Важные открытия этого столетия в области медицины, биологии, химии повлекли за собой использование в пищевых рецептурах ингредиентов, активных с точки зрения физиологии питания человека. По мере расшифровки химического состава продовольственного сырья и пищевых продуктов и выявления корреляционных зависимостей между содержанием в них отдельных микронутриентов и биологически активных веществ, а также состоянием здоровья человека, был сформулирован новый взгляд на питание, способствующий поддержанию здоровья, снижению риска возникновения заболеваний [1-3]. При оценке функциональных пищевых продуктов наряду с пищевой ценностью особое внимание уделяется физиологическому действию ингредиентов, входящих в их состав [4-6]. Одним из перспективных способов обеспечения биологической ценности функциональных пищевых продуктов является использование натуральных составляющих пищи микробного происхождения [7-10]. Работами последних лет показано, что применение регулируемого биокатализа полимеров микробной клетки позволяет направленно модифицировать ее структуру и получать биологически активные композиции с заданным составом для создания функциональных пищевых продуктов, сбалансированных по содержанию углеводов, незаменимых аминокислот, биологически активных пептидов, витаминов и микроэлементов [11-15]. Актуальным в настоящее время является обеспечение качества и контроля получаемых гидролизатов.
Цель данной работы состояла в исследовании процесса направленной деструкции пищевых дрожжей Saccharomyces cerevisiae ферментными композициями и получения ферментолизатов с заданным фракционным составом белковых веществ, предназначенных для производства пищевых ингредиентов с целевым функциональным воздействием.
Материал и методы
Проведена направленная биокаталитическая деструкция ферментативными системами (ФС) субклеточных структур дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae Y-3167 (коллекция ВНИИПБТ). Определение активности ферментных препаратов проводили согласно национальным стандартам [16]. Длительность ферментативной обработки биомассы составила 6 ч при 50 °С. В состав ФС-1 входили ферменты, катализирующие деструкцию полисахаридов клеточных стенок (КС) дрожжей. Ферменты дозировали из расчета: β-глюканазу -300 ед β-глюканазной активности (β-ГкС)/г, маннаназу -28,9 ед маннаназной активности (МС)/г дрожжей. ФС-2 дополнительно к ФС-1 содержала протеолитический комплекс, который включал ферменты бактериального происхождения, в основном представляющие нейтральные сериновые и металлозависимые протеиназы, катализирующие частичный гидролиз белков до пептидов с различной молекулярной массой [в дозировке 2 ед протеолитической активности (ПС)/г дрожжей]. ФС-3 содержала ферменты ФС-1 и ФС-2, протеолитический комплекс был дополнительно усилен повышенной дозировкой протеиназ и пептидаз грибного происхождения (10 ед ПС/г дрожжей), катализирующих глубокий гидролиз белковых веществ протоплазмы дрожжевой клетки до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.
Электронно-микроскопические исследования дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae Y-3167 и степени их ферментативной деструкции, размеров и морфологии проводили с применением методов атомно-силовой, сканирующей электронной микроскопии:
- на приборе ИНТЕГРА Прима ("НТ-МДТ", РФ) в полуконтактном режиме (рис. 4 и 6, см. цв. вклейку). Пробы осаждали и высушивали на подложках из свежесколотой слюды, измерения проводили на воздухе, для получения достоверных результатов для каждого образца использовали результаты серии измерений;
- на электронном микроскопе JEOL 1200 СХ II ("JEOL Ltd.", Япония). Для микроскопирования срезы готовили на ультрамикротоме LKB III ("LKB", Австрия). Полутонкие срезы докрашивали толуидиновым синим и просматривали в световом микроскопе "Polivar" ("Reichert", Австрия). Ультратонкие срезы докрашивали цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEOL (рис. 1Б, 2А, 3Б и 5);
- на сканирующем электронном микроскопе Hitachi ТМ-3000 ("Hitachi", Япония) в режиме низкого вакуума микроскопирование проводили при увеличении до 30 000x и разрешении до 10 нм (рис. 1А, 2Б и 3А).
)
)
)
Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярных белковых фракций (с молекулярной массой <1000 Да) осуществляли на квадрупольной масс-спектрометрической системе для высокоэффективной жидкостной хроматографии "Agilent 6120" ("Agilent", США), для определения степени протеолиза белковых веществ дрожжевой биомассы использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле [17, 18].
