В настоящее время у большей части трудоспособного населенеия выявляются симптомы дезадаптации, проявляющейся в снижении неспецифической резистентности организма к неблагоприятным факторам окружающей среды. Основная причина этого широко распространенного состояния, ухудшающего здоровье человека, - недостаточная обеспеченность его организма биологически активными веществами, прежде всего витаминами и микроэлементами [2, 10]. Наряду с алиментарными немаловажное значение имеют социально-психологические факторы, воздействующие в процессе нервно-эмоциональной деятельности. В первую очередь это относится к работникам медицинской сферы (особенно к врачам-хирургам), специфика трудовой деятельности, условия и содержание труда которых связаны с высокой ответственностью за жизнь пациентов, а также с влиянием химических, биологических и физических факторов производственного характера, что также снижает уровень их здоровья. Среди медицинских работников широко распространены сердечно-сосудистая патология, заболевания желудочно-кишечного тракта, приступообразная головная боль и др. [8]. Вместе с тем исследование влияния указанных рабочих факторов стресса на организм (в частности на эритроциты крови как модели изучения стрессовой нагрузки на биомембраны клеток) не получило должного развития. В то же время такие свойства, как деформированность, осмотическая резистентность, способность клеток к агрегации, - все, от чего зависит продвижение клеточных элементов крови, в частности эритроцитов по сосудистому руслу, а следовательно, и поступление кислорода в органы и ткани организма - определяется лабильностью мембран (оболочек) клеток красной крови [4]. Стойкость их оболочек, в свою очередь, регулируется комплексом взаимосвязанных изменений в структуре их липидного бислоя. При этом важное значение имеют соотношение фосфо- и нейтральных липидов, а также отношение холестерин/фосфолипиды [15]. Биохимический механизм метаболических нарушений в организме при стрессе имеет универсальный характер. На первом этапе влияние стресса сопровождается образованием семихинонных радикалов адреналина, инициирующих свободнорадикальные реакции, что в дальнейшем активизирует процесс оксидативного разрушения липидов, нарушение структурной организации оболочек эритроцитов и, соответственно, развитие тканевой гипоксии [6]. Это делает актуальным изучение глубоких биохимических механизмов влияния стрессовых факторов на липидную составляющую оболочки эритроцитов с целью профилактики и коррекции последствий воздействия на клетки указанных факторов.
Перспективным направлением сохранения здоровья является снижение факторов стресса за счет рациональной организации труда и сбалансированного питания. Концепция государственной политики в области здорового питания населения России в качестве основных приоритетов предусматривает развитие научно обоснованного производства продовольственного сырья и функциональных пищевых продуктов, обогащенных биологически активными веществами [11]. В последнее время все большее внимание привлекают к себе биологически активные добавки к пище (БАД) как дополнительный источник антиоксидантов, которые в основном являются полифенольными соединениями. Они входят в состав традиционно употребляемых человеком растительных продуктов (фрукты, овощи, ягоды и др.), поэтому эволюционно адаптированы для человеческого организма. Природные полифенолы, в отличие от синтезированных, характеризуются крайне низкой токсичностью, не вызывают побочных реакций (аллергию, эффектов привыкания и накопления). Хорошо известен [18] широкий спектр биологической активности растительных полифенолов, которые, обладая антиокислительными свойствами, способны выступать своеобразными "ловушками" свободных радикалов различного типа. Полифенолы защищают организм от проявлений оксидативного стресса, образуют комплексы с ионами переходных металлов, влияют на активность металлозависимых ферментов, блокируют процессы перекисного окисления липидов, взаимодействуют с биологическими мембранами, меняя их структурные характеристики [19]. В связи с этим была создана растительная БАД к пище, приготовленная на основе ягод калины (Viburnum sargentii Koehne). Она запатентована как средство, обладающее антирадикальной активностью (патент № 2 220 614, приоритет от 20.09.2001) и предлагается к употреблению (свидетельство на товарный знак № 228 327, ТУ 9168-079-00480052-07).
Нами изучена возможность использования этой БАД для профилактики нарушений физиологических и структурных свойств эритроцитов крови врачей-хирургов, испытывающих в процессе работы значительные стрессовые нагрузки.
