Microbial stabilization of grain raw material using silver nanoparicles

• Suvorov O.A.
• Balandin G.V.

Abstract

The paper covers the use of colloidal solutions of silver nanoparticles (SNP) as an antimicrobial agent in the processing of grain raw materials. The purpose of the study was to study the effect of SNP on bacterial and fungal microorganisms, contaminating grains, and to select effective antimicrobial concentrations of SNP solutions. The effect of SNP on the quantitative and qualitative composition of grain microbiota has been studied. The total content of silver particles in the wort obtained from the treated barley grain was monitored by atomic adsorption spectrometry. The working concentrations of the preparation of SNP stabilized with chitosan have been determined, which provided bacteriostatic and fungistatic effects. A method is described for reducing the content of SNP in grain, which has been treated with antimicrobial agent, for its further use in fermentation operations, bakery. Based on the data obtained during the disinfection of wheat grain with SNP, a mathematical model was constructed that reflected the degree of influence of the content of SNP on the change in the number of microorganisms per gram of grain mass. In order to improve the safety of the treated grain, the removal of nanoparticles from the grain mass immediately prior to its use is recommended to be carried out by an alkaline treatment, which prevents colloidal silver from entering the product of processing. To do this, barley samples containing 0.092 g/kg SNP were kept in 0.15% NaOH solution for 1-5 hours, the alkali was drained and the grain washed with water. The 12% barley wort prepared under laboratory conditions was filtered and the silver content was measured. It is shown that the alkaline treatment of barley allows the removal of a significant amount of colloidal silver from the grain mass and prevents its entry into the wort. At the maximum processing time, the silver content in the raw material decreased more than 400 times. Thus, the total silver content of 100 g of grain is less than 0.025x10^-3 g, which is below the allowable maximum daily consumption level of silver (0.070x10-3 g).

Keywords:silver nanoparticles, grain, contamination, antimicrobial treatment, chitosan

Микробная контаминация зернового сырья и повыше­ние риска инфицирования производства являются серьезными проблемами в хлебопечении, при получе­нии продуктов брожения, в том числе при дрожжегенерации. Все большее применение в качестве антимик­робного агента находят наночастицы серебра (НЧС). Однако внедрение наносистем в пищевые производства характеризуется рядом проблем, связанных, в частности, с безопасностью наночастиц [1, 2]. Решение этих проб­лем лежит в области всестороннего изучения процессов, протекающих при взаимодействии искусственных наносистем с микроорганизмами пищевых производств.

Для обеспечения микробиологической стабилизации зернового сырья требуется определить закономерности и установить режимы использования агентов, содержа­щих нанокомпоненты. В хлебопечении актуально уста­новление рабочих концентраций коллоидных растворов НЧС, подавляющих развитие картофельной болезни в хлебобулочных изделиях из пшеничной муки, в пи­воваренном производстве - антимикробная обработка ячменного и пшеничного зерна.

Согласно данным литературы, определяющим пока­зателем антимикробного действия коллоидных раство­ров наносеребра служит концентрация частиц в среде [3-5]. Синтезированный китайскими учеными препарат НЧС, стабилизированный оксидом железа, показал хорошее антибактериальное действие на Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis и Bacillus subtilis [6], причем эффект был более выражен в отношении грамотрицательных бактерий. В ряде других исследований также указано, что НЧС эффективнее ингибируют развитие грамотрицательных бактерий [7]. Предполагается, что это связано с утолщенным пептидгликановым слоем, составляющим клеточную стенку грамположительных микроорганизмов. Однако, согласно последним данным, коллоидные растворы НЧС могут одинаково хорошо уг­нетать рост как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, в том числе спорообразующих [8-10]. Кроме того, считается, что, в отличие от обработки антибиотиками, бактерии не способны вырабатывать резистентность к НЧС даже после продолжительной об­работки, что в совокупности с эффективным уничтоже­нием споровых бактерий делает коллоидные растворы НЧС крайне перспективным средством.

