Таблица 2. Относительная масса органов крыс при выведении из эксперимента (M±m, %)
Table 2. Relative mass of rat organs at the end of the experiment (M±m, %)
)
П р и м е ч а н и е. * - различие с контрольной группой достоверно (р<0,05), t-тест Стьюдента с поправкой Levene. N o t e. * - the difference with the control group is significant (p<0.05), Student’s t-test with Levene correction.
Различие между группами недостоверно (p>0,05, ANOVA, по фактору "доза" для 1-4-й групп; p>0,05, U-критерий Манна-Уитни при сравнении показателей 2-4-й групп с 1-й группой).
Fig. 2. Individual values of antigenic ovalbumin absorption into the blood 3 hours after intragastric tube administration when assessing the permeability of the rat intestine wall for protein macromolecules
The difference between the groups is insignificant (p>0.05, ANOVA, by the factor “dose" for groups 1-4; p>0.05, U-Mann-Whitney test when comparing groups 2-4 with group 1).
При выведении животных из эксперимента всасывание в кровь антигенного ОВА, позволяющее оценить проницаемость стенки кишки крыс для белковых макромолекул, составило в контрольной группе крыс (1,6±0,6)х10-5%, что типично для животных данного возраста [4]. При в/ж введении ФП не оказывал значимого влияния на этот показатель (рис. 2).
)
Рис. 2. Индивидуальные значения всасывания в кровь антигенного овальбумина через 3 ч после внутрижелудочного зондового введения при оценке проницаемости стенки кишки крыс для белковых макромолекул
Различие между группами недостоверно (p>0,05, ANOVA, по фактору ≪доза≫ для 1-4-й групп; p>0,05, U-критерий Манна-Уитни при сравнении показателей 2-4-й групп с 1-й группой).
Fig. 2. Individual values of antigenic ovalbumin absorption into the blood 3 hours after intragastric tube administration when assessing the permeability of the rat intestine wall for protein macromolecules The difference between the groups is insignificant (p>0.05, ANOVA, by the factor “dose” for groups 1-4; p>0.05, U-Mann-Whitney test when comparing groups 2-4 with group 1).
Биохимические показатели. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют, что в/ж введение ФП во всех исследованных дозах не оказывает сколько-нибудь выраженного влияния на содержание небелковых тиолов печени (см. рис. 3А), экскрецию с мочой селена (см. рис. 3Б) и креатинина (см. рис. 3В). Биохимические показатели сыворотки крови у животных, получавших ФП, не отличались от контрольных значений, за исключением небольшого (на 6%), но статистически значимого (р<0,05, U-тест Манна-Уитни) повышения уровня альбуминов при дозе ФП 1000 мг на 1 кг массы тела. Как следует из данных рис. 3Г, при наибольшей из доз ФП (1000 мг/кг) наблюдается статистически значимое (р<0,05) возрастание экскреции с мочой 8-oxo-G, являющегося маркером окислительного повреждения ДНК.
)
Рис. 3. Биохимические показатели крыс, M±m
А - содержание небелковых тиолов печени (в пересчете на восстановленный глутатион); Б - суточная экскреция креатинина; В - удельная суточная экскреция селена; Г - удельная суточная экскреция 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина; * - p<0,05 по сравнению с 1-й группой, U-критерий Манна-Уитни.
Fig. 3. Biochemical parameters of rats, M±m
A - the content of non-protein liver thiols (in terms of reduced glutathione); B - daily excretion of creatinine; C - daily excretion of selenium; D - daily excretion of 8-oxo-2-deoxyguanosine; * - p<0.05 compared with group 1, Mann-Whitney U-test.
Гематологические показатели. При минимальной дозе ФП (10 мг/кг) во 2-й группе отмечается статистически значимое (p<0,05) повышение по сравнению с контролем содержания лимфоцитов [с 9,15±0,96х109 (контроль) до 12,3±1,1х109 л-1] и снижение эозинофилов [с 2,20±0,34х108 (контроль) до 1,7±0,27х108 л-1], однако при дальнейшем увеличении дозы ФП этот эффект не воспроизводится. При дозе 100 мг на 1 кг массы тела статистически значимо (с амплитудой 5%) снижается общее число эритроцитов и гематокрит. При дозе 1000 мг/кг эти эффекты сохраняются, но для эритроцитов только на уровне тенденции (p<0,10). При дозе ФП 1000 мг/кг отмечено статистически значимое возрастание в 1,7 раза содержания базофилов [с 0,280±0,071 (контроль) до 0,500±0,083%]. Таким образом, потребление ФП в дозе до 100 мг на 1 кг массы тела не оказывает значимого по величине (выходящего за пределы вариабельности физиологической нормы) и дозозависимого влияния на гематологические показатели; при дозе 1000 мг/кг основной затронутой клеточной популяцией являются базофилы.