Результаты и обсуждение
Исходные дрожжевые клетки (контрольная группа клеток, не обработанных ферментами) при электронном микроскопировании на сканирующем микроскопе были примерно одинакового размера, округло-овальной, вытянутой овальной, реже неправильной формы (см. рис. 1А). Встречались почкующиеся клетки. Клеточная оболочка, преимущественно одинаковой толщины, имела неравномерную плотность, в отдельных клетках отмечалось некоторое утолщение стенок. При микроскопировании ультратонких срезов клетки видно, что оболочка состоит из трех слоев: более плотных внутреннего и наружного, а также среднего менее плотного светлого слоя (см. рис. 1Б).
Основными структурообразующими полисахаридами клеточной стенки (КС) являются β-глюканы и маннаны, находящиеся приблизительно в равных количествах и в сумме составляющие порядка 60-90% сухой массы КС, оставшаяся часть приходится на долю белка, хитина и липидов [19, 20].
В связи с этим I стадию ферментолиза дрожжей осуществляли путем каталитической деструкции КС ФС-1, содержащей ферменты глюкано- и маннанолитического действия (рис. 2).
Биокаталитическое воздействие ФС-1 привело к деформации дрожжевой клетки и нарушению структуры КС в результате частичной деструкции полисахаридов оболочки. Исходное ультраструктурное строение клеток на 1-й стадии ферментолиза изменялось достаточно существенно. В большинстве клеток отмечено образование щелевидных пространств в цитоплазматической мембране между стенкой и цитоплазмой (см. рис. 2А, 1), при этом мембрана приобретала более расслоенный вид. В одних клетках она была утолщена, состояла из темных отдельных коротких волоконец, плотно прилегающих к цитоплазме (рис. 2А, 2).
В других стенка имела зернистое строение, не разделялась на слои, но между ней и цитоплазмой также имелись щелевидные пространства различной толщины (см. рис. 2А, 3). В результате каталитического воздействия β-глюканазы и маннаназы на полимеры КС образовывались каналы, способствующие увеличению проницаемости внутренней мембраны (см. рис. 2А, 4), при этом клетка теряла свою форму (см. рис. 2Б).
С целью повышения степени деструкции клеточных стенок и учитывая, что полисахариды находятся в комплексе с белками, на II стадии ферментолиза в состав ФC-2 вводили протеолитические ферменты, представленные протеиназами, катализирующими частичный гидролиз белка КС, так как важно было не разрушить полимерную структуру белковых веществ протоплазмы. Этот этап ферментолиза предусмотрен в технологии получения белковых обогатителей пищи на основе дрожжевой биомассы [11, 19, 21].
В результате биокаталитической деструкции КС дрожжей происходило частичное высвобождение деполимеризированных субклеточных структур, которые имели вид отдельных фрагментов различной величины и формы (рис. 3А), а внутриклеточные мембраны приобретали более "рыхлую" структуру (рис. 3Б).
На рис. 4 (см. цв. вклейку), полученном с помощью атомно-силовой микроскопии, видно присутствие как целых клеток, так и разрушенных фрагментов клетки, образовавшихся на II стадии биокатализа КС дрожжей ферментами протеолитического и гемицеллюлазного действия.
Таким образом, в дрожжевых клетках на II стадии ферментолиза наибольшие изменения касались КС. На рис. 4 (см. цв. вклейку) хорошо видны результаты ферментативного гидролиза КС дрожжей с выделением внутриклеточных компонентов. В оригинальных работах авторов I и II этапы ферментолиза предусмотрены в технологиях получения белковых и белково-аминокислотных обогатителей пищи на основе дрожжевой биомассы, а также в технологиях получения на основе клеточных стенок энтеросорбента [7, 14, 22].
