Enzymatic hydrolysates of whey protein and chicken egg protein: production, physical-chemical and immunochemical characteristics

• Sergey N. Zorin
• Yuliya S. Sidorova
• Vladimir K. Mazo

Abstract

Reducing the manifestations of food allergy by the inclusion of specialized foods in the nutrition of children and adults suffering from this disease is an important problem.

The aim was to obtain and characterize in vitro food protein hydrolysates to evaluate their use in specialized foods with reduced potential allergenicity.

Material and methods. Whey protein concentrate (WPC) and chicken egg protein (CEP) and enzymes such as pancreatin and alkalase have been used. Proteolysis of proteins was carried out in an FA-10 fermenter for 3 hours at an enzyme : substrate ratio of 1:50 in dry matter, at optimal pH and temperature for pancreatin and alkalase. Enzymes were inactivated at +75 °C and fermentolizate was ultrafiltered. The solutions were concentrated by reverse osmosis and freeze-dried. The molecular weight distribution of the peptide fractions was evaluated by HPLC. Residual antigenicity was determined by the method of indirect enzyme-linked immunosorbent assay and expressed as the fold of antigenicity reduction relative to the original protein.

Results and discussion. During WPC proteolysis with pancreatin the hydrolyzate was obtained with a fold reduction of antigenicity of 2.3x10³ relative to the initial WPC. A decrease in antigenicity of 4.7x10⁴ times was achieved with proteolysis of WPC by alkalase. The combination of WPC fermentolysis with pancreatin or alkalase followed by ultrafiltration reduced the content of high molecular weight peptides with a mass more than 8.7 kDa. The multiplicity of decrease in antigenicity with respect to the starting protein was 1.64x10⁵ and 1.90x10⁵, respectively. After repeated ultrafiltration the reduction in antigenicity of the obtained WPC alkalase or pancreatin hydrolysate was more than 1.0x10⁶ and more than 5.0x10⁵, respectively. The decrease in antigenicity of the CEP hydrolyzate obtained with proteolysis by alkalase and ultrafiltration compared to the initial CEP was 1.0x10⁵ times, and 5.0x10⁵ times when we used repeated ultrafiltration.

Conclusion. A significant decrease in the content of high molecular weight peptides and a decrease in the antigenicity of peptide mixtures based on WPC and CEP to the values that permit their use in hypoallergenic products is achieved by combining proteolysis and double ultrafiltration through a UF10 membrane.

Keywords:enzymatic hydrolyzate, whey protein, chicken egg protein, pancreatin, alkalase, antigenicity, molecular weight distribution

В последние десятилетия частота пищевой аллергии нарастает, что определяет значимость проблемы, связанной с возможностями снижения проявлений этого заболевания путем включения специализированных пищевых продуктов (СПП) со сниженной потенциальной аллергенностью в рацион питания детей и взрослых, страдающих пищевой непереносимостью (аллергией) или предрасположенных к этому заболеванию [1-3].

Анализ научной литературы, патентной информации и документации зарубежных фирм-изготовителей позволяет выделить продукты лечебного назначения, т.е. собственно гипоаллергенные продукты, которые могут использоваться в качестве единственного источника питания при вскармливании детей первого года жизни, страдающих тяжелыми и средней тяжести аллергическими реакциями, и продукты профилактического назначения, которые могут потребляться детьми с нетяжелыми формами аллергических проявлений, а также входящими в группы риска, и в качестве дополнительного источника питания при недостатке материнского молока.

В подавляющем большинстве случаев причинно значимыми аллергенами пищевых продуктов являются белки [4, 5]. Способность пищевого белка выступать в роли аллергена у генетически предрасположенных индивидов зависит от наличия антигенных структур (эпитопов, аллергенных детерминант), которые могут вызвать специфическую активацию Т1т2-хелперов и выработку IgE-антител [6]. В результате ферментативного гидролиза антигенные структуры белка элиминируются, однако на практике в ферментативных гидролизатах, не подвергнутых дальнейшему фракционированию, остаются в заметных количествах нерасщепленные антигены. Современные технологии позволяют в значительной мере преодолеть эти трудности, используя в сочетании с ферментативным гидролизом технологии мембранной ультрафильтрации и/или нанофильтрации [7-9]. В результате удается получить пептидные смеси, в которых содержание антигенных структур снижено на несколько порядков не только по сравнению с исходным белком, но и с его ферментативным гидролизатом. Очевидно, что доклиническая оценка потенциальной аллергенности СПП должна предшествовать их клиническим испытаниям.

Цель данного исследования - получение и характеристика in vitro гидролизатов концентрата сывороточных белков молока и белка куриного яйца (БКЯ) для предварительной оценки их возможного использования в составе СПП со сниженной потенциальной аллергенностью.

