. 2012. Vol. 165, N 3. P. 705-715.
26. Odenbach J., Wang X., Cooper S. et al. MMP-2 mediates angiotensin II-induced hypertension under the transcriptional control of MMP-7 and TACE // Hypertension. 2011. Vol. 57, N 1. P. 123-130.
27. Wang M., Kim S.H., Monticone R.E., Lakatta E.G. Matrix metalloproteinases promote arterial remodeling in aging, hypertension, and atherosclerosis // Hypertension. 2015. Vol. 65, N 4. P. 698-703.
28. Sakakura K., Nakano M., Otsuka F.et al. Pathophysiology of atherosclerosis plaque progression // Heart Lung Circ. 2013. Vol. 22, N 6. P. 399-411.
29. Bittner A., Alcaino H., Castro P.F. et al. Matrix metalloproteinase-9 activity is associated to oxidative stress in patients with acute coronary syndrome // Int. J. Cardiol. 2010. Vol. 143, N 1. P. 98-100.