Intensity of processes of oxidative modification of proteins in women’s and cow’s milk

• Maria A. Sokolova
• Valeriy E. Vysokogorskiy
• Yuliya G. Rosenfeld
• Oleg V. Antonov
• Anna A. Komarova
• Yuliya A. Рodolnikova

Abstract

Breast milk is a source of all the essential nutritional components necessary for the full growth and development of the child, therefore, it is necessary to study its composition and physical and chemical properties in order to adapt human milk substitutes. Adapted infant milk formulas are produced mainly from cow’s milk, bringing formula nutrient composition closer to the composition of women’s milk, adapting it in accordance with the requirements of the infant body. However, technological processes for the production of dairy products contribute to the activation of oxidative reactions, the violation of protein conformation.

The purpose of the study was to compare the intensity of formation of carbonyl derivatives of human and cow’s milk proteins during spontaneous and metal-catalyzed oxidation.

Material and methods. The object of the study were samples of mature milk of healthy nursing mothers (n=12), and samples of drinking ultra-pasteurized milk for baby nutrition (n=8) which were used as a comparison material. The intensity of oxidative modification of milk proteins was determined spectrophotometrically by the interaction of carbonyl derivatives of amino acid residues with 2.4-dinitrophenylhydrazine to form 2.4-dinitrophenylhydrazone derivatives in a native sample of biological material and under induction of protein oxidation in vitro by the Fenton reaction by adding FeSO₄ and hydrogen peroxide solutions. The content of non-protein sulfhydryl groups was determined after protein precipitation spectrophotometrically with 5.5’-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid.

Results. The intensity of spontaneous (basic) oxidation doesn’t have significant differences between the indicators of breast and cow’s milk. Significant differences were established in the content of carbonyl derivatives of amino acid residues of human and cow’s milk proteins during metal-catalyzed oxidation. Incubation with iron ions caused 1.5–2.5 fold more formation of both aldehyde and ketone derivatives of cow’s milk proteins, recorded in the visible and ultraviolet spectrum. In cow’s milk during spontaneous oxidation and induction of oxidation by a metal, the percentage of aldehyde-dinitrophenylhydrazones was lower than in breast milk and, conversely, the proportion of ketone-dinitrophenylhydrazones, late markers of oxidative degradation of proteins, was significantly higher. The content of non-protein sulfhydryl groups in cow’s milk was 2 times less than in fresh human milk. A significant excessive content of aldehyde-dinitrophenylhydrazones (2 times) and ketone-dinitrophenylhydrazones (2.6 times) undet metal-catalyzed protein oxidation of cow’s milk in comparison with breast milk indicates a lower level of antioxidant reserves of cow’s milk. This is confirmed by the reduced level of non-protein sulfhydryl groups. The results obtained indicate the need to improve the antioxidant status of dairy products for infant nutrition.

Keywords:breast milk; cow’s milk; protein oxidative modification; metal-catalyzed protein oxidation; carbonyl derivatives; sulfhydryl groups

Биологическая ценность и уникальность грудного молока для новорожденных общепризнана и не вызывает сомнений. В то же время довольно часто возникают ситуации, когда лактационная способность женщины нарушена или отсутствует. В результате эпидемиологического исследования установлено, что только 77% новорожденных находятся исключительно на грудном вскармливании, к 1-му месяцу жизни прекращают получать грудное молоко 25,2% детей, ко 2-му - 16,9%, к 3-му - 14,3%, к 4-му - 14,5%. К 3-му месяцу получали адаптированные молочные смеси 55% детей, к 4-му - 70% [1, 2]. Поскольку именно грудное молоко является источником всех эссенциальных компонентов питания, необходимых для полноценного роста и развития ребенка, необходимо постоянно изучать его состав и физико-химические свойства, чтобы адаптировать заменители женского молока [3, 4]. Адаптированные молочные смеси производят преимущественно из коровьего молока, приближая их нутриентный состав к женскому молоку, адаптируя его в соответствии с потребностями детского организма [5, 6]. Однако различные факторы (высокие температуры, свет, ионы металлов) при технологических процессах производства молочных продуктов способствуют активации окислительных реакций, нарушению конформации белка [7-9]. Свободные радикалы могут генерировать окислительные модификации, к которым особенно восприимчивы белки из-за их высокого содержания и реакционной чувствительности к окислителям [8]. Эти реакции способны приводить как к фрагментации белка, так и к агрегации посредством ковалентных поперечных связей или гидрофобных взаимодействий. По мнению P.A. Finot, такие изменения могут приводить к нарушению усвояемости белка, его биодоступности, снижению пищевой ценности с возможными неблагоприятными последствиями для роста и развития младенцев [10].

