Стремительный рост объемов производства пищевой продукции, изготавливаемой с использованием высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, которые создаются методами направленного мутагенеза и/или трансгенеза, делает необходимым совершенствование регламентов их безопасности для здоровья потребителей. Такие требования на сегодняшний день включают обязательность проведения токсикологических исследований, включая изучение различных биохимических и иммунологических показателей в условиях in vivo и in vitro [1-4].
Вместе с тем организм человека - это экологическая ниша для множества разнообразных микроорганизмов. Живые клетки этих микроорганизмов, их геном и продуцируемые ими метаболиты составляют кишечный микробиом. Важное влияние на организм хозяина оказывает состояние его кишечного микробиома, что связано с выраженным влиянием последнего на иммунный статус. Это обусловлено действием эндо- и энтеротоксинов, продуцируемых кишечной микрофлорой, на ассоциированные с кишечником лимфоидные ткани (gut-associated lymphoid tissues - GALT). Поверхность тонкой и толстой кишки взрослого человека, контролируемая GALT, представляет собой структуру площадью 32 м2, которая включает ~1014 колониеобразующих единиц (КОЕ) комменсальных микроорганизмов [5-7].
В состав GALT входит целых ряд иммунных клеток, включая T- и B-лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги. В эпителии кишечника находятся интра- эпителиальные лимфоциты, которые взаимодействуют с различными микроорганизмами и клетками кишечника. В микроскладках фолликул-ассоциированного эпителия, покрывающего поверхности лимфоидных тканей кишечника, находятся M-клетки, играющие ключевую роль в захвате микробных клеток и антигенов из просвета кишечника, впоследствии распознаваемых дендритными клетками и далее взаимодействующих с Т- и В-лимфоцитами, что приводит к развитию воспалительной реакции и секреции иммуноглобулина A (IgA). Состояние микробиома кишечника во многом определяется свойствами поступающих в составе рациона пищевых ингредиентов [5-7].
Показано, что грамнегативные микроорганизмы (например, представители семейства Enterobacteriaceae spp.) являются активаторами врожденного (гуморального) иммунного ответа и вызывают развитие провоспалительной реакции. Некоторые грампозитивные бактерии (например, принадлежащие к родам Bacteroides spp., Clostridium spp. и Bacillus spp.), в состав капсулы которых входят полисахариды, распознаются дендритными клетками и способствуют развитию противовоспалительного ответа и высвобождению интерлейкина-10 (ИЛ-10), который в основном продуцируется в кишечнике Т-регуляторными лимфоцитами (Treg). Плесневые грибы вызывают синтез IgA B-клетками. В случае нарушения баланса в составе микрофлоры кишечника развивается Th2-иммунный ответ на аллергены. Основными "инструментами", определяющими специфичность различных механизмов защиты в данном случае, становятся факторы гуморального иммунитета (IgA и IgE), а основными регуляторными факторами при этом типе иммунного ответа признаны ИЛ-4 и ИЛ-5 [5, 7, 8].
Наличие в составе пищевой продукции живых форм штаммов-продуцентов и/или их ДНК, пищевых ингредиентов с измененной биохимической структурой молекул и, следовательно, с измененной биологической активностью может негативным образом повлиять на состояние кишечного микробиома, иммунный статус и метаболизм организма. Кроме того, используемые в пищевой промышленности ферментные препараты в большинстве являются пищеварительными ферментами. Их концентрация и активность играют важнейшую роль в метаболизме организма. Избыточное поступление в организм ферментных препаратов в составе пищевой продукции может вызвать такие негативные эффекты, как снижение продукции эндогенных пищеварительных ферментов; изменение константы Михаэлиса, определяющей сродство фермента к субстрату в процессе переваривания пищи; нарушение аллостерического контроля активности фермента; нарушение функций гормонов, регулирующих продукцию эндогенных ферментов [9, 10]. Например, при нарушении экзокринной функции поджелудочной железы (повышении или снижении концентрации протеолитических ферментов, липазы и амилазы) снижается толерантность организма к глюкозе. Избыточное поступление ферментов в желудочно-кишечный тракт в составе пищевой продукции может привести к раздражению слизистой оболочки кишки, дисбалансу кишечного микробиома, изменению метаболического и иммунного статуса организма [11, 12].
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что качественный и количественный состав кишечного микробиома может являться одним из важнейших биомаркеров токсического действия пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза.
