Influence of high-fructose diet on fibronectin level in rat blood serum

• Olga G. Gileva
• Evgeny G. Butolin
• Maria V. Tereshchenko
• Arthur V. Oksuzyan

Abstract

In recent years, the consumption of diets containing a large amount of fructose has increased sharply, which is associated with the observed increase in the incidence of obesity, diabetes mellitus, metabolic syndrome, and cardiovascular diseases. Changes in lipid and carbohydrate metabolism due to increased consumption of fructose are one of the causes of destructive processes in the tissues and cells of the organism. Fibronectin, which is an adhesive and regulatory protein of the intercellular matrix, can serve as one of the markers of these processes.

The aim of the research was to study the effect of a high-fructose diet on rat serum fibronectin level.

Material and methods. The experiment was performed on 50 outbred male rats aged 5-6 months. Rats from the control group (n=25) received a balanced diet of vivarium. Animals of the experimental group (n=25) for 35 days were fed a diet containing 60% fructose, 20% protein, 14% fiber, 6% fat. From the 36^th to the 60^th day, all rats were fed usual vivarium diet. On the 60^th day, the formation of metabolic changes in the long-term period was evaluated. The animals of each group were weighed before and when removed from the experiment on the 21^st, 35^th and 60^th day. Serum was obtained from blood samples collected during decapitation on an empty stomach under short-term ether anesthesia. The concentration of cholesterol, high and low density lipoproteins, triglycerides, glucose, insulin and fibronectin were determined in serum. The atherogenic index and insulin resistance indices were calculated using the corresponding formulas.

Results and discussion. The experiment revealed a significant increase in glucose concentration from 6.52±0.35 (in control) to 7.74±0.73, 7.97±1.91 and 7.87±0.65 mmol/l and in insulin level from 1.6±0.6 to 2.3±0.4,2.6±0.6 and 3.1±0.9 pU/ml on the 21^nd, 35^th and 60^th days of the experiment, respectively, in animals of the experimental group, which is possibly associated with a sharp rise in the concentration of free fatty acids due to the special metabolism of fructose and the occurring oxidative stress, which causes cell damage and the formation of insulin resistance. This is reflected by insulin resistance indices that are different from the control: HOMA by 42.3, 49.2 and 81.3% higher, CARO by 13.3, 16.0 and 28.8% less than the control in the dynamics of the experiment. There was a tendency to an increase in cholesterol level with a significant rise on the 35^th day of the experiment by 58.9% relative to the control. A statistically significant increase in the content of low-density lipoproteins was also observed by 158, 141 and229% compared with the control. Such a rise can be associated with both increased formation of free fatty acids and lipogenetic activity of insulin. In addition, we revealed a significant increase in the content of fibronectin on days 21,35 and 60 of the experiment, respectively, from 56.5±2.8 (in control) to 74±8.1, 79±3.8 and 98±2.1 pg/ml. Fibronectin plays a significant role in tissue repair processes, providing cell migration and adhesion. Its blood level can correlate with the degree of destructive and reparative processes in the cells of liver and vascular endothelium.

Conclusion. A high-fructose diet in rats causes an increase in the studied biochemical parameters of carbohydrate and lipid metabolism, as well as an increase in blood level of the main regulatory protein of the intercellular matrix - fibronectin.

Keywords:fibronectin, fructose, glucose, insulin, insulin resistance, lipoproteins

Среди основных причин смертности населения на сегодняшний день выделяются сердечно-сосудистые заболевания, играющие существенную роль в развитии метаболического синдрома (МС) [1]. Основными биохимическими признаками МС являются инсулинорезистентность, гипергликемия, гиперинсулинемия, гипертриглицеридемия и дислипопротеинемия. Животные модели были и остаются решающими в понимании этиологии метаболических заболеваний у людей [2]. Одним из способов моделирования нарушений углеводного и липидного обмена является кормление грызунов рационом с повышенным содержанием фруктозы. Данные изменения могут оказывать атерогенное действие на стенки сосудов, что повлечет за собой формирование различного рода метаболических сдвигов. Функциональное состояние сосудистого эндотелия характеризуется как эндотелийзависимой релаксацией, так и содержанием эндотелиальных вазоактивных факторов в сыворотке крови.

Фибронектин, неколлагеновый структурный гликопротеин, является одним из ключевых белков межклеточного матрикса, который способен связывать коллаген, гиалуроновую кислоту, протеогликаны, углеводы плазматических мембран, гепарин, а также активировать трансглутаминазу. Кроме того, фибронектин способствует адгезии и распространению эндотелиальных и мезенхимальных клеток, стимулирует пролиферацию и миграцию клеток, контролирует дифференцировку и поддержание цитоскелета клеток, активно участвует в воспалительных и репаративных процессах, опосредуемых наличием в его структуре последовательности Арг-Гли-Асп, с помощью которой он может присоединяться к клеточным рецепторам (интегринам) [3]. Содержание фибронектина в сыворотке крови может быть одним из маркеров эндотелиальной активации, отражающих изменения межклеточного матрикса и сосудистой стенки при патологических состояниях.