Необходимо отдельно отметить комплексное воздейст­вие НЧС и выделяемых ими ионов серебра на клетки бактерий. В работе [11] изучено ингибирующее действие ионов серебра на дыхательные процессы бактериаль­ных клеток. Авторами сделано предположение, что серебро повышает проницаемость клеточных мембран для протонов, вследствие чего теряется протонный градиент. Компенсация потерь протонного градиентаобеспечивается ускорением дыхательного процесса. Эта неконтролируемая реакция генерирует супероксид и гидроксильные радикалы, токсичные для бактери­альных клеток. В работе [12] отмечается, что при­сутствие частиц серебра в среде вызывает наруше­ние транспорта ионов фосфата, пролина и глутамина в бактериальных клетках, что приводит к нарушению обмена веществ клетки и в длительной перспективе к ее гибели. На основе экспериментов in vitro и in vivo НЧС при попадании внутрь клеток бактерий могут приводить к нарушению структуры ДНК и возникнове­нию мутаций [13]. Другие исследователи высказывают предположение, что НЧС могут разрушать бактериаль­ные клетки и без выхода ионов [14]. Так, показано, что бактерицидная активность НЧС значительно более вы­ражена в присутствии кислорода. Данный факт может объясняться образованием активных форм кислорода, индуцированным наносеребром. Это подтверждается исследованием, в котором было обнаружено, что НЧС способствуют образованию свободных радикалов, нега­тивно влияющих на жизнедеятельность бактериальных клеток [15].

Достаточно подробно исследовано влияние НЧС на клеточную стенку бактериальных микроорганизмов. Известно, что наночастицы адсорбируются на поверх­ности клеточной стенки бактерий и проникают через клеточную мембрану внутрь клетки, нарушая ее це­лостность и затрудняя выполнение барьерных и транс­портных функций [16]. Высказываются гипотезы о том, что НЧС притягиваются к отрицательно заряженной поверхности бактериальных клеток вследствие элек­тростатического взаимодействия [17]. Другие ученые считают, что аккумулирование НЧС на поверхности бак­терий вызвано реакцией между серебром и тиоловыми группами, входящими в состав клеточной стенки [18]. Разрушение клеточной мембраны также может проис­ходить вследствие того, что НЧС повреждают молекулы липополисахаридов, составляющих основу мембранной оболочки [19].

Цель настоящего исследования - на основе изуче­ния воздействия НЧС на бактериальные и грибные микроорганизмы, контаминирующие зерно и продукты его переработки, подобрать эффективные антимикроб­ные концентрации растворов НЧС, целесообразных для обеззараживания зернового сырья, с возможностью его дальнейшего использования при производстве пищевых продуктов, в том числе в бродильных производствах.

Материал и методы

Для исследования использовали коллоидный раствор НЧС ("Сентоза Факторинг НП", РФ). Препарат синте­зирован путем химического восстановления водорас­творимой соли серебра в водной среде аскорбатом или цитратом натрия, с дальнейшим добавлением хитозана в качестве стабилизатора. Для определения размера частиц использовали спектрофотометр СФ-56 (РФ).

Максимум полосы поглощения плазменного резонанса составил 405 нм, что соответствует размеру частиц 10-15 нм [29]. Ионов серебра в исходном препарате не было обнаружено. При взаимодействии с 0,9% рас­твором хлорида натрия или 0,1% раствором сульфида натрия не происходило помутнение раствора или обра­зование осадка.

В качестве зернового сырья использовали ячмень сорта "Скарлетт" (ГОСТ 5060-86) и пшеницу сорта "Дарья" (ГОСТ Р 52554-2006), показатели качества которых соответствовали требованиям нормативных документов.

Для проведения антимикробной обработки зерна в 1500 г зерновой массы путем распыления вносили коллоидный раствор НЧС до содержания 0,06-0,12% по массе. Зерно тщательно перемешивали, чтобы его влажность после обработки не превышала 16%. Конт­роль также доводили до влажности 16%. При анализе динамики изменения микробиологических показателей зерновой массы пшеницу и ячмень, прошедшие и не прошедшие антимикробную обработку, распределяли по 5 колбам в количестве 300 г. Затем образцы по­мещали в термостат и выдерживали в течение 6 нед при 30 °С (далее - "ускоренное хранение"). Микробио­логические показатели зерна определяли согласно ГОСТ 10444.12-2013, ГОСТ 10444.15-94 и ГОСТ Р 52816-2007.