)
Известно, что антимикробные и иммуногенные свойства проявляют низкомолекулярные пептиды с молекулярными массами менее 1000 Да при условии их превалирования в белковой фракции гидролизата [2, 17, 23]. Для получения продуктов, обогащенных белково-аминокислотной составляющей с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких пептидов, была использована ФС-3, включающая не только комплекс ферментов, гидролизующих КС, но и протеиназы и пептидазы, осуществляющие глубокое разрушение белковых веществ протоплазмы. В дрожжевых клетках на III стадии ферментолиза посредством ФС-3 были наиболее выражены явления деструкции цитоплазмы (рис. 5). В большинстве клеток сохранились лишь отдельные ее фрагменты и окружающая клетку стенка. Органоиды в сохранившихся участках цитоплазмы практически отсутствовали (см. рис. 5А, Б).
В результате глубокой ферментативной деструкции субклеточных структур под действием комплекса протеиназ и пептидаз, а также ферментов, оказывающих лизирующее воздействие на КС, получены ферментолизаты дрожжевой биомассы с размерами деполимеризованных фрагментов полисахаридов КС и белковых веществ протоплазмы от 10 до 250 нм (рис. 6, см. цв. вклейку).
Электрофоретические исследования дрожжевой биомассы после обработки клеточных стенок ферментами ФС-1 показали присутствие белковых фракций с различной молекулярной массой (20-60 кДа), характерных для исходного материала (рис. 7, см. цв. вклейку). Использование ФС-2 способствовало более глубокой деструкции белково-полисахаридного матрикса КС и частичному гидролизу белков с образованием растворимых белковых составляющих с молекулярной массой менее 14 кДа.
Обработка дрожжевых клеток ФС-3 привела к полной деполимеризации белков, что позволило получить белково-аминокислотные препараты с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких пептидов от 10 до 250 нм (см. рис. 6, 7, см. цв. вклейку).
Таким образом, с помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур пищевых дрожжей Saccharomyces cerevisia.
Результаты масс-спектрометрического анализа белковых фракций показали присутствие в ферментолизате 89% низкомолекулярных веществ с молекулярной массой менее 300 Да (см. таблицу).
Медико-биологические исследования выявили наличие у ферментолизатов дрожжевой биомассы ряда антиоксидантных эффектов, выраженных в нормализации уровня активности глутатион-зависимого звена в плазме крови перепелов, подвергнутых окислительному стрессу в результате космического излучения [2, 23]. По-видимому, содержащиеся в препарате растворимые биологически активные вещества достаточно легко преодолевают гематоэнцефалический барьер и всасываются в кровь, а затем вступают в биохимические процессы в организме, нормализуя систему клеточного и гуморального иммунитета, и проявляют антиоксидантные свойства. Проведенные исследования показали, что ферментолизаты дрожжевой биомассы в связи с высокой степенью гидролиза белков протоплазмы клеток, а также глубокой деполимеризацией полисахаридов КС обладают высокой усвояемостью, способствуют нормализации обмена веществ человека, восстановлению работоспособности, оказывают общеукрепляющее, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие [2, 22, 23]. Исследования функциональных свойств полученных ферментолизатов микробной биомассы под действием ФС-2 и ФС-3 выявили их селективную цитотоксичность по отношению к онкоклеткам, при этом исходные клетки не обладали антиканцерогенной способностью [24].
По результатам собственных исследований и анализа источников литературы [1, 3, 7, 10, 11, 16, 23, 24] дана оценка действия ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей и показана перспективность использования гидролизатов, обладающих различной биологической активностью, для создания функциональных компонентов с заданными структурно-функциональными свойствами (см. таблицу).
Таким образом, в результате использования современного научно-методического подхода обоснована эффективность направленной ферментативной деструкции пищевых дрожжей Saccharomyces cerevisia с получением биопрепаратов с заданным фракционным составом белковых веществ, предназначенных для производства пищевых ингредиентов с целевым функциональным эффектом. Исследованный биотехнологический процесс перспективен для дальнейшего использования в технологиях конверсии микробных субстратов в структурные фрагменты с различной биологической активностью.
Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-00104).
Литература
1. Покровский А.А. Роль биохимии в развитии науки о питании. М. : Наука. 1974. 127 с.
2. Diplock А. Т., Charleud J.L., Crozier-Willi G. et al. Functional food science and defence against reactive oxidative species // Br. J. Nutr. 1998. Vol. 80, suppl. 1. P. 77-112.
