Urinary miRNA expression in cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) fed high salt rations

• Sergey V. Orlov
• Olga N. Beresneva
• Mikhail I. Zaraisky
• Dzhina D. Karal-Оgly
• Marina M. Parastaeva
• Galina T. Ivanova
• Anatoly G. Kucher
• Alexander N. Kulikov
• Alexey V. Smirnov
• Ivan G. Kayukov

Abstract

High food intake of sodium chloride is associated with damage not only the cardiovascular system, but also the kidneys. The mechanisms of the potential negative effects of high-salt diets on the kidneys have not been established.

The aim of the study was to trace the changes in relative expression of miRNA-21, 203 and 133 in urine of cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) fed high-salt diet with and without isolated soy proteins.

Material and methods. The object of the study was 18 male cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) aged 6-8 years with a body weight of 5.1-9.7 kg. The animals were divided in 3 groups (6 individuals each). The animals of the first (control) group received a standard diet (2 g NaCl/kg feed). The animals of the second group were fed high-salt diet (8 g NaCl/kg feed), of the third - high-salt diet combined with SUPRO 760 isolated soy protein (200 g/kg feed; instead of milk and egg proteins, corn gluten). Access to water was free. The follow-up period in this study was 4 months. In animals blood pressure (BP) and relative level of microRNA (miRNA) expression in urine were measured.

Results and discussion. Keeping monkeys on the studied diets for 4 months did not lead to significant changes in systolic or diastolic BP compared with the initial level. In the control group, there were no distinct changes in the expression of miRNA-21 in urine during observation. In the other two groups, there was a significant increase (approximately equally) of this parameter in comparison with the initial values. Both high-salt diets resulted in a significant increase in the relative level of expression of miRNA-133 and miRNA-203 in urine compared to basal values. However, the increase in these parameters in the group of animals fed a high-salt diet in combination with soy isolate was significantly less than in monkeys fed only a high-salt diet.

Conclusion. Possible, potentially negative effects of high-salt diets on kidney may be mediated by epigenomic mechanisms and partially modulated by the inclusion of isolated soy proteins in the diet.

Keywords:cynomolgus macaques, high-salt diet, isolated soy proteins, microRNA, urinary expression

Принято считать, что значительное потребление соли напрямую связано с повышением артериального давления (АД). Однако данный эффект наблюдается не у всех людей, причем как у нормотоников, так и у гипертоников (феномены соль-чувствительности/ соль-резистентности) и, по-видимому, животных, в частности у крыс [1-3]. Значительное поступление натрия с рационом ассоциируется с ростом сердечной массы, ремоделированием миокарда и индукцией гипертрофии левого желудочка [1, 4, 5]. При этом последние процессы в существенной мере не зависят от роста АД [1, 5, 6]. В последнее время определенное внимание уделяется возможному негативному влиянию высокого потребления поваренной соли на состояние почек [7, 8]. Однако механизмы ремоделирования почек изучены недостаточно. Одним из важных звеньев в данном процессе могут служить микроРНК (миРНК), представляющие собой небольшие некодирующие РНК, которые обладают способностью модулировать экспрессию генов. Имеющиеся данные по крайней мере не исключают того, что изменения экспрессии ряда миРНК могут ассоциироваться с развитием воспаления и фиброза в почечной ткани [9-12].

Существующие сведения указывают на то, что введение в рацион соевых продуктов способно оказывать определенное нефропротекторное действие [13-15], которое частично может быть обусловлено наличием фитоэстрогенов [16-18].

Значение различных миРНК в индукции и формировании ремоделирования/повреждения почек при высоком потреблении поваренной соли практически не изучено. Кроме того, неизвестно, могут ли протеины сои помочь противостоять ремоделированию почек, ассоциированному с повышенным потреблением хлористого натрия у приматов. В связи с этим цель работы - оценка изменения экспрессии миРНК-21, миРНК-133, миРНК-203 в моче яванских макак (Macaca fascicularis), находящихся на рационах с различным содержанием поваренной соли, включающих и не включающих соевые дериваты.

