Эндокринные дисрегуляторы (дисрапторы) - экзогенные вещества, содержащиеся в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и некоторых промышленных изделиях, которые, поступая в организм, оказывают гормоноподобные эффекты, нарушающие гомеостатические механизмы регуляции эндогенными гормонами процессов жизнедеятельности живых организмов [1]. Одним из первых веществ, для которого были установлены свойства эндокринного дисраптора, является дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ). Его массивное использование в качестве инсектицида в прошлом веке и в настоящее время с разрешения Всемирной организации здравоохранения для борьбы с переносчиками малярии, лейшманиоза и трипаносомоза, а также длительный период распада обусловили его персистенцию во всех экосистемах планеты и стали причиной низкодозового воздействия на население развитых стран [2]. Персистирование ДДТ и его метаболитов в окружающей среде привело к включению его в пищевые цепи, а следовательно, в продукты питания [3]. Содержание ДДТ в продуктах животного и растительного происхождения регламентировано техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции". Максимально допустимые уровни содержания для мясной продукции 0,1 мг/кг, для молочной продукции - 0,05 мг/кг, для рыбы - до 0,3 мг/кг, для зерна продовольственного - 0,02 мг/кг, семян зернобобовых -0,05 мг/кг, овощей и ягод - 0,1 мг/кг [4]. Известно, что воздействие больших доз некоторых метаболитов ДДТ на организм приводит к некротическим изменениям в пучковой зоне коркового вещества надпочечников, вследствие чего они даже рассматривались как потенциальные противоопухолевые препараты [5]. Однако не токсическое, а дисрапторное воздействие низких доз ДДТ, потребляемых с пищевыми продуктами ежедневно, на развитие, строение и функционирование надпочечников является малоизученным аспектом проблемы воздействия эндокринных дисрапторов на организм.
Цель настоящего исследования - изучение морфофункциональных изменений коркового вещества надпочечников крыс в пубертатном периоде, потреблявших низкие дозы эндокринного дисраптора ДДТ с первого дня постнатального онтогенеза.
Материал и методы
Исследование проведено на новорожденных самцах (n=20) крыс линии Вистар. Моделировали воздействие низких доз ДДТ, аналогичное воздействию на организмребенка: в период молочного вскармливания новорожденные крысы опытной группы (n=10) потребляли ДДТ с молоком матери, получавшей вместо воды раствор с концентрацией ο,п-ДДТ ("Sigma-Aldrich", США) 20 мкг/л, а c 3-недельного возраста - самостоятельно аналогичный раствор ДДТ ad libitum вместо питьевой воды до достижения пубертатного возраста. Учет потребления ДДТ рассчитывали ежедневно. Потребляемую дозу ДДТ рассчитывали согласно требованиям National Toxicology Problem (США) [6] по определению низких доз и пороговых значений низких доз для ДДТ (50 мкг на 1 кг массы тела в сутки) [7] и нормативам содержания ДДТ в пищевой продукции [4]. Среднесуточное самостоятельное потребление ДДТ самцами крыс составило 3,71±0,15 мкг на 1 кг массы тела, что соответствует уровню потребления ДДТ человеком с пищевыми продуктами с учетом особенностей метаболизма этого вещества в организме крысы [8]. Животные контрольной группы (n=10) получали водопроводную воду. Отсутствие в воде и стандартном корме для лабораторных животных ДДТ, его метаболитов и родственных хлорорганических соединений было подтверждено методом газожидкостной хроматографии.
Животных выводили из эксперимента передозировкой золетила в возрасте 6 нед, что соответствует пубертатному периоду. Эксперимент выполнен в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.1977, и этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей.
Определяли массу тела крыс и массу надпочечников с помощью полуаналитических весов ("Сартогосм", Россия), рассчитывали относительную массу надпочечника как отношение его массы к массе тела, выражали в процентах. Для оценки секреторной активности эндокриноцитов клубочкового и пучкового слоев коркового вещества в сыворотке крови крыс методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов определяли концентрации альдостерона ("Cusabio", Китай) и кортикостерона ("DBC", США). Секреторную активность клеток сетчатого слоя коркового вещества оценивали по концентрации в сыворотке крови женских половых гормонов - эстрадиола и эстрона ("IDS", США). Надпочечники фиксировали в растворе Буэна. После стандартной гистологической проводки готовили экваториальные срезы органа, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили методом световой микроскопии и компьютерной морфометрии с использованием программы "ImageScope" ("Leica Microsystems", Австрия).
Статистическую обработку осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 (Statsoft Inc., США). Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения m. Сравнение независимых групп по количественному признаку выполняли с помощью f-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий. Различия считали статистически значимыми при р<0,01.