Материал и методы
Обследованы женщины врачи-хирурги лечебно-профилактических учреждений Владивостока в возрасте 40-50 лет. В 1-ю группу (группа сравнения) было включено 20 здоровых женщин (доноры), во 2-ю - 27 врачей (хирурги), подвергающихся в течение рабочего дня комплексному стрессовому воздействию (химический, психоэмоциональный, напряженность трудового процесса и др.). 3-ю группу составили те же 27 хирургов, которые после предварительного биохимического обследования крови ежедневно утром после еды принимали в течение 6 нед по 2,5 мл БАД к пище, приготовленной на основе калины. Эта доза экстракта соответствует профилактической, равной 100 мг общих полифенолов в сутки [3].
Химический состав БАД, используемой в виде водно-спиртового (40%) экстракта, был исследован с помощью жидкостного хроматографа "Controller LCC 500" (Pharmacia). В БАД входят различные биологически активные вещества: лейкоантоцианы, катехины и их полимерные формы, олигомерные таннины, лигнин, флавонолы, органические кислоты (фумаровая, аскорбиновая, глицериновая, галактуроновая и др.), свободные аминокислоты (гистидин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, треонин, серин, глицин, цистеин, метионин, изолейцин, тирозин и др.), сахара (сахароза, рафиноза) и другие органические соединения. Полифенолы составляют свыше 60% от сухого остатка экстракта.
Мазки крови, взятой у обследуемых всех групп, окрашивали азур-эозиновыми красителями. В мазках с помощью окуляр-микрометра определяли средний диаметр эритроцитов (СДЭ), по методу Б.Л. Эндрю [12] рассчитывали средний объем эритроцита (СОЭр) и осмотическую резистентность (гемолиз) эритроцитов (ОРЭ) к изменению концентрации NaCl. Эритроциты крови, взятой в пробирку, выделяли по общепринятому методу. В оболочке эритроцитов определяли содержание общих (нейтральных) липидов [16] и общих (нейтральных) фосфолипидов (ФЛ) [25]. Методом одномерной микротонкослойной хроматографии в системе растворителей [13] определяли содержание отдельных фракций общих липидов - триацилглицеридов (ТАГ), свободных жирных кислот (СЖК), эфиров жирных кислот (ЭЖК), холестерина (ХС), эфиров холестерина (ЭХС). Методом двумерной микротонкослойной хроматографии [24] в системе предложенных растворителей [22] определяли следующие фракции фосфолипидов: фосфатидилхолин (ФХ), лизофосфатидилхолин (ЛФХ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидная кислота (ФК). Содержание отдельных фракций липидов и фосфолипидов выражали в процентах соответственно от общей суммы нейтральных липидов и нейтральных фосфолипидов. Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.
Полученные результаты обрабатывали статистически по программе Instat (Graph Pad Software Inc. USA) с вычислением параметрического критерия Стьюдента (t), средней арифметической (М) и ее ошибки (m).
Результаты и обсуждение
При определении СДЭ и СОЭр при первичном обследовании врачей (2-я группа) отмечались однонаправленные изменения в сторону увеличения. Так, СДЭ достоверно превышал контрольные значения на 2% (7,82±0,05 против 7,64±0,04 мкм в контроле; р<0,05), а СОЭр - на 7% (95,78±0,78 против 89,19±0,81 мкм3; р<0,001). Увеличение объема эритроцитов, как известно, замедляет их прохождение в кровеносных капиллярах и способствует развитию тканевой гипоксии. Также был обнаружен сдвиг порога начала (0,50±0,01% NaCl) и окончания (0,40±0,01% NaCl) гемолиза эритроцитов (в норме он начинается при концентрации 0,45% NaCl, а завершается при 0,35% NaCl). Иными словами, мембрана эритроцитов обладает пониженной устойчивостью к гемолизирующему агенту. Отмечалось снижение на 8% (р<0,05) количества общих фосфолипидов в эритроцитах (57,39±1,14 против 62,38±1,78% в контроле). Обнаружено увеличение содержания ХС на 21% (р<0,001) (табл. 1). В результате увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,49±0,02 (в контроле - 0,39±0,04), что свидетельствует о повышении жесткости мембран эритроцитов и снижении их лабильности. Следует отметить, что в составе нейтральных липидов эритроцитов обследованных врачей-хирургов отмечалось достоверное увеличение содержания ТАГ на 14% (р<0,01) и СЖК на 26% (р<0,001) по сравнению со значениями, наблюдавшимися в группе сравнения. Одновременно снижался уровень эфиров ЭЖК и ЭХС соответственно на 14 (р<0,01) и 18% (р<0,05). Данные факты указывают, с одной стороны, на активизацию в мембране эритроцитов адаптационных процессов, направленных на стабилизацию за счет увеличения содержания ХС, а с другой - на увеличение интенсивности липолитических процессов в жировой ткани (стрессовая реакция) и, как следствие, нарушение соотношения липидов в организме [5].