Цель данной работы - изучение влияния высокофруктозной диеты на уровень фибронектина в сыворотке крови крыс.

Материал и методы

Работа была проведена на 50 беспородных крысах-самцах в возрасте 5-6 мес. Животных содержали в клетках при 21±3 °С и режиме освещения 12/12 ч. Работу с грызунами выполняли в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Животные были разделены на 2 группы - контрольную и опытную, по 25 особей в каждой. Крысы контрольной группы получали сбалансированную диету вивария. Животным опытной группы в течение 35 дней была назначена диета, содержащая 60% фруктозы, 20% белка, 14% клетчатки, 6% жира [4]. С 36-го по 60-й день все крысы находились на стандартном рационе вивария. На 60-й день оценивали сформированность метаболических изменений со стороны липидного, углеводного обмена в отдаленный период [5]. Крыс опытной и контрольной групп взвешивали и выводили из эксперимента на 21, 35 и 60-й день опыта натощак путем декапитации под кратковременным эфирным наркозом. Из образцов крови путем центрифугирования получали сыворотку, в которой определяли концентрацию холестерина (ХС), липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой (ЛПНП) плотности, триглицеридов, глюкозы на автоматическом биохимическом анализаторе AU-480 (Beckman Coulte, США) с использованием соответствующих тест-систем. Концентрацию инсулина определяли с помощью набора реактивов (ООО "Вектор-бест", РФ). Определение концентрации фибронектина проводили иммуноферментным методом с использованием тест-системы (ООО "Имтек", РФ). Следующие показатели рассчитывали по формулам: индекс атерогенности = (ХС -ЛПВП)/ЛПВП, индексы инсулинорезистентности: HOMA (Homeostasis Model Assessment) = (глюкоза х инсулин)/ 22,5; CARO (F. Caro, 1991 г.) = глюкоза/инсулин [6].

Таблица 1. Масса тела (г) крыс до начала и на момент выведения из эксперимента (М±т)

Table 1. The body weight (g) of rats at the beginning and at withdra wal from the experiment (M±m)

Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента для результатов, имеющих нормальное распределение (масса тела животных), и непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

В связи с отсутствием статистически значимых различий в результатах определения биохимических показателей животных контрольной группы в разные сроки для расчетов использовали их среднее арифметическое.

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента наблюдалось незначительное (p>0,05, критерий Стьюдента) увеличение массы тела животных опытной группы по сравнению с показателем крыс контрольной группы (табл. 1). Данные литературы об изменении массы тела грызунов, содержащихся на рационе, богатом фруктозой, противоречивы [4]. Ряд ученых отмечали незначительное увеличение массы тела, другие исследователи не наблюдали изменения массы тела крыс ни после 4-недельного кормления, ни в более отдаленные сроки [7].

Потребление корма с высоким содержанием фруктозы вызывало статистически значимое увеличение концентрации глюкозы с 6,52±0,35 (средняя величина в контроле) до 7,74±0,73, 7,97±1,91 и 7,87±0,65 ммоль/л и инсулина с 1,6±0,6 до 2,3±0,4, 2,6±0,6 и 3,1±0,9 мкЕд/мл соответственно на 21, 35 и 60-й день эксперимента. Метаболические превращения фруктозы могут способствовать активации глюконеогенеза с образованием глюкозы. Кроме того, рост концентрации глюкозы, вероятно, связан с формированием инсулинорезистентности в результате избыточного потребления фруктозы. Об этом свидетельствуют отличные от контроля индексы инсулинорезистентности (табл. 2).

Таблица 2. Биохимические показатели в сыворотке крови крыс [Ме (Q1; Q3)]

Table 2. Biochemical parameters of rats' blood serum [Me (Q1; Q3)]

П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое различие (p<0,05) при сравнении с контролем.

N o t e. * - statistically significant difference (p<0.05) when compared with the control.

Включение фруктозы в метаболизм через фруктозо-1-фосфат минует стадию, катализируемую фосфо-фруктокиназой, которая является регуляторным ферментом гликолиза. В результате образуется большое количество ацетил-КоА, который может поступать на синтез ХС, свободных жирных кислот, кетоновых тел, а также вступать в цикл Кребса, результатом которого является получение энергии в виде молекул адено-зинтрифосфата. В случае синтеза необходимого для организма количества энергетических эквивалентов избыток ацетил-КоА расходуется на синтез жирных кислот.