Результаты и обсуждение
Исследование продукции стероидных гормонов коркового вещества надпочечников крыс контрольной группы и группы крыс, подвергавшихся воздействию низких доз ДДТ с первого дня постнатального развития, выявило статистически значимые отличия по всем изучаемым показателям. Концентрация альдостерона в сыворотке крови крыс, подвергавшихся воздействию ДДТ, в пубертатном периоде превышала значения контрольной группы почти в 1,5 раза. Концентрация основного глюкокортикоида крыс кортикостерона, напротив, снизилась более чем на 50%. Уровень эстрадиола повысился в среднем на 25%, а эстрона - на 29% (табл. 1).
)
В пубертатном периоде масса надпочечников, как абсолютная, так и относительная, у животных опытной группы была статистически значимо ниже значений контрольной группы (табл. 2).
)
Надпочечник крыс контрольной группы имел типичное строение. Корковое и мозговое вещество имело четкие границы. В корковом веществе отчетливо выделялись клубочковая, пучковая и сетчатая зоны. У крыс, потреблявших низкие дозы ДДТ с первого дня постнатального развития, в начале периода полового созревания надпочечники имели немного меньший диаметр, чем у животных контрольной группы. На срезах корковое и мозговое вещество были хорошо выражены. Однако ширина коркового вещества была статистически значимо меньше, чем у контрольных крыс. Клубочковая зона была выражена менеe равномерно. В некоторых случаях отмечалось очаговое отсутствие клеток клубочковой зоны, вместо которых под капсулой располагалась промежуточная зона. Площадь клубочковой зоны в экваториальных срезах надпочечника, тем не менее, не имела статистически значимых отличий от контрольных значений (см. табл. 2). Клетки клубочковой зоны формировали типичные структуры. Размеры эндокриноцитов клубочковой зоны и их ядер не отличались от таковых в контрольной группе (табл. 3), но в отличие от контроля цитоплазма клеток проявляла слабобазофильные тинкториальные свойства. Промежуточная зона в корковом веществе надпочечника была очень слабо выражена (см. табл. 2). У некоторых животных обнаруживались очаговые кровоизлияния между клубочковой и пучковой зонами (рис. 1), участки дистрофии клеток пучковой зоны и появление в пучковой зоне участков дискомплексации, не имеющих радиального трабекулярного строения, а состоящих из скопления клеток, в том числе гибнущих. Площадь, занимаемая пучковойзоной, соответствовала значениям контрольной группы (см. табл. 2). Размеры эндокриноцитов в пучковой зоне были меньше, чем у крыс контрольной группы (см. табл. 3). У некоторых животных на границе пучковой и сетчатой зон также имелись очаги кровоизлияний. Площадь сетчатой зоны у крыс, подвергшихся действию ДДТ, была статистически значимо меньше, чем у контрольных животных (см. табл. 2). Размеры эндокриноцитов сетчатой зоны и их ядер не отличались от таковых в контрольной группе (см. табл. 3), но цитоплазма клеток имела менее оксифильную окраску. Отличием было более плотное строение сетчатой зоны. Количество клеток в 1 мм2 площади среза сетчатой зоны было увеличено пропорционально уменьшению площади сетчатой зоны, таким образом, общее количество клеток в сетчатом веществе в экваториальном срезе надпочечника не имело статистически значимых отличий от значений контрольной группы (рис. 2).
)
Исследование показало, что длительное воздействие низких доз эндокринного дисрегулятора ДДТ, соответствующих его содержанию в пищевых продуктах, в развивающемся организме оказывает влияние на морфогенез и функционирование надпочечников, что может быть причиной нарушений деятельности различных систем организма, в первую очередь иммунной и сердечно-сосудистой. Анализ органометрических характеристик и особенностей гистологического строения показывает, что причиной уменьшения размеров надпочечника является меньшая толщина коркового вещества, что, в свою очередь, обусловлено уменьшением площади сетчатой зоны и, в меньшей степени, промежуточной зоны. Одновременно с меньшими размерами органа наблюдаются различные по характеру и выраженности изменения функциональной активности зон коркового вещества. Выявленное повышение концентраций альдостерона и эстрогенов и понижение уровня кортикостерона указывают на различный механизм дисрапторного действия ДДТ. Синтез стероидов в надпочечниках крыс отличается очень низкой активностью 17β-гидроксилазы, вследствие чего в сетчатой зоне практически не образуется дегидроэпиандростерон, а в пучковой - кортизол. Синтез гормонов в эндокриноцитах клубочковой и пучковой зон отличается только последней реакцией - гидроксилированием дезоксикортикостерона с образованием кортикостерона в пучковой и гидроксилированием и окислением последнего с превращением в альдостерон - в клубочковой. Считается, что адренолитическое действие метаболитов ДДТ на клетки пучковой зоны связано с повреждающим действием на митохондрии и нарушением функции 11β-гидроксилазы [9], катализирующей образование кортикостерона и 18-оксикортикостерона - непосредственного предшественника альдостерона, что должно вызывать снижение продукции и кортикостерона, и альдостерона. Различия в реакциях эндокриноцитов клубочковой и пучковой зон и их морфологические отличия позволяют предположить, что