Материал и методы

Объектом исследования послужили 18 яванских макак-самцов в возрасте 6-8 лет с массой тела 5,1-9,7 кг. Животные были распределены на 3 группы (по 6 особей в каждой). Макаки 1-й группы (контроль) получали стандартный рацион (пищевая ценность - 340 ккал/100 г корма), содержащий 2 г NaCl/кг корма. Животные 2-й группы получали рацион с высоким содержанием поваренной соли (8 г NaCl/кг корма), 3-й - высокосолевую диету, в которой все белковые составляющие стандартного рациона заменены на изолированный соевый белок SUPRO 760 (Protein Technologys International, США) (200 г/кг корма) - соевый изолят, содержащий более 90% белка и все необходимые аминокислоты и 306 мг% изофлавонов.

Обезьян содержали в индивидуальных клетках. Температура окружающего воздуха составляла 23±3 °С, относительная влажность - 52,5±17,5%; в помещении поддерживали естественную продолжительность светового дня. Доступ к воде был свободным. Срок наблюдения составил 4 мес.

Ежедневно с утра кормушки очищали от остатков вечернего корма. При загрязнении клетки экскрементами макаку извлекали из стационарной клетки в переносную, основную клетку тщательно мыли, а затем обезьяну помещали обратно.

Условия содержания животных соответствовали стандартам, указанным в ГОСТ 33044-2014 "Принципы надлежащей лабораторной практики", ГОСТ 33218-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за нечеловекообразными приматами" и в "Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных" (Phoenix Control Vivarium Sourcebook). Все манипуляции с животными проводили в строгом соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей от 18 марта 1986 г. [текст изменен в соответствии с положениями Протокола (ETS № 170), дата его вступления в силу - 2 декабря 2005 г.] и Guide for the care and use of laboratory animals (Eighth Edition. Washington, DC: The National Academies Press, 2011. https://doi.org/10.17226/12910).

Отбор проб мочи осуществляли следующим образом: за 3 ч до забора мочи воду перекрывали во избежание ее попадания на поддон, поддоны тщательно мыли. Мочу отбирали шприцем в пробирки.

АД измеряли у наркотизированных животных. Использовали комбинацию тилетамин/золазепам (Золетил 100, серия 75 TD, Virbac, Франция) 0,05 мл/кг и ксилазин (Ксила, серия 358047, Interchemie, Голландия) 2%, 0,1 мл/кг. АД измеряли при помощи ветеринарного тонометра МЛ-410 VET ("Микролюкс", Россия) манжеточным методом на верхней левой конечности.

Определение относительного уровня экспрессии миРНК в моче заключалось в выделении тотальной РНК с помощью фенольного реактива (Tri Reagent LS) и ее последующей экстракцией хлороформом. Реакцию обратной транскрипции (РОТ) для приготовления "копийной" ДНК (кДНК) проводили по технологии "Stem Loop" раздельно для исследуемых миРНК с использованием следующих праймеров: миРНК-21 - 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACTCAAC-3', миРНК-133 - 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTTGGTT-3', миРНК-203 - 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG-3' и U6 - 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG-3', которую рассматривали как ген сравнения. Температурный профиль РОТ был следующий: 16 °С - 30 мин, 42 °С - 30 мин, 85 °С - 5 мин в 1 цикл. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в присутствии интеркалирующего красителя EvaGreen для реализации протокола учета результатов в режиме реального времени на амплификаторе DTLite-4 ("ДНК-Технология", РФ). В ПЦР использовали следующие праймеры: миРНК-21 - 5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3',миРНК-133 - 5'-GCCCGCAGCTGGTAAAATGGAAC-3', миРНК-203 - 5`-GCCGGTGAAATGTTTAGGACC-3', U6 -5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3' и общий обратный 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Реакционные смеси приготавливали раздельно для каждой кДНК, температурный профиль ПЦР был следующий: 95 °С - 10 мин (1 цикл), 95 °С - 15 с, 60 °С - 15 мин (45 циклов). Использовали наборы для проведения РОТ и ПЦР ("Синтол", Россия).

При расчетах применяли полуколичественную оценку уровня экспрессии миРНК (в относительных единицах - ОЕ) по протоколу 2^-ΔΔCt при лабораторном референте (0,09).

Анализ данных проводили в пакете статистических программ Statistica 8. Все результаты представлены как медиана (интерквартильный размах) (Me [IQR]). Для статистического анализа использовали непараметрические методы: парный тест Вилкоксона и тест Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты

Содержание макак на исследуемых рационах в течение 4 мес не привело к существенным изменениям систолического или диастолического АД по сравнению с исходным уровнем (см. таблицу). Тенденция к росту систолического АД у животных, получавших высокосолевую диету, не достигала уровня статистической значимости (см. таблицу).