3. Verschuren P.M. Functional Foods: Scientific and Global Perspectives (Summary Report) // Br. J. Nutr. 2002. Vol. 88, suppl. 2. P. 125-130.
4. Тутельян В.А., Вялков А.И., Разумов А.Н. и др. Научные основы здорового питания. М. : Панорама, 2010. 816 с.
5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома. М. : ДеЛи принт. 2008. 320 с.
6. Roberfroid M.B. Global view on functional foods: European perspectives // Br. J. Nutr. 2002. Vol. 88, suppl. 2. P. 133-138.
7. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Серба Е.М., Орлова Е.В. Медико-биологические и биотехнологические аспекты создания продукции геродиетического питания // Пищ. пром-сть. 2009. № 3. С. 29-30.
8. Самсонов М.А. Концепция сбалансированного питания и ее значение в изучении механизма лечебного действия пищи // Вопр. питания. 2001. Т. 70, № 5. С. 3-9.
9. Diplock A.T., Aggett P.J., Ashwell M. et al. Scientific concepts of functional foods in Europe, consensus document // FF-27-de98. Brussels : ILSI Europe, 1998. P. 17-79.
10. Yi D., Youg P., Wenkui L. Chinese Functional Food. Beijing : New World Press, 1999. P. 19-20.
11. Римарева Л.В., Курбатова Е.И., Фурсова Н.А. и др. Биотехнологические аспекты создания пищевых добавок биокоррегиру-ющего действия на основе микробной биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. 2011. № 2. С. 45-47.
12. Jaehrig S. C., Rohn S., Kroh L. W. et al. In vitro potential antioxidant activity of (1-3),(1-6)-p-D-glucan and protein fractions from Sac-charomyces cerevisiae cell walls // Agric. Food Chem. 2007. Vol. 55, N 12. P. 4710-4716.
13. Mallick P., Akunna J.C., Walker G.M. Anaerobic digestion of distillery spent wash: Influence of enzymatic pre-treatment of intact yeast cells // Bioresource Techn. 2010. Vol. 101. P. 1681-1685.
14. Palomero F., Morata A., Benito S. et al. Conventional and enzyme-assisted autolysis during ageing over lees in red wines: Influence on the release of polysaccharides from yeast cell walls and on wine monomeric anthocyanin content // Food Chem. 2007. Vol. 105. P. 838-846.
15. Suh, Hyung Joo. Method of producing yeast hydrolysate containing CHP as neurotransmitter using flavourzyme as hydrolase. Patent N 2005117196. S. Korean. 2005.
16. Серба Е.М., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И. и др. Разработка национальных стандартов по методам определения активности ферментных препаратов для пищевой промышленности // Пищ. пром-сть. 2013. № 7. С. 40-44.
17. Римарева Л.В., Серба Е.М., Оверченко М.Б. и др. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ // Хранение и переработка сельхозсырья. 2012. № 9. C. 46-50.
18. Стручкова И.В., Кальясова Е.А. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Электронное учебно-методическое пособие. Нижний Новгород : Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 2012. 60 с.
19. Поляков В.А., Римарева Л.В., Курбатова Е.И. и др. Получение белковых обогатителей пищи на основе ферментативной деструкции белково-полисахаридного комплекса клеточных стенок дрожжей // Пищ. пром-сть. 2012. № 11. С. 42-44.
20. Klis F.M. Review: Cell Wall Assembly in Yeast // Yeast. 1994. Vol. 10. P. 851-869.
21. Зобкова З.С., Фурсова Т.П., Зинина Д.В. и др. Влияние способа внесения трансглутаминазы на структурно-механические свойства йогурта и протеолитическую активность заквасочных культур // Хранение и переработка сельхозсырья. 2014. № 3. С. 28-32.
22. Sarmadi B.H., Ismail A. Antioxidative peptides from food proteins: A review // Peptides. 2010. Vol. 31. P. 1949-1956.
23. Орлова Е.В., Римарева Л.В. Исследование антиоксидантных свойств препарата, полученного на основе регулируемого ферментативного гидролиза биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 11. С. 63-64.
24. Орлова Е.В., Римарева Л.В., Орлова В.С. Проявление селективной цитотоксичности препаратами из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученных на основе направленного ферментативного биокатализа полимеров дрожжевой биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 10. С. 47-48.