Методы анализа синефрина в сырье, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции
Для определения синефрина и других адренергических аминов в сырье, экстрактах, БАД к пище и СПП используют обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ ВЭЖХ) с диодно-матричным (ДМД) спектрофотометрическим [9, 10, 13, 26-35], флуориметрическим [27, 28, 31, 36, 37], электрохимическим [38] или масс-спектрометрическим (МС) детектированием [24, 31, 39-42], высокоэффективную тонкослойную хроматографию с денситометрией [43] и капиллярный электрофорез (КЭФ) со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием [44].
Наиболее распространенным методом количественного анализа синефрина и других биогенных аминов горького апельсина является ОФ ВЭЖХ. Разделение биогенных аминов проводится на колонках С18, С8 или колонках с сильным катионообменным сорбентом [13, 26, 45-47] в изократическом или градиентном режиме. Водный компонент подвижной фазы имеет сильнокислую (рН 2-3), нейтральную или слабощелочную реакцию среды (рН 7-8). Органические компоненты подвижной фазы включают ацетонитрил, метанол или их смеси. Проблемы, возникающие при анализе биогенных аминов, связаны с их относительно низким содержанием в сырье, выраженными основными свойствами, высокой полярностью и низким коэффициентом удерживания на колонках С18, малой интенсивностью и неселективностью поглощения в области ультрафиолетового (УФ)-спектра, характерной для многих ароматических соединений (220-230 и 270-280 нм). С целью оптимизации времени удерживания и улучшения формы пиков для анализа биогенных аминов часто применяется ионпарная ВЭЖХ. В качестве ион-парных реагентов используют додецилсульфат натрия [27-30, 32, 33], лаурилсульфат натрия [34] и гексансульфоновую кислоту [26, 35]. Проблемы недостаточного удерживания
и слабого сигнала синефрина в УФ-спектре, связанные с недостатком хромофорных групп, иногда решали с помощью пред- и постколоночной дериватизации [39, 40, 48]. В качестве дериватизующих агентов для синефрина и других аминов используют дансил хлорид, 9-флуо-ренилметилхлорформиат и о-фталевый альдегид. Описано также использование флуориметрического детектора, поскольку синефрин и другие биогенные амины цитрусовых обладают естественной флуоресценцией в УФ-области спектра с длинами волн возбуждения 270-280 нм и длинами волн эмиссии 300-320 нм [27, 28, 31, 36, 37].
В последнее десятилетие для анализа биогенных аминов цитрусовых широкое применение получила ВЭЖХ-МС с ионизацией электрораспылением и различными типами масс-анализаторов, среди которых времяпролетный, квадрупольный, тройной квадрупольный, квадрупольно-времяпролетный, ионная ловушка [24, 39-42]. Такой подход позволяет с высокой селективностью и чувствительностью идентифицировать и определять следовые количества биогенных аминов в сложных матриксах БАД к пище и СПП. Молекулярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль. Детектирование синефрина в режиме полного сканирования положительных ионов проводится по протонированному псевдомолекулярному иону [M + H]+ с m/z 168 Да и дегидратированному протонированному псевдомолекулярному иону [M - H2O + H]+ с m/z 150 Да.
Определение энантиомеров синефрина проводят с помощью хиральных ВЭЖХ и КЭФ [40, 44, 48]. В первом случае разделение проводится с использованием хиральных колонок, во втором - циклодекстринов в буферном растворе.
Результаты определения синефрина в растительном сырье, экстрактах, биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции
В научных целях, а также для проведения исследования содержания синефрина в БАД к пище и СПП в рамках санитарно-эпидемиологической экспертизы была разработана оригинальная ион-парная ОФ ВЭЖХ-ДМД-методика. Извлечение синефрина из матриксов растительных экстрактов, БАД к пище и СПП проводили 50% водным метанолом на ультразвуковой бане при комнатной температуре. Субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида растворяли в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку Phenomenex Luna C18(2) 250x4,6 мм с размером частиц 5 мкм. Экспериментально подобранные условия оптимального хроматографического разделения синефрина и октопамина приведены в табл. 4.
Таблица 4. Условия определения синефрина и октопамина методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием (ДМД)
Table 4. Conditions for the determination of synephrine and octopamine by ion-pair reversed-phase HPLC (high-performance liquid chromatography) with diode-array detection
)
Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина изображена на рис. 3А, извлечения из БАД к пище с экстрактом горького апельсина - на рис. 3Б.