Цель работы - обоснование включения в комплекс исследований безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза, изучения состава кишечного микробиома (на примере ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы из генно-инженерно-модифицированного штамма Aspergillus awamori Xyl T-15).
Материал и методы
В соответствии с паспортом, генетически модифицированный (ГМ) штамм A. awamori Xyl Т-15 получен на основе мутантного штамма-реципиента A. awamori ВУДТ-2 1000У (ВКМ F 3765), являющегося продуцентом глюко-амилазы, путем встраивания гена ксиланазы из штамма-донора Penicillium canescens (XylA). Штамм Aspergillus awamori Xyl T-15 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН за № 4278D [13, 14].
В исследованиях использовали самцов крыс аутбредной линии Wistar, полученных из питомника "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Работу выполняли в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и международными рекомендациями по гуманному обращению с животными [15].
В эксперименте по изучению влияния ферментного препарата - комплекса глюкоамилазы и ксиланазы (далее - ФП), полученного с использованием ГМ-штамма Aspergillus awamori Xyl T-15, на микробиологические показатели и продукцию цитокинов использовали 4 группы по 10 самцов крыс исходной массой тела 80±10 г. После недельной адаптации все крысы получали в течение последующих 80 сут полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93М и воду в условиях неограниченного доступа и внутрижелудочно ежесуточно ФП в расчетных дозах 0 (контроль); 10, 100 и 1000 мг на 1 кг массы тела в 0,15 М растворе NaCl. Воду для питья крыс получали в установке обратного осмоса "Milli-RO" (Waters, США).
Животных выводили из эксперимента на 80-е сутки после 16-часового голодания путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. Кровь, селезенку и слепую кишку отбирали у животных в асептических условиях. Лизаты клеток селезенки готовили в 0,1 М трис-HCl-буфере, охлажденном до 0-2 °C, в соотношении 1 : 4 по массе непосредственно перед проведением анализа. Сыворотку крови отделяли и хранили ее до исследования при -20 оС.
Состав кишечного микробиоценоза изучали путем посева (10-кратных разведений) содержимого слепой кишки, выделенного в стерильных условиях во время выведения животных из эксперимента, на специфические питательные среды. Исследование микробного пейзажа содержимого слепой кишки включало выявление клостридий, бактероидов, бифидобактерий, лактобацилл, энтерококков, энтеробактерий, дрожжеподобных и плесневых грибов (табл. 1).
Таблица 1. Схема посева содержимого слепой кишки
Table 1. Scheme of inoculation of the contents of the cecum
)
Примечание. Инкубирование анаэробных микроорганизмов осуществляли с использованием пакетов для химического связывания кислорода "Oxoid™ AnaeroGen™" (Thermo Scientific, США).
N o t e. Incubation of anaerobic microorganisms was carried out using bags for chemical oxygen binding "Oxoid™ AnaeroGen™" (Thermo Scientific, USA).
Анаэробы и мезофильно-факультативные анаэробы были идентифицированы до рода по морфологии колоний клеток, аэротолерантности и каталазной активности. Факультативные анаэробы идентифицировали общепринятыми методами согласно [16].
Количество колониеобразующих единиц микроорганизмов, выросших на питательных средах, выражали в lg КОЕ/г в массе содержимого слепой кишки. Идентификацию микроорганизмов проводили путем изучения морфологии колоний, микроскопии мазков и определения дифференциально-диагностических биохимических свойств в соответствии с [17, 18].