Апоптоз гепатоцитов. Как следует из данных, представленных на рис. 4, потребление ФП дозозависимо влияет на показатели апоптоза гепатоцитов: начиная с дозы 100 мг на 1 кг массы тела, у получавших ФП крыс статистически значимо (p<0,05) увеличивается количество клеток AnV+7AAD+ ("поздний" апоптоз) и некрозных клеток (AnV-7AAD+). При дозе 1000 мг на 1 кг массы тела дополнительно выявляются значимое (p<0,05) снижение количества живых гепатоцитов (AnV-7AAD-), возрастание количества клеток на ранней стадии апоптоза (AnV+7AAD-) и общего количества гепатоцитов в апоптозе. Таким образом, при воздействии ФП на животных, начиная с дозы 100 мг на 1 кг массы тела, наблюдается дозозависимое усиление апоптоза гепатоцитов.
)
Рис. 4. Влияние внутрижелудочного введения ферментного препарата на апоптоз клеток печени крыс, M±m
А - живые клетки (AnV-7AAD-); Б - ранний апоптоз (AnV+7AAD-); В - поздний апоптоз (AnV+7AAD+); Г - сумма клеток в раннем и позднем апоптозе; Д) некроз (AnV-7AAD+). * - p<0,05 по сравнению с 1-й группой, U-критерий Манна-Уитни.
Fig. 4. Influence of intragastric administration of the enzyme preparation on apoptosis of rat liver cells, M±m
A - living cells (AnV-7AAD-); B - early apoptosis (AnV+7AAD-); C - late apoptosis (AnV+7AAD+); D - the sum of cells in early and late apoptosis; E) necrosis (AnV-7AAD+). * - p<0.05 compared with group 1, U-Mann-Whitney test.
Молекулярно-генетические исследования ФП показали отсутствие в нем ДНК A. awamori Xyl T-15, ДНК маркеров антибиотикоустойчивости и ДНК селективных маркерных генов, гомологичных участкам генов Amp, Ori, TetO, Erm, LacZ. В ФП не выявлено содержание микотоксинов (стеригматоцистина, афла-токсина В1, Т-2 токсина, НТ-2 токсина, зеараленона, охратоксина А, фумонизинов В1, В2) в пределах чувствительности применяемого метода, живых клеток штамма A. awamori, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Обсуждение
В соответствии с законодательством в пищевой промышленности разрешается использование безопасных для здоровья штаммов микроорганизмов. Вместе с тем в процессе мутагенеза или трансгенеза генотип штамма-продуцента может быть значительным образом изменен, что может привести к приобретению им свойств патогенности, вирулентности, токсигенности и антибиотикорезистентности, и, следовательно, к негативному действию на микробиоценоз кишечника и иммунный статус организма. Производимая при помощи микробного синтеза пищевая продукция может быть в недостаточной степени очищена от ДНК штамма-продуцента и продуктов его метаболизма. Для представителей рода Aspergillus и Penicililum характерна продукция целого ряда микотоксинов, таких как охратоксины А, В, С, все виды афлатоксинов, фумонизины, глиотоксин, HC-токсин, ловастатин, 6-метилсалициловая кислота, цитринин, циклопиазоновая кислота и др., а также антибиотиков [11]. При этом далеко не все микотоксины и антибиотики анализируются при оценке безопасности ферментных препаратов. В этой связи необходимо проводить оценку рисков как штамма-продуцента, так и продуцируемой им пищевой продукции (Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств") [1, 12, 13].
Проведенные исследования показали, что максимально возможные для в/б введения дозы суспензии конидий культуры A. awamopri Xyl T-15 (1х109 КОЕ) не вызывали гибели экспериментальных животных. При этом в соответствии с МУК 2.3.2.1830-04 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов" ГМ-микроорганизмы считаются авирулентными, если LD50 - 5х108 КОЕ и более. Штамм A. awamopri Xyl T-15 не обладает инвазивными свойствами, что подтверждается отсутствием диссеминации им внутренних органов.
