Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов должно базироваться на постоянном совершенствовании требований к проведению контроля и на повышении надежности используемых методов лабораторного анализа, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных питательных сред для выявления и идентификации наиболее значимых групп микроорганизмов. Внедрение в практику новых методов, основанных на современных научных технологиях, даст возможность осуществлять мониторинг загрязненности пищевых продуктов возбудителями пищевых инфекций и интенсифицировать применение методологии оценки микробиологического риска.
Бактерии рода Campylobacter, занимающие в настоящее время одно из ведущих мест в этиологии инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи [1], относятся к числу наиболее трудно культивируемых микроорганизмов, а потому их детекция требует использования комплексного анализа фено- и генотипических признаков, определяющих ключевые таксономические и патогенетические свойства этих патогенов.
Независимо от применяемых схем выделения и идентификации Campylobacter spp, используемые методы должны включать эффективные и достоверные способы отбора и подготовки проб для анализа, что представляется весьма важным в плане интерпретации полученных результатов. Эти способы включают выбор контрольных критических точек, поскольку убиквитарность, термотолерантность и вариабельность штаммов кампилобактеров исключительно благоприятны для сохранения микробных популяций в процессе изготовления и хранения продуктов пищевой индустрии. Принципиально важен для выделения этих патогенов выбор адекватных схем обогащения исследуемых образцов, обеспечивающих накопление возбудителя до уровня достоверной детекции.
В лабораторной диагностике кампилобактериоза наиболее трудной задачей является выделение возбудителя из пищевых продуктов в связи с массивной контаминацией их сопутствующей микрофлорой. На общем микробном фоне исследуемого субстрата количество патогенов, как правило, незначительно, поэтому их прямое культивирование невозможно, в связи с чем возникает необходимость применения специальных селективных методов обогащения для выделения и идентификации возбудителя. С этой целью используется целая гамма разнообразных избирательных питательных сред, селективных агентов и аналитических средств, учитывающих основные культурально-морфологические и биологические свойства выделяемого микроорганизма [2]. Способность кампилобактерий переходить под влиянием стрессовых воздействий в некультивируемые формы создает особенно трудные методические проблемы для получения объективной оценки степени контаминации продукции и адекватного прогнозирования пригодности используемых схем контроля.
В сравнении с другими пищевыми патогенами, такими как энтерогеморрагические E. coli или сальмонеллы, C. jejuni более чувствительны к неблагоприятным условиям внешней среды. Для роста им необходим определенный набор нутриентов, обеспечивающий заданный окислительно-восстановительный потенциал среды, и специальные микроаэрофильные условия с оптимальной температурой культивирования возбудителя не ниже 30 оС. Такие избирательные свойства теоретически не должны позволять C. jejuni выживать вне организма хозяина в природных аэробных условиях или в пищевой цепи. Однако в реальных условиях эти микроорганизмы активно персистируют во внешней среде и обнаруживаются в продуктах, воде или других объектах [3-5]. Механизм такого выживания и последующей перекрестной контаминации C. jejuni изучен недостаточно и требует проведения детальных исследований с целью снижения риска возникновения пищевых заболеваний, связанных с употреблением зараженных продуктов, особенно куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик. В связи с изложенным целями исследования были:
- изучение контаминации возбудителями кампилобактериоза пищевых продуктов, полученных на птицеперерабатывающих предприятиях при различных технологиях обработки сырья;
- оптимизация рекомендуемых методических схем выявления и видовой идентификации бактерий рода Campylobacter;
- повышение чувствительности и специфичности анализов с целью стандартизации их по отношению к официально утвержденным нормативным и методическим документам.
Материал и методы
Всего исследовано свыше 300 проб мяса птицы и полуфабрикатов (от цыплят-бройлеров, индеек и перепелов). На наличие Campylobacter spp. также исследовали смывы с оборудования предприятий.