Для определения уровня цитокинов и хемокинов [ИЛ-1α, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17A, интерферона-γ, фактора некроза опухоли α (ФНОα), цитокинов MCP-1, MIP-1a, регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток RANTES] в сыворотке крови и лизатах селезенки использовали базовый коммерческий набор Bio-Plex Pro™ Reagent Kit V, дополненный реагентами Bio-Plex Pro™ (Pro-Rat 33-Plex Standarts, Rat Cytokine IL-1a Set, Rat Cytokine IL-4 Set, Rat Cytokine IL-6 Set, Rat Cytokine IL-10 Set, Rat Cytokine IL-17A Set, Rat Cytokine IFN-g Set, Rat Cytokine TNF-a Set, Rat Cytokine MCP-1 Set, Rat Cytokine MIP-1a Set, Rat Cytokine RANTES Set) ("Bio-Rad Laboratories, Inc.", США). Измерения проводили на мультиплексном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Изучение влияния ФП на аллергическую чувствительность и ответ специфических антител IgG проводили на модели системной анафилаксии. В работе использовали самцов крыс Wistar с исходной массой тела 180 г, которых сенсибилизировали овальбумином (ОВА) куриного яйца (Sigma-Aldrich, Германия). Сенсибилизацию проводили путем внутрибрюшинного введения на 1-е, 3-и и 5-е сутки эксперимента по 100 мкг ОВА, адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия в стерильном апирогенном 0,15 М NaCl. На 21-е сутки крысам вводили дополнительно 10 мкг ОВА в тех же условиях. На протяжении всего периода сенсибилизации в течение 28 сут крысы опытной и контрольной групп получали общевиварный рацион и воду в режиме неограниченного доступа. ФП вводили крысам опытной группы ежедневно внутрижелудочно в дозе 100 мг на 1 кг массы тела (по белку). Крысам контрольной группы вводили 0,15 M раствор NaCl. Реакцию анафилаксии воспроизводили на 29-е сутки путем внутривенного введения ОВА в дозе 6 мг на 1 кг массы тела (по белку) в 0,15 М растворе NaCl. Раствор антигена для внутривенного введения стерилизовали пропусканием через фильтр "Millipore" с диаметром пор 0,22 мкм. Непосредственно перед введением разрешающей дозы отбирали кровь из вены для определения антител IgG. Тяжесть реакции системной анафилаксии в течение 24 ч после введения разрешающей дозы антигена оценивали в баллах согласно МУ 2.3.2.2306-07 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения". Концентрацию IgG антител в сыворотке крови сенсибилизированных ОВА крыс определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа на полистироле с использованием в качестве вторичных антител меченных пероксидазой кроличьих антител против IgG (1+4) крысы (Sigma-Aldrich, Израиль) в соответствии с МУ 2.3.2.2306-07.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета SPSS 20.0 (IBM, США). Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки. Вероятность принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок устанавливали согласно критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и ANOVA. Достоверность различия долевых показателей оценивали с использованием точного U-критерия Фишера и многомерного критерия χ2 Пирсона. Различия признавали значимыми при р<0,05.
Результаты
Влияние ферментного препарата на кишечный микробиом
Как показали результаты исследований, в содержимом слепой кишки (табл. 2) при внутрижелудочном введении крысам ФП в дозе 10 мг на 1 кг массы тела наблюдалась тенденция к росту содержания бактероидов, а в дозе 100 мг/кг - статистически значимый рост содержания бактероидов с 3,5 КОЕ/г (контрольная группа) до lg 6,7 КОЕ/г по нижней границе интервала измерений. По верхней границе интервала полученных значений никаких изменений в анализируемом количестве бактероидов во всех опытных группах отмечено не было. Отмечена тенденция к увеличению содержания энтерококков в содержимом слепой кишки по нижней границе интервала измерений с lg 2,3 до lg 5,3 КОЕ/г. При дозе 1000 мг/кг отмечался статистически значимый рост содержания плесневых грибов (рис. 1) и тенденция снижения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 2. Содержание представителей микробиоты в слепой кишке крыс 1-4-й групп на 92-е сутки эксперимента (Ме, lg КОЕ/г содержимого, n=9)
Table 2. Levels of microbiota representatives in the cecum of rats of groups 1-4 on day 92 of the experiment (Me, lg CFU/g of content, n=9)
)
Примечание. Надстрочные индексы - номера групп, различие с которыми статистически значимо (p<0,05) согласно U-критерию Манна-Уитни; * - cтатистическая значимость различий для групп 1-4 согласно критерию Краскела-Уоллиса.
N o t e. The superscripts - nos of groups differing significantly, Mann-Whitney U-test p<0.05; * - Kruskall-Wallace criterium for groups 1-4.
)
Рис. 1. Влияние различных доз ферментного препарата на содержание отдельных групп микроорганизмов в содержимом слепой кишки крыс на 80-е сутки эксперимента
Fig. 1. The effect of different doses of the enzyme preparation the levels of certain groups of microorganisms in the contents of the cecum of rats on the 80th day of the experiment
Ферментный препарат при введении в дозе 10 мг/кг вызывал увеличение количества бифидобактерий и лактобактерий в содержимом слепой кишки. Вместе с тем по мере дальнейшего увеличения дозы ФП наблюдалась тенденция снижения количества этих микроорганизмов (см. рис. 1). Следует отметить, что, поскольку состав микробиома зависит от множества факторов и, как правило, характеризуется высокой вариабельностью у различных особей, отмеченные тенденции в изменении количества микроорганизмов являются значимыми для организма и свидетельствуют о невыраженном, но негативном воздействии ФП в указанных дозировках на организм подопытных животных.