Таблица 1. Содержание фракций нейтральных липидов в эритроцитах крови (в % от суммы всех фракций; M±m)
Изменения в фосфолипидном спектре оболочки эритроцитов подтверждают нарушения их проницаемости (табл. 2). Это проявлялось в увеличении на 59% по сравнению с контролем содержания ЛФХ (р<0,001), которое обусловлено активированием фосфолипазы А2. При этом наблюдалось достоверное снижение содержания основного структурного компонента мембран - ФХ на 10% (р<0,001). Известно, что при активации свободнорадикальных процессов в организме окислению в первую очередь подвергаются полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, что и вызывает уменьшение содержания соответствующих фракций [9]. Обращает на себя внимание снижение количества ФИ на 12% (р<0,05) и ФК на 15% (р<0,05), которые необходимы для функционирования мембраносвязанного фермента Na+/K+АТФазы [23]. Следует отметить увеличение уровня СМ на 15% (р<0,001), что является защитной реакцией организма на повышение проницаемости мембран. Таким образом, под действием стрессовых факторов произошло рассогласование липидной составляющей мембран эритроцитов, что и обусловило их ранний гемолиз.
Перераспределение фосфолипидных фракций внутри мембранного бислоя, в частности наружного монослоя, характеризуется расчетом коэффициента ФХ/СМ (Кфх/см), который у обследуемых 3-й группы отличается от соответствующего показателя в группе сравнения. Так, у врачей-хирургов Кфх/см = 1,15 (в контроле - 1,47), что предполагает снижение жидкостных свойств (в мембранах с высоким содержанием холестерина низкое содержание воды) и увеличение микровязкости липидного бислоя [14].
Асимметрия липидного бислоя оболочки эритроцитов проявляется не только на структурном, но и на функциональном уровне. ФХ - основной структурный фосфолипид - относится к числу нейтральных фосфолипидов. Сбалансированность электростатического заряда полярной головки ФХ детерминирована эфирной связью между положительно заряженным холином и отрицательно заряженным радикалом фосфорной кислоты.
СМ, как и ФХ, является нейтральным фосфолипидом, он локализован во внешнем монослое липидного бислоя. При его биосинтезе используется фосфорилхолиновая группа. Нейтральные фосфолипиды представляют группу трудноокисляемых соединений. ФС, ФИ и ФК, расположенные на внутренней стороне бислоя, несут отрицательный заряд.
Вследствие электростатических сил наличие отрицательно зараженных фосфолипидов приводит к разрыхлению бислоя. Отрицательно заряженные головки фосфолипидов притягивают положительно заряженные ионы H+ и отталкивают отрицательно заряженные гидроксильные группы из водной среды, что обусловливает легкую окисляемость фосфолипидов этой группы. ФЭ имеет слабый отрицательный заряд. Расчет коэффициента окисляемости, характеризующего отношение легкоокислямых фосфолипидов к трудноокисляемым (ФК+ФС+ФЭ+ФИ)/(ФХ+СМ) показал, что его величина снижалась. Так, у обследуемых 2-й группы К = 0,70 (в группе сравнения - 0,74). Уменьшение коэффициента окисляемости принято рассматривать в качестве критерия повышения микровязкости и жесткости оболочки эритроцитов [7].
