Контроль безопасности и качества пищевой продукции - одно из важнейших и необходимых условий практической реализации политики здорового питания. Перед отечественными специалистами, работающими в области нутрициологии и в первую очередь в области гигиены питания, стоит важная теоретическая и практическая задача - гармонизировать на глобальном уровне требования к безопасности продуктов питания, производимых на пищевых предприятиях [3]. Нередко производство фальсифицированной и контрафактной продукции наряду с намеренным введением потребителя в заблуждение относительно свойств и происхождения продуктов может нанести прямой ущерб здоровью населения [1]. Неправильные и необоснованные сведения изготовителей при маркировании продукции могут касаться как композиционных характеристик, пищевой ценности, так и экономических показателей продовольствия, т.е. непосредственно затрагивать сферу безопасности и законных (личностных) прав потребителей. Фальсификация пищевой продукции животного происхождения может быть, в частности, связана с введением производителем в состав мясного или мясосодержащего продукта растительных компонентов в количествах, не отвечающих регламентированным.
Важнейшими задачами контроля безопасности и качества мясной продукции для выявления возможной фальсификации являются идентификация ее видовой специфичности и количественное определение вводимых производителем растительных компонентов [5].
В предыдущем сообщении [4] нами были представлены данные о разработанном количественном определении содержания соевого белка в колбасных изделиях с помощью непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа (ИФА). Метод количественного определения изолята белков сои (ИБС) в составе мясных консервов принципиально тот же, однако он имеет определенные отличия. Они связаны с тем, что, как известно, технология производства мясных консервов отличается от технологии производства колбасных изделий, в частности наличием стадии автоклавирования [6]. При термической обработке под давлением соевый белок теряет свою антигенность, что может повлечь за собой занижение результатов количественного определения, поэтому необходимо использовать дополнительный стандарт, представляющий консервы с заранее известным содержанием соевого белка.
В соответствии с вышеизложенным целями данной работы были разработка и использование непрямого твердофазного иммуноферментного метода для количественного определения ИБС в составе мясных консервов.
Материал и методы
Разработанный метод апробирован на контрольных образцах мясных консервов, содержащих заранее известное количество ИБС (консервы были любезно предоставлены ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии). С помощью разработанной методики проанализировано 6 образцов мясных консервов, произведенных отечественными производителями.
Подготовку проб мясных консервов и приготовление стандарта ИБС осуществляли так, как описано в предыдущей публикации [4]. Из каждого анализируемого образца готовили 4 экстракта, исследовали их и полученные результаты сравнивали с результатами исследования Rf-стандарта - экстрактов, приготовленных из контрольных мясных консервов с известным содержанием ИБС (4 г/100 г).
Экстракты исследуемых образцов мясных консервов готовили следующим образом. Предварительно измельченный образец консервов взвешивали и лиофильно высушивали. Далее лиофилизованный образец взвешивали, измельчали в фарфоровой ступке и рассчитывали отношение масс консервов после и до лиофилизации (Квлаж). Навеску лиофильно высушенных консервов для экстракции в экстрагенте "RIDA Extraction Solution" (ЭБ-1) и растворе экстрагирующего буфера "RIDASCREEN Allergen extraction buffer" (ЭБ-2) рассчитывали по следующей формуле:
gRf, г=(12,0±0,1 г)ЧКвлаж, (1)
где gRf, г - навеска лиофильно высушенных консервов для экстракции; Квлаж - отношение масс консервов после и до лиофилизации.
