Detection of recombinantDNA in foods from Stacked Genetically Modified plants

• Elena Yu. Sorokina
• O.N. Chernyshova

AbstractA quantitative real-time multiplex polymerase chain reaction method was applied to the detection and quantification of MON863 and MON810 in stacked genetically modified maize MON 810ЧMON 863. The limit of detection was approximately 0,1%. The accuracy of the quantification, measured as bias from the accepted value and the relative repeatability standard deviation, which measures the intra-laboratory variability, were within 25% at each GM-level. A method verification has demonstrated that the MON 863 and the MON810 methods can be equally applied in quantification of the respective events in stacked MON810ЧMON 863.

Keywords:food, genetically modified organisms (GMO), stacked genetically modified plant, recombinant DNA, polymerase chain reaction

Рост мирового производства генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в последние годы в значительной степени происходит за счет зерновых культур, являющихся носителями нескольких генетических конструкций или одной, содержащей несколько смысловых генов (stacked events) [11]. Такие культуры к началу 2011 г. выращивали в 11 странах мира; они составляли 22% мировых посевных площадей, занятых ГМО [11].

Для мониторинга производства и оборота ГМО в большинстве стран мирового сообщества в законодательном порядке введено требование обязательного этикетирования пищевой продукции, содержащей ГМО или произведенной из ГМО [5, 13, 14]. Разработаны, стандартизированы и внедрены в практику методы идентификации и количественного определения рекомбинантной ДНК, являющейся мишенью для обнаружения ГМО [1-3, 7, 9, 16]. Выход на мировой продовольственный рынок пищевой продукции, произведенной из генно-инженерно-модифицированных культур с комбинированными признаками, потребовал разработки новых методических подходов, обеспечивающих определение нескольких трансформационных событий и смысловых генов. Для этих целей используют мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с электрофоретической или гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов и ген-чип-технологии [8, 10, 12, 15].

Целью настоящей работы была оценка применения мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов в реальном времени с использованием праймеров на трансформационные события* MON810 и MON863 для количественного определения рекомбинантной ДНК, характерной для генетически модифицированной кукурузы, и трансформационное событие* MON810ЧMON863, являющейся гибридным растением с комбинированными признаками.

Таблица 1. Структура праймеров и зондов, используемых для исследования рекомбинантной ДНК

Материал и методы

Гибрид MON 810ЧMON 863 получен путем традиционного скрещивания 2-х ГМО: кукурузы, устойчивой к жесткокрылым насекомым, в том числе к жуку диабротика (Diabrotica spp.), трансформационное событие MON863, и кукурузы, устойчивой к чешуекрылым насекомым, в том числе к зерновому точильщику (Ostrinia nubilalis), трансформационное событие MON810.

Учитывая возможность применения методов количественного определения рекомбинантной ДНК с праймерами, специфичными для трансформационных событий MON810 и MON863, для анализа гибридной линии MON810ЧMON863 использовали методы, которые соответствовали методам определения правильности и прецизионности стандартого метода измерения [4]. Проведено исследование образцов муки, полученной из зерна кукурузы линий MON810 и MON863, а также образцов муки, полученной из гибрида MON810ЧMON863. Тестируемая кукурузная мука содержала до 10,0% целевой ДНК. Для оценки специфичности метода исследовали образцы муки кукурузы линий NK 603 и сои линии 40-3-2. Каждый анализ проводили в 6 повторах. При приготовлении образцов кукурузной муки и построении калибровочных прямых были использованы следующие сертифицированные стандартные образцы, изготовленные в Институте стандартных материалов и измерений (Бельгия), - ERM-BF413b, ERM-BF 413d, ERM-BF 413f (линия MON 810); ERM-BF 416b, ERM-BF 416c, ERM-BF 416d (линия MON 863); ERM-BF 415d (линия NK 603); ERM-BF410dk (линия 40-3-2); ERM-BF 417b, ERM-BF 417c и ERM-BF 417d (гибрид MON810ЧMON863) [6].

ДНК из 50 мкг каждого образца выделяли стандартным методом с использованием сорбента и набора реагентов "ДНК-сорб-С" (производство ФГУН "ЦНИИЭ Роспотребнадзора", Москва). Для определения относительного содержания рекомбинантной ДНК, характерной для кукурузы линий MON810 и MON863, использовали мультиплексную ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией результатов в реальном времени. Анализ включал 2 реакции с зондами TagMan, специфичными для трансформационных событий MON 810 и MON 863. В качестве эндогенного контроля использовали ДНК генов, присутствующих в геноме всех линий кукурузы: ген алкогольдегидрогеназы-1 (Adh1) и ген, кодирующий синтез высокомобильной группы белков (hmg). Структура праймерных систем представлена в табл. 1. Для каждой праймерной системы использовали отдельную реакционную смесь. Состав реакционной смеси представлен в табл. 2. Реакция проходила при следующих температурных параметрах: 95°С - 15 мин, далее 40 циклов: 95 °С - 10 сек, 59°С - 60 сек. Для проведения амплификации использовали амплификатор "RotorGene-6000" (Германия).