)
Рис. 3. Хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина (А) и метанольного экстракта биологически активной добавки к пище с экстрактом горького апельсина (Б) при λ=224 нм
Fig. 3. Chromatogram of a mixture of standards of synephrine and octopamine (A) and methanol extract of dietary supplement containing bitter orange extract (B) at λ=224 nm
Разработанная методика прошла метрологическую аттестацию, получила статус методики измерений МИ (регистрационный № 21-12ФЦ/89-м от 07.09.2021) и была включена в соответствующий проект методических указаний МУК "Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции".
Для подтверждения присутствия синефрина в ряде образцов дополнительно проводили ВЭЖХ-МС. Исследовано более 80 образцов, среди которых субстанции синефрина и октопамина гидрохлорида, экстракты горького апельсина, БАД к пище и СПП. Стандартизованные по содержанию синефрина экстракты горького апельсина соответствовали спецификации производителя (6, 8 или 10%, а в 4 образцах - 30%). Количество синефрина в БАД к пище и СПП варьировало от следовых количеств до 32 мг/капс, что превышает верхний допустимый уровень потребления 30 мг. В большинстве исследованных БАД к пище и СПП количество синефрина составляло 5-6 мг в 1 капсуле или таблетке и соответствовало адекватному суточному потреблению синефрина (5 мг). В 9 образцах БАД к пище и СПП синефрин не был обнаружен.
В одном образце экстракта горького апельсина были обнаружены октопамин и синефрин (6 и 10% соответственно). Другие минорные протоалкалоиды (тирамин, N-метилтирамин и горденин) присутствовали в ряде образцов в количествах на порядок и более меньших, чем синефрин.
Заключение
Приведенные данные подтверждают целесообразность разработки официальной методики анализа протоалкалоидов и проведения на ее основе мониторинга БАД к пище и СПП, предназначенных для контроля массы тела и спортивного питания, на содержание синефрина и других цитрусовых протоалкалоидов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Stohs S.J. Safety, efficacy, and mechanistic studies regarding Citrus aurantium (bitter orange) extract and p-synephrine. Phytother Res. 2017; 31 (10): 1463-74. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.5879
2. Ruiz-Moreno C., Del Coso J., Giráldez-Costas V., González-García J., Gutiérrez-Hellín J. Effects of p-synephrine during exercise: a brief narrative review. Nutrients. 2021; 13 (1): 233. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13010233
3. Kaats G.R., Leckie R.B., Mrvichin N., Stohs S.J. Increased eating control and energy levels associated with consumption of bitter orange (p-synephrine) extract: a randomized placebo-controlled study. Nutr Diet Suppl. 2017; 9: 29-35. DOI: https://doi.org/10.2147/NDS.S136756
4. Di Lorenzo C., Ceschi A., Kupferschmidt H., Lüde S., De Souza Nascimento E., Dos Santos A., et al. Adverse effects of plant food supplements and botanical preparations: a systematic review with critical evaluation of causality. Br J Clin Pharmacol. 2015; 79( 4): 578-92. DOI: https://doi.org/10.1111/bcp.12519
5. EFSA Scientific Cooperation (ESCO) Working Group on Botanicals and Botanical Preparations. Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2009.280
6. EFSA SC (EFSA Scientific Committee), 2014. Scientific Opinion on a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for the safety assessment of botanicals and botanical preparations. EFSA J. 2014; 12 (3): 3593. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2014.3593
7. Maisons-Alfort ANSES Opinion, Request No. 2012-SA-0200. OPINION of the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safetyon the risks associated with the presence in food supplements of p-synephrine or ingredients obtained from Citrus spp. fruits containing this substance. 2014: 46 p. URL: https://www.anses.fr/en/system/files/NUT2012sa0200EN.pdf
8. Stewart I., Newhall W.F., Edwads G.L. The isolation and identification of l-synephrine in leaves and fruit of Citrus. J Biol Chem. 1964; 239 (3): 930-2. DOI: https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51679-3
9. Pellati F., Cannazza G., Benvenuti S. Study on the racemization of synephrine by off-column chiral high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 2010; 1217 (21): 3503-10. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2010.03.026.
10. Avula B., Upparapalli S.K., Navarrete A., Khan I.A. Simultaneous quantification of adrenergic amines and flavonoids in C. aurantium, various Citrus species, and dietary supplements by liquid chromatography. J AOAC Int. 2005; 88 (6): 1593-606.