Ферментный препарат - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 - обладает низкой пероральной острой токсичностью для крыс (LD50>5000 мг/кг, V класс опасности, согласно ГОСТ 32644-2014 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности". В подостром эксперименте продолжительностью 80 сут в/ж введение ФП в различных дозах, в том числе существенно аггравированных по сравнению с возможными сценариями его присутствия в пищевой продукции, не отражалось на когнитивной функции крыс. ФП не оказывал выраженного влияния на обмен селена и экскреторную функцию почек. В дозе не более 100 мг/кг ФП оказывал минимальное воздействие на состояние системы кроветворения и состав лейкоцитов периферической крови, биохимические показатели сыворотки крови. Поступление ФП в организм не сопровождалось нарушением барьерной функции кишки в отношении белковых макромолекул. Наиболее чувствительным к действию ФП органом животных была печень, что выразилось в усилении апоптоза клеток при дозе ≥100 мг/кг. В наибольшей из доз ФП (1000 мг/кг) повышал у крыс экскрецию с мочой 8-oxo-G, что указывает на усиление процессов окислительной деструкции ДНК, предположительно, вследствие развития апоптоза. Величина максимальной недействующей дозы поступления ФП с пищевой продукцией составляет, по данным проведенных экспериментов, <100 мг на 1 кг массы тела в сутки, однако она нуждается в уточнении по результатам проведения исследований влияния ФП на состояние микробиоценоза кишечника и иммунный статус животных.
В Российской Федерации в превентивном порядке разработаны нормативные документы, содержащие требования к продукции микробного синтеза, разработан и применяется ряд межгосударственных и национальных стандартов, устанавливающих требования к ферментным препаратам, получаемым различными способами, и методам определения их активности [1]. Вместе с тем в последнее десятилетие накоплен достаточно большой опыт регулирования использования данного вида пищевой продукции. При этом в соответствии с требованиями Международного комитета экспертов Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН/Всемирной организации здравоохранения по пищевым добавкам (JECFA) заключение о безопасности производственных микроорганизмов дается на уровне их вида с учетом эмпирических данных отсутствия токсичности продуктов, получаемых при помощи микробного синтеза [14]. Такой подход не позволяет исключить высокого риска здоровью населения при использовании данной пищевой продукции, поскольку свойства разных штаммов, принадлежащих к одному виду, в значительной степени могут отличаться друг от друга. В ряде стран оценка рисков как штаммов-продуцентов, так и продуцируемой ими пищевой продукции может проводиться без использования токсикологических экспериментов на животных [15-17]. Приведенные в статье данные обосновывают необходимость оценки рисков пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, с учетом результатов проводимых in vivo и in vitro экспериментов, в том числе при помощи методов полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК, характеризующих наиболее точно риски использования как штамма-продуцента, так и продуцируемой ими пищевой продукции.
Заключение
Представленные экспериментальные данные позволяют сделать заключение об авирулентности штамма A. awamori Xyl T-15, отсутствии у него способности к диссеминации внутренних органов. Решение о возможном использовании ФП - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы - в пищевой и сельскохозяйственной промышленности может быть принято только после проведения молекулярно-генетического анализа рекомбинантного штамма A. awamori Xyl T-15 (ВКМ F-4278D) с целью выявления детерминант антибиотикорезистентности, анализа воздействия ФП на кишечный микробиоценоз и иммунный статус организма экспериментальных животных.