основным механизмом снижения продукции кортикостерона было нарушение гемоциркуляции в пучковой зоне, приведшее к дистрофическим изменениям и гибели клеток. Известно, что уменьшение продукции кортикостерона, по принципу обратной связи повышает секрецию адренокортикотропного гормона, который оказывает стимулирующее влияние на синтез половых гормонов и пролиферацию эндокриноцитов в сетчатом слое [10]. Это позволяет прийти к выводу, что в увеличении концентрации эстрогенов у самцов играет роль и действие ДДТ, и гипоталамо-гипофизарная регуляция. Синтез альдостерона регулируется ренин-ангиотензиновой системой, а также имеет субстратную регуляцию, связанную с изменением концентрации ионов калия в системном кровотоке. Адренокортикотропный гормон оказывает очень слабый эффект на клетки клубочковой зоны, соответственно, усиление продукции альдостерона, которое было наиболее выраженным функциональным изменением, указывает на стимулирующее действие ο,п-ДДТ на стероидогенез. Ранее проводившиеся in vitro исследования продукции стероидных гормонов в культуре клеток коркового вещества надпочечников H295R при воздействии ο,π-ДДТ не выявляли изменения секреции альдостерона [11], однако результаты нашего исследования показывают, что синтез альдостерона in vivo характеризуется высокой чувствительностью к воздействию низких доз ДДТ. Появление участков кровоизлияний в корковом веществе типично для острых токсических поражений, в том числе высокими дозами ДДТ [12] и его производных, однако потребляемая крысами доза ДДТ была крайне низкой и соответствовала уровню фонового воздействия ДДТ на организм человека, что указывает на небезопасность доз, соответствующих максимально допустимым уровням в пищевых продуктах с учетом его способности накапливаться в жировой ткани [13].
Заключение
Воздействие низких доз ДДТ в пределах максимально допустимых уровней его содержания в пищевых продуктах с первых дней постнатального периода онтогенеза приводит к развитию значительных изменений морфофункционального состояния коркового вещества надпочечников крыс к пубертатному периоду.
Дихлордифенилтрихлорэтан оказывает негативное воздействие на эндокриноциты пучковой зоны, что приводит к дистрофическим изменениям, гибели клеток, нарушениям цитоархитектоники пучковой зоны коркового вещества и снижению продукции кортикостерона. ДДТ не вызывает аналогичных изменений в клубочковой и сетчатой зонах и стимулирует стероидогенез в них.
Полученные данные указывают на необходимость более тщательного изучения безопасности максимально допустимых уровней воздействия веществ, оказывающих не только токсическое действие, но и обладающих свойствами эндокринных дисрегуляторов.
Литература
1. Яглова Н.В., Яглов В.В. Эндокринные дизрапторы - новое направление исследований в эндокринологии // Вестн. РАМН. 2012. № 3. С. 56-61.
2. State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. An assessment of the state of the science of endocrine disruptors prepared by a group of experts for the United Nations Environment Program and World Health Organization. 2012. 289 р.
3. Turusov V., Rakitsky V., Toamtis L. Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT): ubiquity, persistence, and risks // Environ. Health Perspect. 2002. Vol. 110. P. 125-128.
4. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции". СПб. : ГИОРД, 2015. 176 с.
5. Lindhe O., Skogseid B., Brandt I., Cytochrome P450-catalyzed binding of 3-methylsulfonyl-DDE and o,p'-DDD in human adrenal zona fasciculata/reticularis // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 87. P. 1319-1326.
6. National Toxicology Program. National Toxicology Program's report of the endocrine disruptors low dose peer review. Research Triangle Park, NC : National Institute of Environmental Health Sciences, 2001.
7. Vandenberg L., Colborn T., Hayes T. et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses // Endocr. Rev. 2012. Vol. 33. P. 378-455.
8. Yamazaki H., Takano R., Shimizu M. et al. Human blood concentrations of dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) extrapolated from metabolism in rats and humans and physiologically based pharmacokinetic modeling // J. Health Sci. 2010. Vol. 56, N 5. P. 566-575.
9. Lund B., Lund J. Novel involvement of a mitochondrial steroid hydroxylase (P450c11) in xenobiotic metabolism // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. Р. 20 895-20 897.
10. Stachowiakl A., Nussdorfe G., Malendowicz L. Proliferation and distribution of adrenocortical cells in the gland of ACTH- or dexamethasone-treated rats // Histol. Histopathol. 1990. Vol. 5. P. 25-29.
11. Asp V., Ulleras E., Lindstrom V. et al. Biphasic hormonal responses to the adrenocorticolytic DDT metabolite 3-methylsulfonyl-DDE in human cells // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010. Vol. 242. P. 281-289.
12. Yarrington J., Latendresse J., Capen C. Toxic responses of the adrenal cortex // Comprehensive Toxicology / eds I. Sipes, C. McQueen, A. Gandol. A. Oxford : Elsevier Science, 1996. P. 637-649.
13. Jaga K., Dharmani C. Global surveillance of DDT and DDE levels in human tissues // Int. J. Occup. Med. Environ. Health. 2003. Vol. 16, N 1. P. 7-20.