Одним из путей совершенствования методологии лабораторного контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО) является использование мультиплексирования - подхода, который позволяет увеличить число определяемых мишеней и повысить количество одномоментно обрабатываемых образцов, максимально реализуя потенциал полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Мультиплексная ПЦР предполагает применение более одной пары праймеров и зондов в одной пробирке.
Принимая во внимание многообразие существующих в настоящее время генно-инженерно-модифицированных (ГМ) линий, а также принцип количественного определения ГМО в образце, основанный на расчете соотношения ГМ-специфичной/таксон-специфичной ДНК, дизайн мультиплексных ПЦР-систем дифференцируется в зависимости от задач и стадии лабораторного исследования: на этапе скрининга целесообразно объединять различные ГМ-линии, а на этапе количественного определения - трансформационное событие с соответствующим таксон-специфичным геном.
Целью данной работы была разработка метода количественного определения содержания ДНК ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 в анализируемых образцах в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ.
Материал и методы
В качестве исходного материала для приготовления тестовых растворов ДНК использовали стандартные сертифицированные образцы ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 (кат. № ERM-BF431b) и образцы традиционного аналога (кат. № ERM-BF431a) [производства "JRC-IRMM" (Institute for Reference Materials and Measurements), Бельгия]. ERM-BF431b произведен из лиофи-лизированных клубней картофеля, концентрация ГМО составляет 100%; ERM-BF431a произведен из традиционного картофеля сорта Avebe Agro.
Тестовые растворы ДНК готовили путем разведения до уровня необходимой концентрации ДНК, выделенной из стандартного сертифицированного образца (100% ГМ-картофель), раствором ДНК, выделенной из образца традиционного аналога. Выделение ДНК осуществляли модифицированным методом щелочной экстракции по Бирнбойму-Доли и Wizard-технологии фирмы "Promega" (США) [1], количество и качество ДНК определяли по ГОСТ Р ИСО 21571-2014 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот" и ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот".
Специфичные нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23 и трансформационного события AV43-6-G7 (табл. 1), описанные ранее в работах Е.З. Кочиевой с соавт. [2], H. Gao и соавт. [3] соответственно, синтезированы Научно-производственной компанией "Синтол" (НПК "Синтол", Россия). Эффективность используемых праймеров и зондов подтверждена результатами анализа кривых плавления (диссоциации).
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов
Table 1. Primers and probes nucleotide sequences
)
Эффективность, линейность, правильность, прецизионность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой 4-кратной амплификации.
Для постановки ПЦР использовали "Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ" (НПК "Синтол", Россия). Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе CFX96TM Real-Time PCR System "Bio-Rad" (Bio-Rad, США). Данные обрабатывали с помощью пакета CFX Manager™ Software, версия 1.6.
Результаты и обсуждение
Для относительного количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 объединены две ПЦР-РВ-реакции в одной пробирке: первая, направленная на выявление специфичной трансформационному событию AV43-6-G7 последовательности ДНК (по каналу детекции флуоресценции FAM), вторая, направленная на выявление таксон-специфичного гена картофеля Stp23 [по каналу детекции флуоресценции R6G (HEX)].
При разработке протокола дуплексной ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR эмпирическим путем были оптимизированы концентрации праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы (бычий сывороточный альбумин - БСА), подобраны оптимальные температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла.
В качестве примера (рис. 1) приведены результаты подбора и оптимизации концентраций пары праймеров для идентификации трансформационного события AV43-6-G7. Оптимизацию проводили, варьируя соотношение концентраций праймеров в реакционной смеси в диапазоне от 100 до 400 нM с шагом 100 нM (для идентификации трансформационного события AV43-6-G7) и в диапазоне от 50 до 150 нM с шагом 50 нM (для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23). Для включения в состав реакционной смеси были выбраны следующие концентрации праймеров: 300 нM (для идентификации трансформационного события AV43-6-G7) и 100 нM (для идентификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23).
)
Рис. 1. Графики зависимости уровня флуоресценции от концентрации праймеров для идентификации трансформационного события AV43-6-G7: продукты амплификации ДНК с таксон-специфичными (А) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (В) праймерами
Fig. 1. Fluorescence level dependence on the primers concentration to identify the transformation event AV43-6-G7: DNA amplification products with taxon-specific (A) and event AV43-6-G7-specific (B) primers
Оптимизированный состав реакционной смеси и температурно-временной профиль реакции представлены в табл. 2 и 3.
Таблица 2. Состав амплификационной смеси
Table 2. Amplification mixture composition
)
П р и м е ч а н и е. * - 2,5-кратная реакционная смесь (НПК "Синтол", Россия) для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ROX (carboxy-X-rhodamine) содержит 25 мМ MgCl2 и 2,5 мМ каждого dNTP.
N o t e. * - 2.5-fold reaction buffer for PCR-RT in the presence of ROX (carboxy-X-rhodamine) contain 25 mM MgCl2 and 2.5 mM each deoxynucleoside triphosphates.