Исследования птицепродуктов и смывов с поверхностей оборудования проводили в условиях трех отечественных птицеперерабатывающих предприятий, применяющих охлаждение тушек погружением в переохлажденную воду, а также комбинированным водно-испарительным и гидроаэрозольным способами. Для антимикробной обработки при всех вариантах использовали технологические вспомогательные средства на основе надуксусной кислоты.
В работе использовали как общепринятые куль-туральные методы посевов пищевых продуктов, так и вновь разрабатываемые или модифицированные способы выделения и количественного учета возбудителей кампилобактериоза.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05. Расчеты проводили с помощью пакетов программ Excel и SPSS 18.0.
Результаты и обсуждение
С целью накопления статистических материалов по загрязнению Campylobacter spp. различных видов сырья, готовых продуктов и полуфабрикатов, проведены комплексные исследования, позволяющие судить о характере контаминации и распространении кампилобактеров на отдельных этапах производства птицепродуктов
Бактерии рода Campylobacter обнаруживали преимущественно в сырых птицепродуктах и смывах с поверхностей оборудования птицеперерабатывающих предприятий (свыше 30% положительных проб). В большинстве случаев кампилобактеры выделяли из образцов, обсемененных колиформными бактериями (свыше 60% проб) и сальмонеллами (17% проб).
Полученные данные показали, что частота контаминации сырых птицепродуктов сальмонеллами и кампилобактериями значимо зависит от технологии охлаждения тушек (табл. 1). При использовании погружного способа создаются условия для перекрестной контаминации патогенами через воду в ваннах охлаждения (45% проб, зараженных Campylobacter spp.). При комбинированном использовании переохлажденной воды и гидроаэрозолей кампилобактерии также выявляли достаточно часто -в 27% проб. Наименьшее загрязнение патогенами было выявлено при испарительном способе охлаждения с использованием антимикробных гидроаэрозолей (менее 5% положительных проб), что позволяет признать его наиболее перспективным для производства безопасной в микробиологическом отношении продукции.
)
Получение таких данных необходимо для обоснования отраслевых критериев оценки эффективности технологий производства птицепродуктов и разработки санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению контаминации мяса птицы патогенами в процессе убоя и первичной переработки [6]. Эти критерии вместе с мерами, направленными на ликвидацию патогенов в птицеводческом секторе, нужны для повышения гарантии безопасности сырых мясо- и птицепродуктов, направляемых предприятиями в реализацию.
Традиционные микробиологические методы обнаружения Campylobacter в пищевых продуктах основаны на применении селективных питательных сред и специальных условий культивирования бактерий. Основные принципы этих методов регламентированы международными стандартами ISO 10272-1:2006, ISO/TS 102722:2006 и Руководством по бактериологическим методам анализа FDA (США). В Российской Федерации для контроля пищевых продуктов и расследования вспышек инфекций кампилобактериозной этиологии применяют ГОСТ ISO 10272-1-2013, ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013, а также Методические указания 4.2.2321-08 "Методы определения бактерий рода Сampylobacter в пищевых продуктах".
Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов включает:
- предобогащение в селективном бульоне при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота);
- обогащение в селективном бульоне в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;
- пересев на агаровые среды для выделения изолированных колоний, инкубирование в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.
Для повышения селективных свойств жидких и плотных питательных сред применяют антибиотики цефоперазон, тейкопланин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и др. в различных комбинациях. Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефибринированную баранью или лошадиную кровь. Поскольку использование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в настоящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия. Для создания микроаэрофильных условий используют различные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы.
Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохимическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и каталазный тесты, нитрат/ нитрит-редукция, гидролиз гиппурата, ферментация углеводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др.