Материал и методы

В работе в качестве белковых субстратов были использованы концентрат белка молочной сыворотки (КБМС) "Лакпродан 80" (Arla, Дания; содержание белка 80%) и БКЯ ("Овопол", Польша; содержание белка 90%). Перед проведением ферментолиза БКЯ денатурировали при перемешивании в течение 15 мин при 85 °С.

В качестве ферментов были использованы панкреатин (Biosyn, КНР) с протеолитической активностью 2,39 ПС/мг и алкалаза (Novozymes, Дания) с протеолитической активностью 2,4 ПС/мг (определяли по методу Ансона по ГОСТ Р53974-2010 "Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности").

Гидролиз проводили в автоклавируемом ферментере ФА-10 ("Проинтех", Россия).

Протеолиз панкреатином проводили в течение 3 ч при температуре 50±2 °С, соотношении фермент : субстрат 1:50 (по сухому веществу), поддерживая рН реакционной смеси в диапазоне 7,4-7,6 добавлением 5,0% смеси KOH : NaOH (2:1).

Протеолиз белков алкалазой проводили также в течение 3 ч при температуре 60±2 °С, соотношении фермент : субстрат 1:50 (по сухому веществу), поддерживая рН реакционной смеси в диапазоне 7,6-7,8 той же смесью щелочных растворов.

По окончании гидролиза ферменты инактивировали при +75 °С в течение 15 мин, после чего проводили ультрафильтрацию (одно- или двукратную) на лабораторной установке для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 ("Владисарт", Россия) через мембрану УФ10 (со средним значением пор 10 кДа) со сбором низкомолекулярной фракции. Полученные растворы концентрировали методом обратного осмоса на установке с фильтром рулонным мембранным УРФ-1812 ("Владисарт", Россия) и лиофильно высушивали (ЛС-500, "Проинтех", Россия). В полученных образцах оценивали молекулярно-массовое распределение пептидных фракций методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления с использованием колонки "Супероза 12" (1,0x30 см) [10].

Остаточную антигенность КБМС и БКЯ в продуктах определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с модификациями [11] (4 параллельных определения) и выражали как кратность снижения антигенности (КСА) относительно исходного белка.

Результаты и обсуждение

В таблице приведены результаты, характеризующие КСА полученных гидролизатов и молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в их составе.

Протеолиз панкреатином КБМС позволил получить практически полностью водорастворимый гидролизат, в котором КСА составила 2,3x10³ относительно исходного КСБ. Существенно большее снижение антигенности было достигнуто при протеолизе КБМС алкалазой (таблица). Сочетание ферментолиза КБМС панкреатином или алкалазой с последующей ультрафильтрацией через УФ10-мембрану (пористостью 10 кДа) позволило модифицировать молекулярно-массовое распределение пептидов в составе полученных гидролизатов, снизив в них содержание высокомолекулярных пептидов с массой >8,7 кДа КСА по отношению к исходному белку. Высокая эффективность в плане дальнейшего снижения антигенных свойств получаемых гидролизатов была достигнута повторной ультрафильтрацией через мембрану УФ10.

Использование панкреатина для получения ферментолизата БКЯ оказалось неэффективным вследствие образования по завершении реакции протеолиза значительных количеств осадка и, соответственно, крайне низкого выхода растворимой пептидной смеси, пригодной для корректного физико-химического и иммунохимического анализа.

Исходная антигенность гидролизата БКЯ, полученного сочетанием протеолиза алкалазой и ультрафильтрации, снизилась по сравнению с исходным БКЯ в 9,9x10⁴ раз, а при повторной ультрафильтрации уменьшилась еще более чем в 5 раз.

В ходе первого этапа доклинической оценки in vitro потенциальной аллергенности ферментативных белковых гидролизатов в качестве представляющей наибольший интерес их физико-химической характеристики используются данные о молекулярно-массовом распределении пептидных фракций в их составе. Считается, что короткие пептидные фрагменты не иммуногенны, так как не могут быть представлены антигенпрезентирующими клетками [12]. Однако заключение об отсутствии аллергизирующих свойств СПП, содержащих низкомолекулярные пептидные смеси, по-видимому, недостаточно обоснованно. Нельзя исключить, что короткоцепочечные пептиды могут проявлять иммуногенные (т.е. потенциально аллергизирующие) свойства, выступая в роли гаптенов при связывании с высокомолекулярными ингредиентами СПП, а также с другими пищевыми веществами или эндогенными соединениями в желудочно-кишечном тракте или даже белками крови. Оценка снижения исходной антигенности гидролизуемого белка в опытах in vitro, количественно характеризующая наличие в гидролизате антигенных детерминант исходного белка (т.е. потенциальных гаптенов), на наш взгляд, необходима и должна предшествовать клиническим испытаниям, по результатам которых только и можно делать корректное заключение о возможности использования получаемых гидролизатов (пептидных смесей) в составе гипоаллергенных СПП лечебного назначения.