11. BfR Opinion No. 004/2013. Health assessment of sports and weight loss products containing synephrine and caffeine. 2012: 29 p.
12. Food Standards Australia New Zealand (FSANZ). Risk assessment of oxedrine in foods intended to promote weight loss. 2015: 18 p.
13. Arbo M.D., Larentis E.R., Linck V.M., Aboy A.L., Pimentel A.L., Henriques A.T., et al. Concentrations of p-synephrine in fruits and leaves of Citrus species (Rutaceae) and the acute toxicity testing of Citrus aurantium extract and p-synephrine. Food Chem Toxicol. 2008; 46 (8): 2770-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.04.037
14. Stohs S.J., Preuss H.J. Stereochemical and pharmacological differences between naturally occuring p-synephrine and synthetic p-synephrine. J Funct Foods. 2012; 4 (1): 2-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2011.09.004
15. Sawler S. Health Canada Synephrine, Octopamine Caffeine Health Risk Assessment (HRA) Report. 2013: 49 p.
16. Tiesjema B., Jeurissen S.M.F., de Wit L., Mol H., Fragki S., Razenberg L. Risk assessment of synephrine. RIVM Report 2017-0069. 2017: 54 р. DOI: https://doi.org/10.21945/RIVM-2017-0069
17. Blumenthal M. Bitter orange peel and synephrine: Part 1 & Part 2. 2005: 28 p. URL: http://abc.herbalgram.org/site/DocServer/Bitter_Orange_Peel_and_Synephrine.pdf?docID=221
18. URL: https://rusada.ru/substances/prohibited-list/
19. ESCO report: Advice on the EFSA guidance document for the safety assessment of botanicals and botanical preparations intended for use as food supplements, based on real case studies. EFSA J. 2009; 7 (9): 280. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2009.280; URL: https://www.ncaa.org/sport-science-institute/topics/2020-21-ncaa-banned-substances
20. URL: https://www.nutraingredients.com/Article/2018/03/22/Dutch-authorities-call-for-legal-limits-on-synephrine-in-food-supplements
21. URL: https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/compliance-actions-and-activities/warning-letters
22. Costa J.G., Vidovic B., Saraiva N., do Céu Costa M., Del Favero G., Marko D., et al. Contaminants: a dark side of food supplements? Free Radic Res. 2019; 53 (Suppl 1): 1113-35. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2019.1636045
23. EU-28: Exporting Food Supplements to the European Union. 2017. GAIN Report No. E17004.
24. Pawar R.S., Sagi S., Leontyev D. Analysis of bitter orange dietary supplements for natural or synthetic phenethylamines by LC-MS/MS. Drug Test Anal. 2020; 12: 1241-51. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.2871
25. Cohen P.A., Avula B., Venhuis B., Travis J.C., Wang Y.H., Khan I.A. Pharmaceutical doses of the banned stimulant oxilofrine found in dietary supplements sold in the USA. Drug Test Anal. 2017; 9 (1): 135-42. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1976
26. Roman M.C., Betz J.M., Hildreth J. Determination of synephrine in bitter orange raw materials, extracts, and dietary supplements by liquid chromatography with ultraviolet detection: single-laboratory validation. J AOAC Int. 2007; 90 (1): 68-81.
27. Lorenzo C.D., Santos A.D., Colombo F., Moro E., Dell’Agli M., Restani P. Development and validation of HPLC method to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantium L. Food Control. 2014; 46: 136-42. DOI: https://doi.org/10.1016/J.FOODCONT.2014.05.017
28. Putzbach K., Rimmer C.A., Sharpless K.E., Sander L.C. Determination of Bitter Orange alkaloids in dietary supplements standard reference materials by liquid chromatography with ultraviolet absorbance and fluorescence detection. J Chromatogr A. 2007; 1156 (1-2): 304-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.12.027.
29. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China 2010 (English edition). 2010.
30. Taiwan Herbal Pharmacopoeia. 2th edition (English version). 2016: 44-5.
31. Sander L.C., Putzbach K., Nelson B.C., Rimmer C.A., Bedner M., Thomas J.B., et al. Certification of standard reference materials containing bitter orange. Anal Bioanal Chem. 2008; 391 (6): 2023-34. DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-008-2074-0
32. Schaneberg B.T., Khan I.A. Quantitative and qualitative HPLC analysis of thermogenic weight loss products. Pharmazie. 2004; 59 (11): 819-23.