Влияние ферментного препарата на уровень и продукцию цитокинов и хемокинов
В сыворотке крови крыс (рис. 2) под воздействием средней дозы ФП (100 мг/кг) произошло статистически значимое увеличение уровня MIP-1a и снижение RANTES, а при наибольшей дозе (1000 мг/кг) возросли уровни ИЛ-4 и ИЛ-10 и многократно снизился уровень RANTES. Отношение ИЛ-10/ИЛ-17A, характеризующее сравнительную активность субпопуляций Treg- и Th17-лимфоцитов [19, 20], демонстрирует тенденцию к росту в зависимости от дозы ФП (p<0,05, критерий Краскела-Уоллиса для 1, 3, 4-й групп), хотя и не различается достоверно при попарном сравнении групп. При этом сам уровень ИЛ-17A остается без видимых изменений.
)
Рис. 2. Уровни цитокинов и хемокинов в плазме крови крыс 1, 3 и 4-й групп (M±m, n=9 в каждой группе)
* - статистически значимое различие (p<0,05) для сравниваемых групп согласно U-критерию Манна-Уитни. Данные для 2-й группы не были получены. Здесь и на рис. 3, 4: расшифровка аббревиатур дана в тексте.
Fig. 2. Plasma levels of cytokines and chemokines in rats of groups 1, 3 and 4 (M±m, n=9 in each group)
* - p<0.05 for compared groups, Mann-Whitney U-test. Data for group 2 were not available. Here and in fig. 3, 4: abbreviations are given in the text.
В селезенке (рис. 3) крыс внутрижелудочное введение ФП привело к статистически значимому возрастанию содержания ИЛ-1α, ИЛ-10 при дозе 1000 мг/кг, а ИЛ-17A - уже при дозе 100 мг/кг. При этом соотношение ИЛ-10/ИЛ-17 статистически значимо снизилось при наибольшей из доз ФП. В противоположность сыворотке крови наименьший уровень MIP-1a в селезенке отмечался при дозе ФП 100 мг/кг (p<0,01 по сравнению с контролем). Полученные данные о составе цитокинов и хемокинов в крови и селезенке подопытных животных свидетельствуют об усилении аллергического ответа и воспалительных процессов при введении ФП в дозах 100 мг/кг и выше.
)
Рис. 3. Уровни цитокинов и хемокинов в лизатах селезенки крыс 1-4-й групп (M±m, n=9 в каждой группе)
Статистически значимое различие для сравниваемых групп, согласно U-критерию Манна-Уитни: * - p<0,05, ** - p<0,01.
Fig. 3. Levels of cytokines and chemokines in spleen lysates of rats from groups 1-4 (M±m, n=9 in each group).
* - p<0.05; ** - p<0.01 for compared groups, Mann-Whitney U-test.
Исследование иммуномодулирующего и аллергенного действия ферментного препарата
При изучении аллергенного и иммуномодулирующего действия ФП на модели системной анафилаксии на протяжении всего периода сенсибилизации крысы опытной и контрольной групп практически с равной скоростью прибавляли в массе тела (p>0,1, ANOVA).
После введения разрешающей дозы на 29-е сутки в опытной и контрольной группах крыс наблюдали развитие реакции анафилаксии. Как следует из представленных данных (рис. 4), внутрижелудочное введение крысам ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела не изменяло их чувствительность к развитию реакции системной анафилаксии (уровень значимости различия распределений p>0,05 согласно многомерному критерию χ2). В табл. 3 приведены результаты определения уровня специфических антител IgG (1+4) к ОВА у сенсибилизированных крыс контрольной и опытной групп. Данные определения показывают, что достоверное влияние внутрижелудочно вводимого ФП на ответ антител к ОВА отсутствует. В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела не изменяет гуморальный иммунный ответ и не увеличивает тяжесть реакции крыс на введение разрешающей дозы антигена на модели системной анафилаксии.
Таблица 3. Уровень специфических антител IgG к овальбумину у сенсибилизированных крыс контрольной и опытной групп (M±m)
Table 3. The level of specific IgG antibodies to ovalbumin in sensitized rats of the control and experimental groups (M±m)
)
* - оптическая плотность при λ=492 нм.