Проведение данных исследований обусловлено необходимостью совершенствования установленной в Российской Федерации системы оценки пищевой продукции, получаемой с использованием технологических микроорганизмов. Существующая несогласованность позиции JECFA и Европейского агентства безопасности пищевой продукции (EFSA) [18] в вопросе оценки рисков ферментных препаратов и их штаммов-продуцентов показывает особую актуальность проведения этой работы. Так, JECFA [12] признает микроорганизм безопасным продуцентом пищевой продукции на видовом уровне (и, следовательно, можно обойтись без их дальнейшего токсикологического исследования), основываясь на эмпирических данных об отсутствии токсичности продуктов, получаемых при помощи микробного синтеза. В соответствии с нашими данными, а также данными EFSA [18] такой подход не гарантирует безопасности этих видов пищевой продукции для населения. EFSA рассматривает безопасность микроорганизма на уровне штамма с учетом всех изменений в структуре его ДНК и условий его использования [15-17]. Особенно это касается рекомбинантных штаммов, полученных методами генной инженерии. Вместе с тем схема оценки рисков технологических микроорганизмов и продуцируемой ими пищевой продукции, принятая EFSA, допускает возможность их допуска только на основе проведения тестов ex vivo и in vitro, при наличии данных полногеномного секвенирования, подтверждающего факт отсутствия в ДНК кластеров генов, ответственных за продукцию токсичных метаболитов, и детерминант антибиотикоустойчивости, а также остатков векторной ДНК и маркеров отбора, применяемых в процессе генной инженерии. Возможность такого подхода обосновывается этическими вопросами проведения экспериментов in vivo, а также их высокой стоимостью. Представленные в статье данные показали неприемлемость такого подхода и обязательность проведения экспериментов с использованием экспериментальных животных, поскольку применение метода аналогий безопасности штаммов, имеющих общий штамм-реципиент, и продуцируемой ими пищевой продукции на основе анализа данных об их токсичности только для различных линий культур клеток, может привести к недооценке рисков здоровью населения продукции микробного синтеза.
Литература
1. Багрянцева О.В. Обоснование необходимости разработки мероприятий по управлению рисками, связанными с использованием пищевой продукции, производимой при помощи микробного синтеза // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 2. С. 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017
2. Рожкова А.М., Середа А.С., Цурикова Н.В., Нуртаева А.К., Семенова М.В., Римарева Л.В. и др. Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе рекомбинантного штамма гриба Aspergillus awamori // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47, № 3. С. 308-317.
3. Римарева Л.В., Цурикова Н.В., Костылева Е.В., Середа А.С. Рекомбинантный штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori - продуцент комплекса ферментов глюкоамилазы и ксиланазы. Пат. РФ № 2457246, приоритет от 21.03.2011.
4. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : National Academies Press, 2011.
5. Пивоваров Ю.П., Мялина Л.И., Королик В.В. и др. Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза. Методические указания. Москва, 1992. 22 с.
6. Гаузе Г.Ф. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. Москва : Книга по Требованию, 2014. 248 с. ISBN 978-5-458-47107-7.
7. Loskutova L.V., Dubrovina N.I., Markel’ A.L. Comparative analysis of the persistence of a conditioned passive avoidance reflex in rats with different forms of inherited hypertension // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. Vol. 37, N 6. P. 577-582. DOI: https://doi.org/10.1007/s11055-007-0055-y
8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.
9. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена // Журнал аналитической химии. 1995. Т. 50, № 8. С. 492-497.
10. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. 2002. Vol. 46, N 2. P. 129-131. DOI: https://doi.org/10.1016/s1043-6618(02)00080-4
11. Gallo A., Ferrara M., Perrone G. Phylogenetic study of polyketide synthases and nonribosomal peptide synthetases involved in the biosynthesis of mycotoxins // Toxins. 2013. Vol. 5. P. 717-742. DOI: https://doi.org/10.3390/toxins5040717
12. Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use // CAC/GL 46-2003. 13 p. URL: http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/en/
13. Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use // EFSA J. 2011. Vol. 9, N 6. Article ID 2193. 54 p. URL: http://www.efsa.europa.eu
14. Principles and methods for the risk assessment of chemicals in food. Environmental health criteria 240. World Health Organization, 2009. Updated in 2020. 34 p. ISBN: 9789241572408.
15. Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Gironeset R. et al. Statement on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 7: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2017. EFSA BIOHAZ Panel (EFSA Panel on Biological Hazards) // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 1. Article ID 5131. 43 p. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5131
16. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 6. Article ID 5294. 35 р. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5294.
17. Silano V., Baviera B.J.M., Bolognesi C., Bruschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R. et al. Statement on the characterisation of microorganisms used for the production of food enzymes. EFSA CEP Panel (EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids) // EFSA J. 2019. Vol. 17, N 6. Article ID 5741. 13 p. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5741
18. Analysis of JECFA’s draft guideline on "Evaluation of enzyme preparations used in the manufacture of foods" // EFSA Supporting publication 2020. EN-1795. 8 p. DOI: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2020.EN-1795