33. Ohta I., Mizunuma S., Yasuda T., Ohsawa K. Determination of synephrine in oriental pharmaceutical decoctions containing Evodiae fructus by ion-pair high-performance liquid chromatography. Yakugaku Zasshi. 1994; 114 (1): 33-8 (in Japanese). DOI: https://doi.org/10.1248/yakushi1947.114.1_33
34. Evans R.L., Siitonen P.H. Determination of caffeine and symphatomimetic alkaloids in weight loss supplements by high performance liquid chromatography. J Chromatogr Sci. 2008; 46 (1): 61-7. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/46.1.61
35. Wagner H., Püls S., Barghouti T., Staudinger A., Melchart D. Chromatographic fingerprint analysis of herbal medicines. Volume 5. Thin-Layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs. Springer, 2018: 43-4. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-319-67062-1
36. Kim J.H., Kwak B.M., Ahn J.H., Park J.-S. Simultaneous determination of synephrine and N-methyltyramine in orange fruit and juice from Korean market by UPLC-FLD. Korean J Food Sci Technol. 2014; 46 (3): 276-82. DOI: http://dx.doi.org/10.9721/KJFST.2014.46.3.276
37. Pryce K., Samuel D., Lagares E., Myrthil M., Bess F., Harris A., et al. Presence of octopamine and an octopamine receptor in Crassostrea virginica. In vivo (Brooklyn). 2015; 37 (1): 16-24.
38. Li Q., Huang C., Huang Y. Sensitive determination of synephrine by flow-injection chemiluminescence. Luminescence. 2006; 21 (1): 43-8. DOI: https://doi.org/10.1002/bio.881
39. Liu Y., Xu F., Zhang Z., Yang C., Song R., Tian Y. Analysis of synephrine in da-cheng-qi decoction by HPLC employing precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate. J Chromatogr Sci. 2009; 47 (10): 925-30. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/47.10.925
40. Kobayashi Y., Yato M., Ito R., Saito K. Enantioselective determination of synephrine in health food products by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Chromatography. 2020; 41: 39-44. DOI: https://doi.org/10.15583/jpchrom.2019.024
41. Tang Q., Zhang R., Zhou J., Zhao K., Lu Y., Zheng Y., et al. The levels of bioactive ingredients in Citrus aurantium L. at different harvest periods and antioxidant effects on H2O2-induced RIN-m5F cells. J Sci Food Agric. 2021; 101 (4): 1479-90. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.10761
42. Bai Y., Zheng Y., Pang W., Peng W., Wu H., Yao H., et al. Identification and comparison of constituents of Aurantii fructus and Aurantii fructus immaturus by UFLC-DAD-triple TOF-MS/MS. Molecules. 2018; 23 (4): 803. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23040803
43. Shawky E. Determination of synephrine and octopamine in bitter orange peel by HPTLC with densitometry. J Chromatogr Sci. 2014; 52 (8): 899-904. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/bmt113
44. Avula B., Upparapalli S.K., Khan I.A. Enantiomeric separation of adrenergic amines in Citrus species, related genera and dietary supplements by capillary electrophoresis. Chromatographia. 2005; 62 (3): 151-7. DOI: https://doi.org/10.1365/s10337-005-0598-4
45. Yi Y.N., Cheng X.M., Liu L.A., Hu G.Y., Wang Z.T., Deng Y.D., et al. Simultaneous determination of synephrine, arecoline, and norisoboldine in Chinese patent medicine Si-Mo-Tang oral liquid preparation by strong cation exchange high performance liquid chromatography. Pharm Biol. 2012; 50 (7): 832-8 DOI: https://doi.org/10.3109/13880209.2011.637505
46. Zhang Y., Jiao B. Simultaneous determination of six protoalkaloids in Chinese local varieties of loose-skin mandarins and sweet oranges by strong cation exchange-high performance liquid chromatography. Food Anal Methods. 2019; 12: 677-86. DOI: https://doi.org/10.1007/s12161-018-1401-0
47. URL: https://www.sielc.com/Application-HPLC-Separation-of-Octopamine-and-Synephrine-on-Primesep-200-column.html
48. Tanaka S., Sekiguchi M., Yamamoto A., Aizawa S.I., Sato K., Taga A., et al. Separation of synephrine enantiomers in citrus fruits by a reversed phase HPLC after chiral precolumn derivatization. Anal Sci. 2019; 35 (4): 407-12. DOI: https://doi.org/10.2116/analsci.18P441