Таблица 3. Температурно-временной профиль реакции
Table 3. Temperature and time reaction profile
)
Относительное количество ГМ-картофеля AV43-6-G7 определяли на основании калибровочной кривой [график зависимости логарифма % концентрации от разности значений пороговых циклов (ACt) для каждой калибровочной точки], для построения которой применяли стандарты - контрольные растворы с известным содержанием ДНК картофеля. При приготовлении стандартов использовали соответствующие разведения 10% стандарта (рабочего раствора, в котором общее содержание картофельной ДНК составляет 100 нг, а содержание ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 - 10 нг). Первая точка калибровочной кривой соответствовала содержанию ГМ-компонента 5% (табл. 4, рис. 2).
Таблица 4. Количество геномных копий в стандартах, используемых для построения калибровочной кривой
Table 4. Number of DNA copies for the calibration curve drawing
)
)
Рис. 2. (Начало) Анализ продуктов амплификации ДНК с таксон-специфичными праймерами (A) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (B) в дуплексной системе. Результаты 4 независимых амплификаций
Fig. 2. (Part 1) DNA amplification products analysis for taxon-specific primers (A) and specific for transformation event AV43-6-G7 (B) in a duplex system. Results of 4 independent amplifications
)
)
)
Рис. 2. (Окончание) Анализ продуктов амплификации ДНК с таксон-специфичными праймерами (A) и специфичными трансформационному событию AV43-6-G7 (B) в дуплексной системе. Результаты 4 независимых амплификаций
Fig. 2. (Part 2) DNA amplification products analysis for taxon-specific primers (A) and specific for transformation event AV43-6-G7 (B) in a duplex system. Results of 4 independent amplifications
Количество геномных копий рассчитывали исходя из того, что одна геномная копия соответствует одной копии гаплоидной геномной ДНК картофеля весом 1,8 пкг [4].
Количественное определение содержания ГМО проводили путем экстраполяции сигнала ПЦР на стандартной кривой. Графики амплификации таксон-специфичного гена картофеля Stp23 и трансформационного события AV43-6-G7 в дуплексной системе представлены на рис. 2.
Валидность данного метода идентификации и количественного определения картофеля линии AV43-6-G7 подтверждена лабораторными исследованиями (табл. 5, 6, см. рис. 2) по [5]: были определены такие параметры, как правильность и прецизионность, характеризующие точность метода, а также линейность, пределы обнаружения и количественного определения.
Правильность метода, демонстрирующая близость результатов испытаний к истинному значению, выражаемая величиной систематической погрешности, соответствовала установленным критериям; прецизионность метода, свидетельствующая о степени близости друг к другу независимых результатов, полученных в стандартизованных условиях, выражаемая через относительное стандартное отклонение (RSDr), была приемлемой. Значение систематической погрешности и относительного стандартного отклонения результатов независимых амплификаций анализируемого фрагмента ДНК в диапазоне рабочих концентраций от 0,1 до 5% находилось в допустимом интервале значений ±25% для каждого стандартного образца (см. табл. 5).
Таблица 5. Проверка правильности метода количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7
Table 5. Accuracy (trueness) estimation of the genetically engineered AV43-6-G7 potato quantitative determination method
)
Линейность метода, характеризуемая способностью метода в пределах заданного диапазона давать результаты, величина которых изменяется в линейной зависимости от количества специфичного аналита в стандартном образце, выражаемая коэффициентом регрессии и углом наклона линии регрессии, находилась в пределах допустимых значений: внутри диапазона применения разработанного метода регистрировалась прямо пропорциональная зависимость интенсивности аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце; угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) превышал 0,98 (см. табл. 6).
Таблица 6. Проверка линейности метода количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7
Table 6. Linearity estimation of the genetically engineered AV43-6-G7 potato quantitative determination method
)
Предел обнаружения - минимальная концентрация (количество) специфичного аналита, которая может быть обнаружена данным методом, составляла 0,053% или 30 копий геномной ДНК картофеля линии AV43-6-G7 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr<25%. Предел количественного определения - минимальная концентрация (количество) специфичного аналита, которая может быть количественно обнаружена с определенной точностью данным методом - 0,15% или 86 копий геномной ДНК картофеля линии AV43-6-G7 из расчета на 100 нг суммарной ДНК, RSDr≤25% (рис. 3).
)
Рис. 3. Предел обнаружения и предел количественного обнаружения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7 в образце (А и В - переменные формулы линейной регрессии; R - коэффициент корреляции линейной регрессии; N - число образцов; SD - стандартное отклонение; P - значение)
Fig. 3. Limit of detection and limit of quantitative detection of AV43-6-G7 genetically engineered potato in the sample (A and B are the linear regression formula variables; R is the linear regression correlation coefficient; N is the number of samples; SD is the standard deviation; P is the value)
Заключение
Разработан протокол дуплексной ПЦР для количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.