Изменение концентрации фибронектина, глюкозы и инсулина в течение эксперимента у крыс опытной группы

The change in the concentration of fibronectin, glucose and insulin during the experiment in rats of the experimental group

Свободные жирные кислоты в печени утилизируются двумя путями: либо активируют глюконеогенез, способствуя увеличению продукции глюкозы и снижению активности фосфатидилинозитол-3-киназы инсулинового рецептора, нарушая транспорт глюкозы внутрь клеток (эффект липотоксичности), усиливая тем самым гипер-инсулинемию; либо, взаимодействуя с углеводородным остовом, полученным из молекул углеводов, образуют молекулы триглицеридов [8-10]. В нашем случае мы наблюдали увеличение концентрации триглицеридов на 12,5; 32,5 и 30% в динамике эксперимента. Часть ацетил-КоА поступала на синтез ХС, рост концентрации которого у крыс опытной группы мы также наблюдали (см. табл. 2).

Известно, что инсулин повышает активность липогенетических процессов. Усиление синтеза ХС и триглицеридов в печени способствует формированию липопротеинов очень низкой плотности в большем количестве. Данные липопротеины, попадая в кровяное русло, подвергаются действию липопротеинлипазы, приводя к образованию частиц ЛПНП, обладающих повышенной атерогенностью, о чем также свидетельствует увеличение индекса атерогенности на 45,6% на 60-й день опыта (см. табл. 2).

Кроме того, нами выявлено статистически значимое повышение концентрации фибронектина в сыворотке крови крыс опытной группы на 21, 35 и 60-й день эксперимента соответственно с 56,5±2,8 (в контроле) до 74±8, 79±4 и 98±2 мкг/мл (см. рисунок).

Фибронектин - гликопротеин, находящийся в плазме, межклеточном матриксе, на поверхности клеток. Большая его часть синтезируется в печени. Он состоит из двух сходных субъединиц, молекулярная масса которых составляет около 250 кДа. Каждая субъединица содержит 9 различных в функциональном отношении областей, включающих 2 фибронектин-связывающих сайта, 2 гепарин-связывающих сайта и по одному связывающему сайту для коллагена, ДНК и клеточных поверхностей [11]. Фибронектин способствует взаимодействиям клетка-клетка, клетка - экстрацеллюлярный матрикс, а также принимает участие в формировании и реконструкции тканей [12]. Основная функция заключается в регуляции клеточных процессов, поддержании и контроле организации тканей и компонентов межклеточного матрикса. Являясь адгезивным гликопротеином, фибронектин совместно с интегринами также принимает непосредственное участие в образовании и созревании коллагеновых волокон [13], поддерживая тем самым гомеостаз внеклеточного матрикса.

Существуют плазменная и клеточная формы фибронектина. Плазменный фибронектин синтезируется гепатоцитами, циркулирует в плазме крови в растворимой, но неактивной форме. Было показано, что уровень фибронектина в плазме увеличивается вследствие патологических процессов, приводящих к повреждению сосудистой ткани, воспаления и при таких заболеваниях, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца и инсульт [14, 15]. Клеточный фибронектин синтезируется многими типами клеток, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, хондроциты, синовиальные клетки и миоциты [16].

Ранее было показано, что резистентность к инсулину и гипергликемия могут способствовать дисфункции артериальной стенки [17]. Механизмом данного процесса является усиленное образование жирных кислот, их свободнорадикальное окисление, последующий окислительный стресс и модификация инсулиновых рецепторов и клеточных мембран, что блокирует нормальную передачу сигнала в клетку и вызывает повреждение эндотелиальных клеток. Одним из маркеров эндотелиальной дисфункции и активации может являться фибронектин, увеличение количества которого наблюдалось уже на 21-й день избыточного потребления фруктозы (см. рисунок).

Данный механизм лежит в основе развития стеатогепатоза, некроза и фиброза клеток печени [18], на что также указывает рост концентрации фибронектина в динамике эксперимента, учитывая его преимущественный синтез в гепатоцитах. Поэтому содержание фибронектина в крови можно использовать в диагностике заболеваний печени и оценке степени деструктивных процессов в эндотелиоцитах, а также в других клетках и тканях в дальнейшем.

Заключение

Высокофруктозная диета не влияет на увеличение массы тела грызунов. Тем не менее она вызывает изменение биохимических показателей липидного и углеводного обмена, характерное для метаболического синдрома, следствием чего является нарушение целостности эндотелия сосудов и гепатоцитов, о чем может свидетельствовать повышенный уровень фибронектина.