Общее содержание серебра в жидкой среде опреде­ляли с применением атомно-адсорбционного спектро­метра КВАНТ-Z.ЭTA (ВНИИОФИ, РФ) на основе метода измерения излучения, испускаемого первичным источ­ником и поглощенного атомами в основном состоянии, причем интенсивность поглощения зависит от концент­рации элемента.

Измерение микробиологических показателей осу­ществляли в 5 повторностях. Абсолютные погрешности вычисляли с уровнем надежности p=0,95. Проводили парный t-тест на отсутствие ингибирующего эффекта от антимикробной обработки. Величины Т_набл и соот­ветствующие им значения вероятностей отклонения (при P<a=0,05) 0-гипотезы приведены в табл. 1. Наблю­даемый эффект полагали незначительным при приня­тии 0-гипотезы либо при малой его относительной вели­чине: е_набл = |d|/y_K<0,05 (в табл. 1 обозначено *).

Результаты и обсуждение

Одним из определяемых показателей микробио­логической безопасности зерна является наличие в единице массы зерна плесеней, более устойчивых к воздействию НЧС. Поэтому необходимую концент­рацию препарата подбирали с учетом ингибирующего эффекта в отношении именно плесеней. На основе данных, полученных при обработке зерна пшеницы пре­паратом наночастиц, была построена математическая модель, отражающая степень влияния содержания НЧС (X, г на 1 кг зерна) на изменение количества микроорга­низмов в 1 г зерновой массы (Y, КОЕ/г).

Получено уравнение регрессии: Y=-70,99lnX-119,4, из которого следует, что для достижения содержания в зерне плесеней Y=50 КОЕ/г (максимально допустимого значения согласно установленным требованиям) необ­ходимо вносить препарат НЧС в количестве Х=0,092 г на 1 кг зерна.

Выполнен микробиологический анализ зерновой массы пшеницы и ячменя, обработанной препаратом НЧС. Результаты приведены в табл. 1.

Анализ данных эксперимента позволяет сделать вывод о статистически значимом эффекте антимикробной об­работки зерна: показатели микробной контаминации на поверхности зерна существенно различаются между контрольными и обработанными НЧС образцами.

Важно отметить, что с целью повышения безопас­ности зерна удаление НЧС из зерновой массы непос­редственно перед его использованием можно проводить способом щелочной обработки, который позволяет пре­дотвратить попадание коллоидного серебра в продукт переработки. С этой целью образцы ячменя, содер­жащего НЧС в дозе 0,092 г/кг, выдерживали в 0,15% растворе NaOH в течение 1-5 ч. Затем щелочь сливали и промывали зерно водой. Далее готовили 12% ячмен­ное сусло и после фильтрования измеряли содержание серебра методом атомно-адсорбционной спектромет­рии в испытуемых пробах (табл. 2).

Как видно из табл. 2, щелочная обработка яч­меня позволяет удалить значительное количество коллоидного серебра с поверхности зерна и пре­дотвратить его попадание в сусло. При максималь­ной длительности обработки содержание серебра в сырье снизилось более чем в 400 раз. Таким образом, общее содержание серебра в 100 г зерна составит менее 0,025x10^-3 г, что ниже допустимого максимального суточного уровня потребления се­ребра (70 мкг). Эффективность такого приема объ­ясняется тем, что хитозан - стабилизатор, входящий в состав препарата НЧС, - отличается пониженной устойчивостью к щелочной среде и при повыше­нии pH теряет свои стабилизирующие свойства. При этом интенсифицируется коагуляция серебра и упрощается его удаление с поверхности зерновой массы. Необходимо отметить, что содержание серебра в сусле, приготовленном из образцов ячменя, выдержанных в растворе щелочи в течение 3-5 ч, не превышает 5,00x10^-5 г/дм³ - максимально допусти­мого содержания коллоидного серебра в питьевой воде, регламентируемого СанПиН 2.1.4.1074-01.