Уровень систолического и диастолического артериального давления исходно и через 4 мес

Systolic and diastolic blood pressure at baseline and after 4 months

В контрольной группе не отмечено отчетливых изменений экспрессии миРНК-21 в моче в ходе наблюдения (рис. 1). В двух других выборках наблюдался значимый рост (примерно в равной степени) данного параметра по сравнению с начальными величинами.

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии микроРНК-21 в моче (Me [IQR])

Fig. 1. Relative level of expression of microRNA-21 in urine (Me [IQR])

Изменения экспрессии миРНК-133 (рис. 2) или миРНК-203 (рис. 3) в изучаемых группах обезьян были аналогичны. Оба высокосолевых рациона приводили к статистически значимому нарастанию относительного уровня экспрессии этих миРНК в моче по сравнению с базальными значениями. При этом медиана относительного уровня экспрессии миРНК-133 у обезьян, потреблявших большое количество хлорида натрия в течение 4 мес, была статистически значимо выше, чем у животных на высокосолевом рационе, дополненном соевым изолятом (р=0,008; тест Манна-Уитни, см. рис. 2). Аналогичная ситуация складывалась в отношении миРНК-203 (р=0,007; тест Манна-Уитни, см. рис. 3).

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии микроРНК-133 в моче (Me [IQR])

Fig. 2. Relative level of expression of microRNA-133 in urine (Me [IQR])

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии микроРНК-203 в моче (Me [IQR])

Fig. 3. Relative level of expression of microRNA-203 in urine (Me [IQR])

Обсуждение

Результаты выполненной работы свидетельствуют о том, что 4-месячное содержание макак на исследуемых рационах не привело к существенным изменениям систолического или диастолического АД по сравнению с исходным уровнем. В принципе, эти данные согласуются с результатами, полученными у млекопитающих других видов [1, 3, 6].

В нашей работе зарегистрирован значимый рост (примерно в равной степени) экспрессии миРНК-21 в моче по сравнению с начальными величинами в обеих группах животных с более высоким потреблением соли (см. рис. 1). Следует иметь в виду, что миРНК-21 представляет собой мультипотентную миРНК, которая часто рассматривается как способствующая пролиферации клеток, воспалению, ангиогенезу и повреждению иммунной системы. Последние исследования подтверждают, что миРНК-21 - одна из наиболее важных миРНК, участвующих в фиброзе почек, и ее уровень повышается в плазме крови [19] или в моче [9] при патологии органа. Повышение экспрессии миРНК-21 усиливает индуцированный TGF-P1 эпителиально-мезенхимальный переход (нарастание уровня α-гладкомышечного актина и снижение Е-кадгерина) за счет прямого угнетения smad7/p-smad7 (ингибирование мишени smad7) и непрямой стимуляции smad3/p-smad3, что в конечном итоге способствует развитию фиброза [20]. При этом нарастание экспрессии миРНК-21 ассоциируется c тяжестью повреждений и степенью снижения функционирования почек [9, 21, 22]. В свою очередь, ингибиция миРНК-21 приводит к заметному улучшению как структурной организации, так и функциональной способности почек. Полагают, что в будущем миРНК-21 может стать подходящей мишенью для антифибротической терапии, например, при лечении диабетической нефропатии [20, 22].

Как отмечалось выше, в ряде экспериментальных исследований на модели уменьшения массы функционирующих нефронов [13, 15] и на модели односторонней обструкции мочеточника [14] подтвержден ренопротекторный эффект различных соевых (как малобелковых, так и высокобелковых) рационов, тогда как диеты, включающие только белки животного происхождения, в определенных случаях могут способствовать развитию повреждений почек [23]. Механизмы позитивного воздействия содержащих сою рационов на почки в целом не установлены. Можно было предположить, что активация экспрессии миРНК-21 в почках под влиянием высокого поступления хлорида натрия с пищей будет содействовать развитию почечных повреждений, тогда как потребление высокосолевого рациона, содержащего белки сои, подавляет активность миРНК-21 и таким образом способствует нефропротекции в данной ситуации. Однако отчетливого снижения экспрессии миРНК-21 в моче у макак, получавших высокосолевой рацион на основе соевого изолята, мы не наблюдали (см. рис. 1). В связи с этим влияние соевого белка на состояние почек в условиях значительного поступления хлорида натрия с пищей, по-видимому, реализуется не через модуляцию экспрессии миРНК-21.