References

1. Xiaoyang Chu, Kirgizova O.Yu. Metabolic syndrome: some results and prospects for solving the problem. Byulleten’ Vostochno-Sibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy Akademii meditsinskikh nauk [Bulletin of the Eastern-Siberian Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2016; 1 (5): 187–94. (in Russian)

2. Pellizzon M.A., Ricci M.R. The common use of improper control diets in diet-induced metabolic disease research confounds data interpretation: the fiber factor. Nutr Metab (Lond). 2018; 15 (3). URL: https://doi.org/10.1186/s12986-018-0243-5

3. Lykov A.P., Bondarenko N.A., Kim I.I. The effect of fibronectin on the migration potential of EA.Hy926 endothelial cell line. Byulleten’ Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk [Bulletin of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2014; 34 (4): 5–10. (in Russian)

4. Leshchenko D.V., Kostyuk N.V., Belyakova M.B., Egorova E.N., Minyaev M.V., Petrova M.B. Dietary-induced animal models of metabolic syndrome. Verkhnevolzhskiy meditsinskiy zhurnal [Verkhnevolzhsk Medical Journal]. 2015; 14 (2): 34–9. (in Russian)

5. Kawasaki T., Igarashi K., Koeda T., Sugimoto K., Nakagawa K., Hayashi S., et al. Rats fed fructose-enriched diets have characteristics of nonalcoholic hepatic steatosis. J Nutr. 2009; 139: 2067–71. URL: https://doi.org/10.3945/jn.109.105858

6. Dolgov V.V. Clinical laboratory diagnostics: National guide. In 2 vols. Moscow: GEOTAR-Media, 2013: 808 p. (in Russian)

7. Reshetnyak M.V., Khirmanov V.N., Zybina N.N. The model of metabolic syndrome caused by fructose feeding: pathogenetic relationships of metabolic disorders. Meditsinskiy akademicheskiy zhurnal [Medical Academic Journal]. 2011; 11 (3): 23–7. (in Russian)

8. Butolin E.G., Danilova O.V., Kanunnikova O.M. Study of the effectiveness of the use of water, supersaturated with air, to reduce the severity of the effects of oxidative stress in laboratory animals. III. Sugar-lowering effect of artesian water with a nanobubble gas phase: studies on laboratory rats in a hypercaloric diet and experimental diabetes mellitus. Ural’skiy meditsinskiy zhurnal [Ural Medical Journal]. 2018: (12): 150–4. (in Russian)

9. Denisov N.L., Grinevich V.B., Chernetsova E.V. Non-alcoholic fatty liver disease as a new component of the metabolic syndrome in the light of modern diagnostic methods. Vestnik Severo-Zapadnovgo gosudarstvennovo meditsinskogo universiteta im. I.I. Mechnikova[Vestnik of the North-West State Medical University Named after. I.I. Mechnikov]. 2017; 9 (1): 34–41. (in Russian)

10. Misnikova I.V. Violation of carbohydrate metabolism in the framework of the metabolic syndrome: diagnosis and treatment. Poliklinika [Policlinic]. 2016; 1 (2): 17–20. (in Russian)

11. Mogilnitskaya L.A. The content of fibronectin in the blood serum of patients with type 1 diabetes mellitus with microangiopathies, who have been ill since childhood, and in individuals with obesity. Problemy endokrinologii [Problems of Endocrinology]. 2015; (1): 36–40. (in Russian)

12. Hynes R.O. Fibronectins. Sci Am. 1986; 254 (6): 42–51.

13. Singh P., Carraher C., Schwarzbauer J.E. Assembly of fibronectin extracellular matrix. Annu Rev Cell Dev Biol. 2010; 26 (1): 397–419.

14. Peters J.H., Loredo G.A., Chen G., Maunder R. Plasma levels of fibronectin bearing the alternatively spliced EIIIB segment are increased after major trauma. J Lab Clin Med. 2003; 141: 401–10.

15. Castellanos M., Leira R., Serena J., Blanco M. Plasma cellular-fibronectin concentration predicts hemorrhagic transformation after thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Stroke. 2004; 35: 1671–6.

16. Mao Y., Schwarzbauer J.E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biol. 2005; 24: 389–99.

17. Bornfeldt K.E., Tabas I. Insulin resistance, hyperglycemia, and atherosclerosis. Cell Metab. 2011; 14 (5): 75–85.

18. Suchkova E.V. Non-alcoholic fatty liver disease: clinical, laboratory and instrumental features of the function of the liver and biliary tract, the effectiveness of combination therapy: Autobstract of Diss. Izhevsk, 2017. (in Russian)

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.