Навеску (gRf) диспергировали в 48 мл фосфатносолевого буфера (ФСБ) с использованием диспергатора при 24 000 об/мин. Затем 0,25 мл полученной взвеси переносили в коническую колбу и в нее вносили 2,5 мл экстрагента ЭБ-1. Инкубацию вели при температуре 60 °С в течение 90 мин. Затем в колбу вносили 7,5 мл ЭБ-2, предварительно нагретого до температуры 60 °С, и проводили инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при температуре 60 °С. После охлаждения до комнатной температуры образец растворяли в соотношении 1:4 в 0,5% водном растворе нормальной лошадиной сыворотки (НЛС), разливали по 2 мл во флаконы и лиофильно высушивали. Лиофильно высушенный образец использовали в дальнейшем при проведении ИФА. Непосредственно перед изучением указанным методом образцов исследуемых консервов готовили Rf-стандарт (растворы контрольных консервов) путем добавления во флаконы с лиофильно высушенными образцами этих консервов 2 мл 0,5% раствора НЛС. Разведения экстрактов анализируемых образцов мясных консервов проводили согласно [4].
Сенсибилизацию планшета осуществляли методом, описанным нами ранее [4]. Перед проведением анализа двукратно отмывали лунки планшета раствором ФСБ с 0,1% Твина-20. Затем добавляли в каждую лунку по 0,2 мл 1% раствора желатина и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем вновь, но уже троекратно отмывали лунки планшета раствором ФСБ с 0,1% Твина-20, после чего добавляли в лунки планшета соответствующие растворы по схемам 1 и 2, а именно:
- в лунки A1-В1 и С1-D1 планшета добавляли по 0,1 мл стандартного раствора ИБС и Rf-стандарта, соответственно;
- в лунки Е1-F1 и G1-Н1 планшета - 0,1 мл исходных разведений экстрактов из анализируемого образца (П1, П2, П3, П4).
Далее выполняли анализ, как представлено в [4], и обрабатывали результаты.
Результаты и обсуждение
Расчет концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей 1-му разведению (ряд 1 полистирольного планшета), проводили по формуле:
СRf, мкг/мл=1000 gRf/250, (2)
где СRf, мкг/мл - концентрация раствора лиофильно высушенных консервов в 1-м разведении; gRf - масса 0,25 мл диспергата, мг (см. выше).
Рассчитывали процент связывания конъюгата для каждого разведения раствора лиофильно высушенных консервов по формуле:
JRf(n), %=100Ч[Б0(n)-Бn]/Бo(n), (3)
где JRf(n), % - процент связывания конъюгата; Бo(n) - среднее значение (из 2 параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания; Б(n) - среднее значение (из 2 параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора лиофильно высушенных консервов.
Схема 1. Разметка первого планшета при определении изолятов белков сои в мясных консервах
Схема 2. Разметка второго планшета при определении изолятов белков сои в мясных консервах
Далее строили калибровочную кривую раствора лиофильно высушенных консервов в следующих координатах: ось абсцисс - процент связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов - lgCRf(мкг/мл) (рис. 1). По построенной калибровочной кривой методом линейной интерполяции рассчитывали логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей 50% связыванию конъюгата:
lg(Rf, 50%)= lgС1Rf+(50 - J1Rf)Ч (lgС2Rf-lgС1Rf)/(J2Rf-J1Rf), (4)
где lg(Rf, 50%) - логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей 50% связыванию конъюгата; lgС2Rf - десятичный логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается <50% конъюгата; lgС1Rf - десятичный логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается >50% конъюгата; J2Rf - процент связывания метки, соответствующий lgС2Rf; J1Rf - % связывания метки, соответствующий lgС1Rf.
Рассчитывали концентрацию раствора лиофильно высушенных консервов (Rf-стандарта), соответствующую 50% связыванию конъюгата, по формуле:
СRf 50%=10 lg (Rf, 50%), (5)
где СRf 50% - концентрация раствора лиофильно высушенных консервов (Rf-стандарта); Lg (Rf, 50%) - логарифм концентрации раствора лиофильно высушенных консервов, соответствующей 50% связыванию конъюгата.