Таблица 2. Состав реакционной смеси для проведения количественного анализа целевой ДНК, общая схема

Результаты и обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что методом ПЦР с гибридизационнофлюоресцентной детекцией и использованием праймеров на трансформационные события, рекомбинантная ДНК, характерная для кукурузы линий MON810 и MON863, количественно определяется во всех образцах муки, полученной из гибридной кукурузы MON810ЧMON863 (табл. 3, 4). Количественная идентификация целевой ДНК в образцах муки из гибридной кукурузы, содержащей 0,1% ГМО, подтверждает предел количественного определения оцениваемых методов [18]. Отсутствие положительного результата при анализе образцов муки, произведенной из кукурузы линии NK 603 и сои линии 40-3-2, свидетельствует о специфичности методов трансформационным событиям MON810 и MON863.

Относительное стандартное отклонение повторяемости результатов при тестировании образцов муки, полученных из зерна кукурузы линий MON 810, MON 863 и гибрида MON 810ЧMON 863 не превышало 25% при всех уровнях ГМО (табл. 3, 4).

Таблица 3. Сравнение точности и прецизионности метода количественного определения MON 810 при исследовании образцов муки из зерна кукурузы линии MON810 и гибридной кукурузы MON 810ЧMON863

Таблица 4. Сравнение точности и прецизионности метода количественного определения MON863 при исследовании образцов муки из зерна кукурузы линии MON863 и гибридной кукурузы MON810ЧMON863

Эти результаты свидетельствуют о соответствии прецизионности [4] требованиям, предъявляемым к методам количественного определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах [17]. Следует также отметить близость значений стандартного отклонения повторяемости при анализе муки из гибридной кукурузы и кукурузы линий MON810 и MON863.

Анализ систематической погрешности результатов показал ее увеличение при тестировании образцов муки из гибридной кукурузы по сравнению с результатами тестирования образцов из зерна кукурузы конкретных линий (см. табл. 3, 4.) Вместе с тем это увеличение не превысило 25% для всех уровней ГМО, что находится в соответствии с требованиями, предъявляемыми к методам количественного определения ГМО [17]. Полученные данные согласуются с результатами исследований гибридных сортов кукурузы с комбинированными признаками, проведенными в лабораториях европейских научных центров [17, 18].

Таким образом, результаты анализа пищевых продуктов, произведенных из конкретных линий ГМО MON810 и MON863 и гибридной линии, позволяют сделать следующий вывод. По результатам сравнения показателей точности, презиционности, пределу количественного определения, специфичности методов ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией и использованием праймеров на трансформационные события эти методы можно применять для количественного определения рекомбинантной ДНК, содержащейся в пищевой продукции, произведенной из гибридных генно-инженерно-модифицированных растений с комбинированными признаками.

Литература

1. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения. ГОСТ Р 52173-2003. - М.: Госстандарт России, 2004. - 11 с.

2. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа. ГОСТ Р 52174-2003. - М.: Госстандарт России, 2004. - 14 с.

3. Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. МУК 4.2.2304-07. Сборник методических указаний. Ч. 1. - Роспотребнадзор, 2008. - 83 с.

4. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений. ГОСТ ИСО 5725-4-2002. - M.: Госстандарт России, 2002. - 32 с.

5. Федеральный закон Российской Федерации от 25 октября 2007 г. N 234-ФЗ "О внесении изменений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей”" и часть вторую Гражданского кодекса Российской Федерации. Сertified Reference Materials 2011. The Institute for Reference Materials and Measurements, JRC. EС. цитировано по http://irmm.jrc.ec.europa.eu.

6. Compendium of reference methods for GMO analysis. JRC Reference reports, European Network of GMO Laboratories. - 2011. - 259 p.

7. Dinon A.Z., Rins T. W., Dijk J.P. et al. // Anal. Bioanal. Chem. - 2011. - Vol. 400. - P. 1433-1442.

8. Foodstuffs - Methods of analysis for genetically modified organisms and derived products. Quantitative nucleic acid based methods. Reference N ISO 21570:2005(E). - Geneva: ISO, 2005. - 94 р.

9. Gasparic M.B., Tengs T., La Paz J.L. et al. // Anal. Bioanal. Chem. - 2010. - Vol. 396. - P. 2023-2029.

10. Global Status of Commercialized Biotech. GM Crops:2010. ISAAA Brief 42-2010. Цит. по: http://www.isaaa.org.

11. Kim Su-Y., Kim J., Lee H. et al. // Food Sci. Biotechnol. - 2010. - Vol. 19,N. 4. - P. 1029-1033.

12. Labeling Standard for Genetically Modified Foods. Notification N 517 of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of March 31. - 2000. Цит. по: http://faolex.fao.org/docs/pdf/jap27575.pdf.

13. Regulation (EC) N 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed // Official Journal of the European Union. - 2003. - L. 268. - Р. 1-26.

14. Shrestha H.K., Hwu K-K., Chang M.-C. // Afr. J. Biotechnol. - 2010. - Vol. 9, N 34. - P. 5581-5589.

15. Sun H.C. // Anal. Bioanal. Chem. - 2011. - Vol. 401. - P. 6 47- 6 5 5 .

16. Verification of Performances of MON 863 and MON 810 Event-specific Methods on the Hybrid MON 863 x MON 810 using Real-Time PCR. Сommunity reference laboratory for GM food and feed, 2006. Цит. по: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.