Применение регламентированных схем и методов детекции при проведении экспериментальных исследований по обнаружению возбудителей кампилобактериоза в пищевой продукции в 2015-2017 гг. позволило накопить и систематизировать данные о частоте выделения, характере контаминации и свойствах Campylobacter spp. [7]. Однако при выполнении запланированных работ были выявлены следующие методические проблемы:
- отсутствие отечественных аналогов зарубежных сред, селективных агентов и специальных компонентов, рекомендуемых для культивирования Campylobacter spp., что обусловливает необходимость конструирования питательных сред, подбора и оценки качества серийно выпускаемых сырьевых ингредиентов, химических реагентов, буферных систем и др.;
- недостаточная эффективность используемых ростовых веществ, ферментных систем и ингибиторных добавок, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры, в первую очередь грамотрицательных бактерий рода Proteus;
- технические трудности обеспечения микроаэрофильных условий культивирования кампилобактеров при рутинном контроле сырья и пищевой продукции;
- отсутствие практических рекомендаций по поддержанию жизнеспособности выделенных культур Campylobacter spp. в процессе их изучения и при создании лабораторных коллекций (криобанков) этих микроорганизмов;
- дефицит отечественных аналитических средств и тест-систем для фенотипической и генетической идентификации выделяемых штаммов.
Вышеназванные недостатки лабораторной детекции Campylobacter spp. определили направления экспериментальных исследований и необходимость разработки новых подходов к отдельным этапам их практической реализации.
Существующие прототипы методов выявления кампилобактеров основаны на применении преимущественнозарубежных сред: на первых двух этапах предобогащения и обогащения посевов в качестве селективных бульонов регламентированы бульон Болтона, бульон Престона или селективные среды Дойла, Мартена или Парка. В их состав в качестве питательной основы входят мясной экстракт, ферментативные гидролизаты животных белков (мяса, казеина, лактальбумина). Для обеспечения толерантности к кислороду используют дефибринированную кровь или антиоксиданты. Для пересева на агаризованные среды используются селективные агары Престона, Кармали или угольный агар, в основу которых также входят пептон, мясной экстракт и гидролизаты казеина, дефибринированная кровь, активированный древесный уголь и аэротолерантные добавки. Специальных способов хранения и транспортирования культур кампилобактеров не предлагается, тогда как общепринятые методики криохранения и лиофилизации не всегда пригодны для Campylobacter spp., требующих особых условий для сохранения жизнеспособности этих микроорганизмов.
Подбор питательных основ и отечественных компонентов в составе селективных сред и сравнительные испытания их при культивировании различных штаммов Campylobacter spp. позволили разработать рецептуры и сконструировать состав базовых сред для накопления и выделения кампилобактерий. С целью обеспечения сохранности основных фенотипических признаков и поддержания жизнеспособности выделенных штаммов разработана модифицированная среда - полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp. (табл. 2).
)
Из широкого ассортимента селективных добавок, рекомендуемых действующими стандартами, отобраны для практического применения в комплекте с базовыми средами следующие дифференциально-диагностические компоненты (табл. 3).
Использование в составе питательной основы комплекса легко усвояемых азотистых веществ, полученных в результате гидролитического расщепления белков животного, растительного и микробного происхождениядо оптимальных концентраций аминного азота, обеспечивало заданный уровень нутритивных компонентов. Включение в рецептуры дрожжевого экстракта как источника биологически активных компонентов и стимуляторов роста в сочетании с метабисульфитом натрия, сульфатом железа и пируватом натрия способствовало улучшению ростовых свойств субстратов и снижению окислительного стресса. Внесение L-цистеина и аскорбиновой кислоты обеспечивало оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала среды.
С целью унификации лабораторных процедур подобран комплекс антибактериальных препаратов (полимиксина В сульфат, рифампицин, амфотерицин В), эффективно ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры как в накопительном бульоне, так и при пересевах на агаровую среду. Заданные концентрации антибиотиков в рецептурах предлагаемых сред обеспечивали подавление роста бактерий семейства Enterobacteriaceae, энтерококков, стафилококков, псевдомонад и протея при исходном уровне контаминации посторонней микрофлоры 102-104 КОЕ/см3.