Основными участками модификации белка являются боковые цепи аминокислот. Особенно чувствительны к окислению серосодержащие аминокислоты: цистеин, метионин [8, 11]. Тепловое воздействие может привести к образованию агрегатов сывороточных белков молока, прежде всего β-лактоглобулина [12, 13]. Боковые цепи многих алифатических аминокислот, особенно аргинина, лизина, треонина и пролина, посредством необратимых процессов могут быть преобразованы в гидропероксиды, спирты и карбонилы, именно поэтому для оценки степени окисления белка используется количественное определение спиртов и карбонилов [8]. Карбонильные производные белков более стабильны, в отличие от продуктов пероксидного окисления липидов, и являются надежными маркерами окислительного стресса [14]. При исследовании уровня карбонилов и других продуктов окисления аминокислот установлены значительные модификации белков в процессе производства детских молочных смесей из коровьего молока [15].

Потерю белком каталитической активности и увеличение чувствительности к протеолитической деградации вызывает металл-катализируемое окисление (МКО) белков, которое приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков белков, превращению их в карбонильные производные. Увеличение содержания карбонильных производных при МКО белков указывает на истощение резервных возможностей биологической системы, поэтому сравнение уровня окислительной модификации белков женского молока и пастеризованного молока имеет важное значение для выбора направления адаптации детских молочных смесей с целью повышения их антиокислительных свойств.

Различные технологические факторы пастеризации коровьего молока оказывают существенное воздействие на его структуру и свойства как основного материала для изготовления молочных смесей. Высокие температуры вызывают разрушение полифенолов, в значительной степени определяющих антиокислительную активность молока [16], снижение антиокислительной активности подтверждается повышением интенсивности хемилюминесценции [17], активацией перекисного окисления липидов [18]. Однако наиболее надежным маркером оксидантного стресса, окислительных повреждений является уровень карбонильных производных белков. Особенности строения белковой молекулы позволяют считать их одной из основных ловушек активных форм кислорода, регистрация содержания карбонильных производных является наиболее распространенным методом анализа окислительной модификации белков [19]. Накопление активных карбонильных соединений приводит к развитию карбонилового стресса [20]. Уровень карбонильных производных белков оценивается по двум параметрам: в нативной пробе биологического материала и при индукции in vitro окисления белков по реакции Фентона добавлением растворов FeSO₄ и пероксида водорода - МКО белков. МКО белков приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков белков, превращению их в карбонильные производные, потере белком каталитической активности и увеличению чувствительности к протеолитической деградации. Увеличение содержания карбонильных производных при МКО белков указывает на истощение резервных возможностей биологической системы, поэтому сравнение уровня окислительной модификации белков женского молока и пастеризованного молока имеет важное значение для выбора направления адаптации детских молочных смесей с целью повышения их антиоксидантных свойств.

В детских молочных смесях обнаружено повышенное содержание карбонилов, образование как восстанавливаемых (дисульфидных), так и невосстанавливаемых внутренних связей в белках, присутствие модифицированных аминокислот, значительного уровня рацемизированных (D-) аминокислот [15]. Поскольку для производства молочных смесей для детского питания используется чаще всего коровье молоко, представляется важным выяснить интенсивность процессов окислительной модификации белков пастеризованного молока коров.

Цель исследования - сравнить интенсивность образования карбонильных производных белков женского и коровьего молока при спонтанном и металл-катализированном окислении.