На основании вышеизложенного следует, что действие комплексных стрессовых факторов на врачей-хирургов сопровождается неспецифической реакцией организма, которая проявляется в изменении липидной части оболочки эритроцитов и обусловливает увеличение размерных характеристик клеток, а также сдвиг осмотической резистентности в сторону снижения устойчивости к гемолизирующему агенту. Изменение соотношения фосфолипидных фракций в оболочке эритроцитов косвенно предполагает потерю ею воды и повышение вязкости и жесткости.
Таблица 2. Содержание фракций фосфолипидов в эритроцитах крови (в % от суммы всех фракций; M±m)
Для сохранения работоспособности и здоровья медицинских работников проведена фармакологическая профилактика с помощью приготовленной на ягодах калины БАД к пище, обладающей антиоксидантными и антирадикальными свойствами. Применение в течение 6 нед данной БАД сопровождалось восстановлением СДЭ (7,64±0,03 мкм), СОЭр (89,00±0,85 мкм3) и осмотической резистентности, что соответствует показателям в группе сравнения. Начало гемолиза эритроцитов понизилось до 0,43±0,01% NaCl, а его завершение - до 0,33±0,01% NaCl. Обращает на себя внимание факт более сильной устойчивости эритроцитов к понижению концентрации NaCl. Границы устойчивости выросли на 0,02% NaCl по сравнению с показателями в контроле. Это положительный признак, так как он свидетельствует о повышении эластичности оболочки эритроцитов и их лабильности при прохождении по микроциркулярному руслу.
После приема используемой БАД к пище содержание фракций нейтральных липидов соответствовало значениям, наблюдавшимся в группе сравнения. Для выяснения биохимических механизмов мембранопротекторного эффекта БАД, приготовленной на основе ягод калины, сравнивали биохимические параметры до и после приема указанной БАД (2-я и 3-я группы). Так, в эритроцитах врачей 3-й группы (после приема БАД) отмечалось снижение содержания ТАГ на 19% (р<0,001), ХС - на 15% (р<0,001), увеличение количества ЭЖК на 14% (р<0,05) и ЭХС - на 25% (р<0,001) по сравнению с показателями в эритроцитах обследованных 2-й группы (до приема используемой БАД к пище). Феномен снижения уровня холестерина и увеличения его эфиров объясняется тем, что молекулы полифенолов активируют фермент лецитин-холестерин-ацилтрансферазу (ЛХАТ) [3], обусловливающий выведение холестерина из мембран и поступление в гепатоцит возросшего потока холестерина в этерифицированной форме в составе липопротеидов высокой плотности.
Применение БАД на основе ягод калины нормализовало содержание практически всех фракций фосфолипидов относительно уровня у обследуемых лиц 1-й группы. Однако при сравнении результатов до и после приема экстракта отмечалось достоверное снижение содержания ЛФХ на 48% (р<0,001) и СМ на 9% (р<0,01). Также следует отметить равнозначное увеличение, в среднем на 15-16% (р<0,05), количества ФИ и ФК, что обусловлено их использованием в синтезе фосфолипидов для восстановления структуры мембран эритроцитов, нарушенных стрессом. Снижение количества ТАГ на 19% (р<0,001) тесно коррелирует с увеличением уровня ФХ на 12% (р<0,05) (r=-0,88). Данный факт обусловлен синтезом фосфолипидов из ТАГ [5].
Таким образом, при исследовании физиологических и биохимических показателей эритроцитов крови у врачей-хирургов лечебно-профилактических учреждений Владивостока установлена выраженная картина изменений, характерных для воздействия стрессовых факторов. Применение БАД, приготовленной на основе ягод калины, в течение 6 нед нормализовало метаболические реакции. Биохимический механизм сохранения метаболизма обусловлен тем, что растительные полифенолы, входящие в состав указанной БАД к пище, стимулируют этерифицирующую функцию печени, которая подавляется в результате воздействия стресса. Тем самым нормализуется соотношение липидных компонентов в липопротеидах, являющихся, как известно, поставщиками фосфолипидов в оболочки эритроцитов. Это подтверждается увеличением количества ФХ и метаболически активных фракций, ростом содержания ЭХС (полифенолы активируют фермент ЛХАТ) [3]. Факт достоверного снижения в оболочке эритроцитов уровня лизофракций (ЛФХ и ЛФЭ) свидетельствует об ингибировании фосфолипаз полифенолами [17]. Кроме того, растительные полифенолы, входящие в состав используемой БАД к пище, способны улавливать свободные оксигенные и пероксильные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал [21]. Это значительно сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса [20]. Профилактический эффект объясняется тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью оболочки эритроцитов, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивая прочность поверхностного слоя клеток и, соответственно, снижая возможность атаки радикалами [1]. Это оправдывает применение БАД с полифенольными комплексами как в профилактических (до стрессового воздействия), так и в терапевтических (в процессе его развития и после завершения) целях.