Рекомендуемый для хранения штаммов Campylobacter spp. полужидкий питательный агар, содержащий 0,12% агара, 1,8% аминного азота и 15% глицерина, позволял сохранять жизнеспособность тест-штаммов при криохранении в условиях низких температур (-70±2) °С не менее 9 мес. Включение в состав полужидкого агара защитной аэротолерантной смеси (метабисульфит натрия + сульфат железа + пируват натрия) способствовало созданию улучшенных условий для поддержания физиологического статуса и ростовых свойств культур кампилобактеров (табл. 4). При этом основные фенотипические характеристики штаммов существенно не менялись и полностью восстанавливались после 2-3 пассажей в неселективной среде. Один из характерных признаков - подвижность - удавалось сохранить на протяжении длительного срока хранения - 9-12 мес.
)
Определение подвижности проводили, используя способность штаммов формировать моноколонии на поверхности 0,2% полужидкого агара при нанесении 5 мкл суспензии изолята. Посевы проводили в троекратной повторности. Различия признавали достоверными при p<0,05. Этот признак позволял судить о морфологических изменениях стареющих субпопуляций тестируемых штаммов, подтверждающих фенотипическую изменчивость выделенных культур под воздействием неблагоприятных факторов (табл. 5).
)
В то же время криохранение штаммов при обычных условиях в глицериновом бульоне (15% глицерина + 85% бульона Престона) сопровождалось потерей подвижности и инактивацией тестируемых культур C. jejuni после 2-3 мес наблюдений.
Учитывая сложный многокомпонентный состав субстратов для детекции кампилобактеров, с целью упрощения способа приготовления питательных сред и снижения трудоемкости баканализов разработан оптимизированный способ производства сухих питательных сред для выявления, идентификации и хранения кампилобактерий. Утверждены Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 "Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter* и Инструкция по применению вышеуказанных сред при контроле пищевой продукции и клинического материала. В перечень критериев оценки качества серийно выпускаемых партий сухих сред включены основные физико-химические и биологические показатели, в том числе растворимость, рН, прочность агарового геля, содержание аминного азота, специфичность, селективность, ростовые и ингибирующие свойства (табл. 6).
Сравнительные квалификационные испытания опытных серий сухих питательных сред в сопоставлении с зарубежными аналогами, зарегистрированными в Российской Федерации, показали их высокую чувствительность, воспроизводимость и практическую пригодность для проведения контроля различных объектов для выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter. В зависимости от назначения среды вырабатывают в следующих вариантах: жидкая селективная среда для накопления кампилобактерий; дифференциально-диагностический агар для выделения и количественного учета Campylobacter spp.; полужидкий питательный агар для криохранения культур Campylobacter spp.
Заключение
С целью повышения эффективности выделения бактерий рода Campylobacter из различных объектов и оптимизации режимов хранения выделенных штаммов были модифицированы рецептуры традиционно используемых питательных сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов. Разработаны и утверждены Технические условия 21.20.23-006-01897222-2016 "Питательные среды сухие для детекции бактерий рода Campylobacter". Практическое применение этих сред в условиях отечественных лабораторий позволит существенно упростить использование действующих ГОСТов, разработанных на основе международных стандартов ISO, но не адаптированных к основному ассортименту коммерческих сред и реактивов, применяемых при рутинном контроле пищевых продуктов на наличие кампилобактерий.
Литература
1. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. URL: www.who.int
2. Ефимочкина Н.Р. Оценка роли бактерий рода Campylobacter в возникновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя // Вопр. питания. 2015. № 6. С. 5-18.
3. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. С. 24-29.
4. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 3. P. 237-257.
5. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M. et al. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: a systematic review // Poult. Sci. 2010. Vol. 89. P. 1070-1084.
6. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р., Козак С.С., Минаева Л.П., Быкова И.Б., Пичугина Т.В. и др. Влияние традиционных технологий охлаждения на профиль патогенных микробных контаминантов мяса птицы отечественного производства // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № S2. С. 38.
7. Ефимочкина Н.Р., Быкова И.Б., Стеценко В.В., Минаева Л.П., Пичугина Т.В., Маркова Ю.М. и др. Изучение характера контаминации и уровней содержания бактерий рода Campylobacter в отдельных видах пищевой продукции // Вопр. питания. 2016. Т. 85, 5. С. 52-59.