Экспрессия миРНК-133 или миРНК-203 в моче под влиянием изученных воздействий менялась существенно иначе, чем миРНК-21. Здесь, как и в предыдущем случае, высокосолевой рацион вызывал значимый рост активности обеих миРНК (см. рис. 2 и 3). Однако дополнение диеты со значительным содержанием поваренной соли соевым изолятом отчетливо ограничивало нарастание экспрессии как миРНК-133, так и миРНК-203 (см. рис. 2 и 3).

References

1. Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Ivanova G.T., et al. Changes in the cardiovascular system in rats associated with high consumption of sodium chloride. Arterial’naya gipertenziya [Arterial Hypertension]. 2014; 20 (5): 384–90. (in Russian)

2. Grigorova Y.N., Wei W., Petrashevskaya N., et al. Dietary sodium restriction reduces arterial stiffness, vascular TGF-β-dependent fibrosis and marinobufagenin in young normotensive rats. Int J Mol Sci. 2018; 19 (10): 232–41.

3. Grigorova Y.N., Juhasz O., Zernetkina V., et al. Aortic fibrosis, induced by high salt intake in the absence of hypertensive response, is reduced by a monoclonal antibody to marinobufagenin. Am J Hypertens. 2016; 29 (5): 641–6.

4. Yang G.H, Zhou X., Ji W.J., et al. VEGF-C-mediated cardiac lymphangiogenesis in high salt intake accelerated progression of left ventricular remodeling in spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Hypertens. 2017; 39 (8): 740–7.

5. Kayukov I.G., Beresneva O.N., Parastaeva M.M., et al. Soy proteins anti-heart removal in Wistar rats receiving a diet with a high sodium chloride. Nefrologiya [Nephrology]. 2019; 23 (6): 92–9. (in Russian)

6. Parastaeva M.M., Beresneva O.N., Ivanova G.T., et al. Arterial hypertension and salt consumption: contribution to heart removal. Nefrologiya [Nephrology]. 2016; 20 (5): 97–105. (in Russian)

7. Oppelaar J.J., Vogt L. Body fluid-independent effects of dietary salt consumption in chronic kidney disease. Nutrients. 2019; 11: 2779.

8. Hosohata K. Biomarkers for chronic kidney disease associated with high salt intake. Int J Mol Sci. 2017; 18: 2080.

9. Smirnov A.V., Karunnaja A.V., Zarajskij M.I., et al. Expression of microRNA-21 in the urinbe in patients with nephropathies. Nefrologiya [Nephrology]. 2014; 18 (6): 59–63. (in Russian)

10. Kayukov I.G., Ivanova G.T., Zaraysky M.I., et al. Expression of microRNA-21 in the renal tissue and urine in rats with unilateral ureter obstruction. Nefrologiya [Nephrology]. 2016. 20 (5): 84–9. (in Russian)

11. Wang G. Kwan B.C., Lai F.M., Chow K.M., Li P.K., Szeto C.C. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Dis Markers. 2011; 30: 171–9.

12. Yanai K., Kaneko S., Ishii H. et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. J Vis Exp. 2020; 27 (162): 185–2.

13. Beresneva O.N., Parastaeva M.M., Kucher A.G., et al. Effect of protein content in diet on progression of experimental chronic renal failure. Nefrologiya [Nephrology]. 2003; 7 (4): 66–70. (in Russian)

14. Smirnov A.V., Kucher A.G., Dobronravov V.A., et al. Dietary soy protein inhibits the development of interstitial renal fibrosis in rats with unilateral uretal obstruction: introduction to nutritive epigenomics. Nefrologiya [Nephrology]. 2012; 16 (4): 75–83. (in Russian)

15. Smirnov A.V., Beresneva O.N., Parastaeva M.M., et al. Effectiveness of the influence of low protein diets with the application of ketosteril and soy isolate on experimental renal failure. Nefrologiya i dializ [ Nephrology and Dialysis]. 2006; 8 (4): 344–50. (in Russian)

16. Ogborn M.R., Nitschmann E., Bankovic-Calic N., et al. Dietary soy protein benefit in experimental kidney disease is preserved after isoflavone depletion of diet. Exp Biol Med (Maywood). 2010; 235: 1315–20.