Заключение

Гидролизаты, используемые для включения в состав гипоаллергенных продуктов, характеризуются значительным содержанием свободных аминокислот и короткоцепочечных пептидов с КСА на уровне 1,0х10⁶ относительно исходного пищевого белка. Такое снижение антигенности характерно для смесей на основе глубокого гидролизата казеина. Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют, что значительное уменьшение содержания высокомолекулярных пептидов и снижение антигенности пептидных смесей на основе КБМС до значений, позволяющих использовать их в составе гипоаллергеных продуктов, может быть достигнуто при сочетании протеолиза этого белка алкалазой или панкреатином и последующей двукратной ультрафильтрации через мембрану УФ10. Примененный технологический подход позволяет также получать пептидные смеси на основе БКЯ, антигенность которых относительно БКЯ снижена более чем в 5,0х10⁵ раз.

References

1. Vandenplas Y., Abkari A., Bellaiche M., Benninga M., Chouraqui J.P. 7. et al. Prevalence and health outcomes of functional gastrointestinal symptoms in infants from birth to 12 months of age // J. Pediatric Gastroenterol. Nutr. 2015. Vol. 61, N 5. P. 531-537. doi: 10.1097/MPG.0000000000000949

2. van Tilburg M.A., Hyman P.E., Walker L., Rouster A., Palsson O.S., Kim S.M., Whitehead W.E. Prevalence of functional gastrointestinal disorders in infants and toddlers // J. Pediatr. 2015. Vol. 166, N 3. P. 684-689. doi: 10.1016/j.jpeds.2014.11.039

3. Schmiechen Z.C., Weissler K.A., Frischmeyer-Guerrerio P.A. Recent developments in understanding the mechanisms of food allergy // Curr. Opin. Pediatr. 2019. Vol. 31, N 6, P. 807-814. doi: 10.1097/M0P.0000000000000806

4. Szajewska H., Horvath A. A partially hydrolyzed 100% whey formula and the risk of eczema and any allergy: an updated meta-analysis // World Allergy Organ. J. 2017.Vol. 10, N 1. P. 27. doi: 10.1186/s40413-017-0158-z

5. Paparo L., Nocerino R., Bruno C., Di Scala C., Cosenza L., Bedo-gni, G. et al. Randomized controlled trial on the influence of dietary intervention on epigenetic mechanisms in children with cow’s milk allergy: the EPICMA study // Scientific Reports. 2019. Vol. 9, N 1, e2828. doi: 10.1038/s41598-019-38738-w

6. Ногаллер И.С., Гущин И.С., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов. М. : Медицина, 2008. 336 с.

7. Gmoshinsky I.V., Zilova I.S., Zorin S.N., Demkina E.Yu. Membrane technologies - an innovative method of increasing the biological value of protein for nutrition of young children. Voprosy sovremennoy pediatrii [Current Pediatrics]. 2012; 11 (3): 57-64. https://doi.org/10.15690/vsp.v11i3.297 (in Russian)

8. Kiewiet M.B.G., Faas M.M., de Vos P. Immunomodulatory protein hydrolysates and their application. Nutrients. 2018; 10 (7): E904. doi:10.3390/nu10070904

9. Quintieri L., Monaci L., Baruzzi F., Giuff rida M.G., de Candia S., Caputo L. Reduction of whey protein concentrate antigenicity by using a combined enzymatic digestion and ultrafi ltration approach. J Food Sci Technol. 2017; 54 (7): 1910-6. doi: 10.1007/s13197-017-2625-5

10. Zorin S.N., Bayarzhargal M. Obtaining of food proteins enzymatic hydrolysates using some commercial enzyme preparations and various hydrolysis schemes. Biomedicinskay himiya [Biomedical Chemistry]. 2009; 55 (1): 73-80. (in Russian)

11. Method of producing enzymatic hydrolysate of whey protein with average degree of hydrolysis: pat. 2375910 RU N 2008122014/13; appl. 03.06.08; publ. 20.12.09, Bull N 35: 19 p. (in Russian)

12. Lehrer S.B., Horner W.E., Reese G. Why are some proteins allergenic? Implications for biotechnology. Crit Rev Food Sci Nutr. 1996; 36 (6): 553-64.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.