Расчет коэффициента открытия ИБС в мясных консервах проводили следующим образом. Рассчитывали содержание ИБС в Rf-стандарте в процентах (кажущееся содержание ИБС по калибровочной кривой стандартного раствора ИБС) по формуле:
% ИБСRf=100ЧС ИБС 50%/С Rf 50%, (6)
где % ИБСRf - содержание ИБС в Rf-стандарте (%); С ИБС 50% - концентрация стандартного раствора ИБС, соответствующая 50% связыванию конъюгата [4]; С Rf 50% - концентрация раствора лиофильно высушенных консервов (Rf-стандарта).
Рассчитывали коэффициент открытия ИБС в мясных консервах:
Коткр.ИБС=%ИБСRf/4, (7)
где Коткр.ИБС - коэффициент открытия ИБС в мясных консервах; % ИБСRf - концентрация раствора лиофильно высушенных консервов (Rf-стандарта).
Расчет концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50% связыванию конъюгата, осуществляли так же, как описано в предыдущей публикации [4]. Кривая раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца мясных консервов представлена на рис. 2. Расчет содержания ИБС в анализируемом образце мясных консервов (в г на 100г мясных консервов) осуществляли по формуле:
ИБС=100ЧС ИБС 50%/С П 50% /К откр.ИБС, (8)
где ИБС - содержание ИБС в анализируемом образце мясных консервов в г/100 г;
С ИБС 50% - концентрация стандартного раствора ИБС, соответствующая 50% связыванию конъюгата [4];
С П 50% - концентрация раствора исследуемого образца мясопродукта, соответствующая 50% связыванию конъюгата;
Коткр.ИБС - коэффициент открытия ИБС в мясных консервах.
В ходе проделанной работы рассчитаны метрологические показатели методики количественного определения изолята соевого белка в мясных консервах с помощью конкурентного ИФА. Для диапазона концентраций ИБС 0,2-1,0 г/100 г предел повторяемости (rm) и предел воспроизводимости (Rm) составили соответственно 0,1 и 0,2 г/100 г, а предел точности (Δ) - 0,1 г/100 г. Для диапазона концентраций ИБС 1,0-10,0 г/100 г показатели rm и Rm составили 0,6 г/100 г, а Δ - 0,3 г/100 г. Метрологические показатели рассчитывали в соответствии с [7].
С помощью разработанной методики были проанализированы консервы отечественных производителей (6 образцов). Все образцы были изготовлены по ТУ, но маркировка 5 образцов не содержала информации о наличии и количестве соевого белка. ИБС был обнаружен во всех анализируемых мясных консервах, его содержание колебалось от 0,5 до 1,2 г/100 г.
Полученные результаты свидетельствуют об эффективном использовании метода непрямого ИФА для количественного определения ИБС в мясных консервах.
Рис. 1. Калибровочная кривая раствора Rf-стандарта
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - % связывания (J). Остальные пояснения даны в тексте.
Рис. 2. Кривая раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца мясных консервов
Литература
1. Витол И.С., Коваленок А.В., Нечаев А.П. Безопасность продовольственного сырья и продуктов питания. - М.: ДеЛи принт, 2010. - 352 с.
2. Кантере В.М., Матисон В.А., Хангажеева М.А. и др. Система безопасности продуктов питания на основе принципов НАССР. - М.: Типография РАСХН, 2004. - 462 с.
3. Кантере В.М., Матисон В.А., Сазонов Ю.С. Системы менеджмента безопасности пищевой продукции на основе международного стандарта ИСО 22000. - М.: Типография РАСХН, 2006. - 454 с.
4. Козлова О.И., Зорин С.Н., Мазо В.К. // Вопр. питания. - 2011. - № 2. - С. 66-70.
5. Постановление Правительства РФ от 22.11.2000 г. № 883 "Об организации и проведении мониторинга качества, безопасности пищевых продуктов и здоровья населения".
6. Соколов А.А., Павлов Д.В., Большаков А.В. и др. Технология мяса и мясопродуктов. - М.: Пищ. пром-сть, 1970. - 740 с.
7. РМГ 61-2003 "Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа". - М.: Изд-во стандартов. - 46 с.