На основании полученных результатов можно заключить, что использование БАД, приготовленной на основе ягод калины, у медицинских работников, подвергающихся профессиональному стрессу, способствует улучшению функциональных и структурных характеристик эритроцитов.
Литература
1. Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р., Спирихин Л.В. и др. // Хим.-фарм. журн. - 2007. - Т. 41, № 7. - С. 12-14.
2. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. // Ведомости фарм. комитета. - 1999. - № 2. - С. 9-12.
3. Гаскина Т.К., Курилович С.А., Горчаков В.Н. // Вопр. мед. химии. - 1989. - Т. 35, № 4. - С. 24-28.
4. Зинчук В .В. // Успехи физиол. наук. - 2001. - Т. 32, № 3. - С. 66-78.
5. Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г., Фоменко С.Е. и др. // Гиг. и сан. - 2005. - № 5. - С. 17-21.
6. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Слово, 2006. - 556 с.
7. Микаелян Э.М., Овакимян С.С., Карагезян К.Г. // Вопр. мед. химии. - 1987. - № 4. - С. 109-111.
8. Нафиков Р.Г., Галимов А.Р., Погадаев М.Е. и др. // Мед. труда и пром. экол. - 2005. - № 7. - С. 15-17.
9. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Рахманин Ю.А. // Гиг. и сан. - 2003. - № 3. - С. 57-60.
10. Тутельян В.А. Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы VIII Междунар. съезда "Фитофарм-2004", 21-23 июня 2004 г., Миккели, Финляндия. - СПб.: ВВМ, 2004 - C. 595-598.
11. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Керимова М.Г. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 39-43.
12. Эндрю Б.Л. Экспериментальная физиология. - М.: Мир, 1972. - 324 с.
13. Amenta J .S. // J. Lipid Res. - 1964. - Vol. 5, N 2 - P.270-272.
14. Broncel M., Chojnowska-Jezierska J., Koter-Mikhalak M. et al. // Pol. Arch. Med. Wewn. - 2005. - Vol. 113, N 6. - P. 531-537.
15. Filippov A., Oradd G., Lindblom G. // Biophys. J. - 2003. - Vol. 84, N 5. - P. 3079-3086. 16. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. // Biol. Chem. - 1957. - Vol. 226. - P. 497-509.
17. Kropacova, K. Misurova E, Hakova H. // Radiats. Biol. Radioecol. - 1998. - Vol. 38, N 3. - P. 411-415.
18. Middleton E.J., Kandaswami C., Theoharides T.C. // Pharmacol. Rev. - 2000. - Vol. 52. - P. 673-751.
19. Pietta P .G. // J. Nat. Prod. - 2000. - Vol. 63, N 7. - P. 1035-1042. 20. Pignatelli, P., Ghiselli A., Buchetti B. et al. // Atherosclerosis. - 2006. - Vol. 188, N 1. - P. 77-83.
21. Re R., Pellegrini N., Proteggente A. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol. 26, N 9-10. - P. 1231-1237.
22. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. // J. Chromatogr. - N.Y.: Dekker, 1967. - Vol. 1. - P. 99-162.
23. Satoh T., Cohen H.T., Ratz A.I. // Clin. Invest. - 1993. - Vol. 91. - P. 4 0 9 - 415 .
24. Svetachev V.I., Vaskovsky V.E. //J. Chromatogr. - 1972 - Vol. 67, N 2 - P. 376-378.
25. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. // J. Chromatogr. - 1975. - Vol. 70, N 1. - P. 129-141.