17. Liu Z.M., Ho S.C., Chen Y.M., et al. Effect of whole soy and purified isoflavone daidzein on renal function – a 6-month randomized controlled trial in equol-producing postmenopausal women with prehypertension. Clin Biochem. 2014; 47: 1250–6.

18. Ahmed M.S., Calabria A.C., Kirsztajn G.M. Short-term effects of soy protein diet in patients with proteinuric glomerulopathies. J Bras Nefrol. 2011; 33: 150–9.

19. Fouad M., Salem I., Elhefnawy K. et al. MicroRNA-21 as an early marker of nephropathy in patients with type 1 diabetes. Indian J Nephrol. 2020; 30 (1): 21–2.

20. Wang J.Y., Gao Y.B., Zhang N., et al. MicroRNA-21 overexpression enhances TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition by target smad7 and aggravates renal damage in diabetic nephropathy. Mol Cell Endocrinol. 2014; 392 (1–2): 163–72.

21. Abdelghaffar S., Shora H., Abdelatty S., et al. MicroRNAs and risk factors for diabetic nephropathy in egyptian children and adolescents with type 1 diabetes. Diabetes Metab Syndr Obes. 2020; 13: 2485–4.

22. Kölling M., Kaucsar T., Schauerteetal C., et al. Therapeutic miR21 silencing ameliorates diabetic kidney disease in mice. Mol Ther. 2017; 25 (1): 165–80.

23. Parker E., McElroy P., Picut C., et al. Soy-deficient diet induces renal lesions in juvenile rats. Food Chem Toxicol. 2018; 121: 467–71.

24. Zhang H., Li W., Gu W., et al. MALAT1 accelerates the development and progression of renal cell carcinoma by decreasing the expression of miR-203 and promoting the expression of BIRC5. Cell Prolif. 2019; 52 (5): e12640.

25. Deng B., Wang B., Fang J., et al. MiRNA-203 suppresses cell proliferation, migration and invasion in colorectal cancer via targeting of EIF5A2. Sci Rep. 2016; 6: 28301.

26. Ge X.J., Zheng L.M., Feng Z.X., et al. H19 contributes to poor clinical features in NSCLC patients and leads to enhanced invasion in A549 cells through regulating miRNA-203-mediated epithelial-mesenchymal transition. Oncol Lett. 2018; 16 (4): 4480–8.

27. Kim J.S., Choi D.W., Kim C.S., et al. MicroRNA-203 induces apoptosis by targeting Bmi-1 in YD-38 oral cancer cells. Anticancer Res. 2018; 38 (6): 3477–85.

28. Wang J.-X., Zhang X.-J., Li Q., et al. MicroRNA-103/107 regulate programmed necrosis and myocardial ischemia/reperfusion injury through targeting FADD. Circ Res. 2015; 117 (4): 352–3.

29. Xu C., Lu Y., Pan Z., et al. The muscle-specific microRNAs miR-1 and miR-133 produce opposing effects on apoptosis by targeting HSP60, HSP70 and caspase-9 in cardiomyocytes. J Cell Sci. 2007; 120 (17): 3045–52.

30. Zong L., Wang W. CircANXA2 promotes myocardial apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury via inhibiting miRNA-133 expression. Biomed Res Int. 2020; 2020: 8590861.

31. Sun B., Liu S., Hao R. et al. RGD-PEG-PLA delivers MiR-133 to infarct lesions of acute myocardial infarction model rats for cardiac protection. Pharmaceutics. 2020; 12 (6): 575.

32. Zhang X.G., Wang L.Q., Guan H.L. Investigating the expression of miRNA-133 in animal models of myocardial infarction and its effect on cardiac function. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019; 23 (13): 5934–40.

33. Hirata H., Ueno K., Nakajima K., et al. Genistein downregulates onco-miR-1260b and inhibits Wnt-signaling in renal cancer cells. Br J Cancer. 2013; 108: 2070–8.

34. Ma J., Cheng L., Liu H., et al. Genistein down-regulates miR-223 expression in pancreatic cancer cells. Curr Drug Targets. 2013; 14 (10): 1150–6.

35. Biersack B. Current state of terpenoidal dietary factors and natural products as non-coding RNA/microRNA modularors for improved cancer therapy and prevention. Noncoding RNA Res. 2016; 1 (1): 12–34.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.