Основываясь на вышеизложенном, можно предло­жить следующую методику обработки зернового сырья. Для ячменя и пшеницы:

1) из концентрированного коллоидного раствора НЧС, стабилизированных хитозаном, путем добавления дис­тиллированной воды готовят разбавленный рабочий раствор таким образом, чтобы концентрация НЧС в пре­парате составила 9,2 г/дм³;

2) в зерновую массу при постоянном перемешива­нии методом распыления вносят рабочий раствор НЧС из расчета 10 см³ на 1 кг зерна;

3) зерновую массу затем транспортируют в элеватор и хранят при температуре 10-30 °С;

4) для удаления препарата и снижения вероятности попадания НЧС в пиво зерновую массу, предназна­ченную для солодоращения или в качестве несоложе­ного сырья при получении пивного сусла, выдерживают в 0,15% растворе NaOH в течение 3-5 ч. Затем раствор щелочи сливают и промывают зерно водой.

В случае антимикробной обработки пшеницы и ржи способ осуществляется аналогично вышеописанному на стадиях 1-3, а 4-я стадия заключается в необходимости непосредственно перед механико-ферментативной об­работкой промыть зерно водой. Особенности практи­ческого применения данной методики обработки будут описаны в дальнейших публикациях.

В рамках обсуждения полученных результатов важно подчеркнуть, что механизм антибактериального дейст­вия НЧС в полной мере не изучен. Известно ингибирующее действие НЧС на грибные микроорганизмы [20]. Об­наружено, что НЧС эффективно угнетает представителей фитопатогенных плесеней [21]. Изучение действия НЧС на грибы рода Phoma, Fusarium и Trichoderma показало, что серебро в малых концентрациях незначительно ингибирует рост мицелия [22]. При обработке дрожжей рода Candida коллоидными растворами НЧС выявлено, что в определенных концентрациях серебро негативно вли­яет на способность клеток к размножению [23]. В то же время было установлено, что действие НЧС на грибные организмы значительно менее выражено по сравнению с антибактериальным. Низкие концентрации НЧС, про­являющие отчетливое антибактериальное действие, не демонстрировали ингибирующего эффекта на аскомицетовые грибы [24, 25]. Повышенную устойчивость гриб­ных микроорганизмов к воздействию наночастиц можно объяснить рядом факторов. Во-первых, мицелиальные грибы и дрожжи являются эукариотическими микроорга­низмами, имеющими сформированный ядерный аппарат [26]. Поэтому, в отличие от прокариотических клеток, ДНК прокариотов более надежно защищена и менее подвер­жена мутационному действию НЧС [27]. Во-вторых, кле­точные стенки грибных микроорганизмов сформированы хитином или целлюлозой, что делает их менее проница­емыми для антимикробных агентов. Кроме того, полисахаридный состав клеточных мембран грибов отличается отсутствием липополисахаридов, которые усиливают взаимодействие НЧС с поверхностью клеток [28].

Хотя специфика действия НЧС на эукариотические микроорганизмы гораздо менее изучена по сравнению с действием на прокариоты, анализ данных литературы показывает, что бактерии более подвержены антимик­робному воздействию наносеребра, чем грибы. В соот­ветствии с этим в случае использования НЧС в качестве антимикробного агента необходимо тщательно контро­лировать фунгистатическое действие препарата.

Заключение

В рамках выполненного научного исследования выяв­лены рабочие концентрации препаратов НЧС, стабили­зированных хитозаном, обеспечивающие антимикроб­ные эффекты. Описан метод снижения содержания НЧС в зерне, прошедшем антимикробную обработку.

Необходимо подчеркнуть, что обеспечение безо­пасности процессов производства пищевых продук­тов - одно из перспективных направлений научных исследований в соответствии с прогнозом научно-технологического развития России до 2030 г., предус­матривающим в долгосрочном периоде расширение применения наноразмерных материалов в различных отраслях и комплексах, в том числе в пищевой про­мышленности.

Изучение влияния различных физико-химических факторов на сырье и пищевые продукты позволит усовершенствовать их потребительские характерис­тики, увеличить сроки годности и микробиологичес­кую устойчивость. Однако следует особо отметить важность проведения дополнительных исследова­ний с целью обоснования безопасности применения НЧС и соответствия положениям технического рег­ламента ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств". В частности, необходимо определять остаточные количества серебра в раз­личных видах продукции для недопущения приоб­ретения пищевыми продуктами новых потенциально опасных свойств. Основные направления дальней­шего использования полученных результатов связаны с проведением комплексной оценки влияния НЧС на потребительские свойства продуктов при хранении, определением условий использования нанотехнологической продукции.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ № МК-8362.2016.11.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.