* - optical density at λ=492 nm.
)
Рис. 4. Распределение крыс по тяжести реакции анафилаксии, выраженной в баллах
0 - нет реакции; 1-4 - тяжесть реакции в баллах.
Fig. 4. Distribution of rats by the severity of anaphylaxis reaction, expressed in points
0 - no reaction; 1-4 - the severity of the reaction in points.
Обсуждение
Предыдущими исследованиями показано, что ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 - в используемых в эксперименте дозах не обладал острой токсичностью, не оказывал неблагоприятного влияния на когнитивную функцию, состояние слизистого барьера тонкой кишки и стандартные биохимические показатели. Однако в дозе свыше 100 мг на 1 кг массы тела и более отмечалось воздействие ФП на гематологические показатели животных и усиление процессов апоптоза клеток печени. Недействующая доза (NOEL) ФП составила 100 мг на 1 кг массы тела. Микотоксины в составе ФП не выявлены [21]. В настоящем исследовании нами выявлены изменения микробиома содержимого слепой кишки крыс, выражающиеся в увеличении количества плесеней и тенденции к росту содержания условно-патогенных микроорганизмов (Bacteroides spp., Enterobacteriaceae spp., Enterococcus spp.), способных вызвать воспалительный процесс и снижение количества симбионтной микрофлоры (лакто- и бифидобактерий). Это, в свою очередь, может свидетельствовать о снижении колонизационной резистентности кишечника при введении ФП в агравированных дозах.
Результаты нашего исследования, показали, что ФП в дозе 100 мг на 1 кг массы тела и выше воздействует на цитокиновый профиль животных и содержание хемокинов. В сыворотке крови характерным было возрастание уровня ИЛ-4, связанного с развитием иммунного ответа по Th2-хелперному пути [5-7]. Одновременно отмечалось возрастание уровня MIP-1a, выступающего в роли основного хемоаттрактанта для моноцитов/макрофагов и дендритных клеток. Выраженное дозозависимое снижение RANTES, отвечающего за рекрутирование Т-лимфоцитов и NK-клеток, стоит расценивать как результат влияния ФП на микробиом кишечника и иммунный статус организма.
Наблюдавшееся в лизатах клеток селезенки при увеличении вводимой концентрации ФП снижение отношения ИЛ-10/ИЛ-17A свидетельствует о преобладании активности Th17-лимфоцитов над Treg-популяциями, что в совокупности с увеличением продукции ИЛ-1α свидетельствует о стимуляции воспалительных процессов при введении ФП в дозах 100 мг/кг и выше. Данные процессы обусловлены, по-видимому, изменением качественного и количественного состава микробиома слепой кишки в результате действия ФП на пищевые субстраты.
Рассмотренные неблагоприятные эффекты ФП наблюдаются при его внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг, которая может рассматриваться как минимальная доза, оказывающая неблагоприятное действие (LOAEL) по этим показателям в условиях 3-месячного поступления ФП в организм животных. С использованием этой дозы в отдельном эксперименте была проведена оценка влияния ФП на аллергическую чувствительность крыс на модели системной анафилаксии. Проведенные тесты показали, что усиления сенсибилизации модельным пищевым антигеном и тяжести вызываемой введением его разрешающей дозы реакции системной анафилаксии не происходит, т.е. ФП не может рассматриваться как фактор, повышающий аллергическую чувствительность.
В соответствии с требованиями Технического регламента Таможенного союза "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств" (ТР ТС 029/2012) активность ФП не должна проявляться в готовой для применения пищевой продукции. При условии соблюдения этого требования его количество, поступающее в организм, не может превысить установленный уровень LOAEL. Следовательно, ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы - может быть использован в пищевой промышленности при условии установления регламента "для технологических целей" в отношении штамма A. awamori Xyl T-15 и отсутствии активности этого ФП в готовой пищевой продукции.
Заключение
Полученные результаты показали, что ФП - комплекс глюкоамилазы и ксиланазы из A. awamori Xyl T-15 в дозах свыше 100 мг на 1 кг массы тела вызывает нарушение микробиома кишечника, оказывает иммуномодулирующее и иммунотоксическое действие на организм подопытных животных. Полученные данные указывают на необходимость включения изучения взаимосвязи иммунологических показателей и состава микробиоценоза кишечника в протокол испытаний безопасности пищевой продукции, получаемой с использованием микробного синтеза.