Материал и методы

Исследованы 12 образцов зрелого молока, взятого через 1-6 мес после родов у некурящих здоровых матерей, среднего возраста 28 лет, которые рожали в срок и кормили грудью своих детей начиная с первого дня после родов. Все участники были полностью проинформированы о процедуре и дали свое письменное добровольное информированное согласие на участие. Для сравнения проведен анализ 8 образцов коровьего молока питьевого ультрапастеризованного для детского питания "Тема" (ОАО "Юнимилк", Россия, ТУ 10.86.10-076-13605199), в 100 г содержится 3,2 г жира, 3,0 г белка. Расчет всех исследуемых показателей проведен на 1 мг белка.

Окислительную модификацию белков молока оценивали по методу A.Z. Reznick, L. Parker в модификации Е.Е. Дубининой и соавт. [20], основанному на реакции взаимодействия карбонильных производных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Спектры поглощения альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) регистрировали на спектрофотометре UNICO 2800 (United Products & Instruments, США).

Уровень карбонильных производных белков оценивается по двум параметрам: в нативной пробе биологического материала и при индукции in vitro окисления белков по реакции Фентона добавлением растворов FeSO₄ и пероксида водорода - МКО белков.

После инкубации молока с 10 мМ раствором FeSO₄ и 0,3 мМ H₂O₂ в течение 15 мин при 37 °С определяли интенсивность МКО белков для выявления резервных возможностей антиокислительной системы молока. Содержание АДНФГ определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 230, 254, 270, 280, 356 нм, а уровень КДНФГ - при 363 и 370 нм и в области видимого света для АДНФГ - при 428 и 430 нм и для КДНФГ - при 434, 524, 530, 535 нм. По полученным значениям экстинкций рассчитывали площадь под кривой, выраженной в условных единицах на 1 г белка, в соответствии с рекомендациями М.А. Фоминой и соавт., по способу комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях [21].

Содержание небелковых сульфгидрильных групп в коровьем и грудном молоке определяли по модифицированной методике Z. Chen и соавт. [15].

При оценке значимости полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез с применением программы Statistica 6. Проверку на соответствие выборок нормальному закону распределения проводили, используя критерий Шапиро-Уилка. В связи с отсутствием согласия данных с нормальным распределением на уровне значимости р<0,05, результаты представлены в виде медианы (Me) и диапазона между нижним (LQ, 25-й процентиль) и верхним (UQ, 75-й процентиль) квартилями. Различия между значениями показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью непараметрического U-критерию Манна-Уитни для малых групп. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне р<0,05.

References

1. Tutelyan V.A., Baturin A.K., Kon’ I.Ya., Keshabyants E.E., Starovoytov M.L., Safronova A.M., et al. The nature of nutrition of infants and young children in the Russian Federation: the practice of introducing complementary foods. Pediatriya. Zhurnal imeni G.N. Speranskogo [Pediatrics Journal named after G.N. Speranskiy]. 2009; 88 (6): 77–83. (in Russian)

2. Sibiryakova N.V., Chaprasova O.A., Kargina A.A., Abdurakhimova P.M. The prevalence of breastfeeding. CHRONOS. 2021; 6 (11): 25–6. (in Russian)

3. Zakharova I.N., Machneva E.B., Oblogina I.S. Breast milk is a living tissue! How to preserve breastfeeding? Meditsinskiy sovet [Medical Council]. 2017; (19): 24–9. DOI: https://doi.org/10.21518/2079-701X-2017-19-24-29 (in Russian)

4. WHO. Healthy Diet. Fact Sheet No. 394. Geneva: WHO, 2018.

5. Gapparov M.M., Levachev M.M. Nutrition of children of the first year of life: a nutritionist’s view. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2001; (4): 23–7. (in Russian)

6. Vereshсhagina T.G. Modern principles of adaptation of infant formula. Rossiyskiy vestnik perinatologii i pediatrii [Russian Bulletin of Perinatology and Pediatrics]. 2009; (4): 11–4. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sovremennye-printsipy-adaptatsii-detskih-molochnyh-smesey (in Russian)

7. Gathercole J., Reis M.G., Agnew M., et al. Molecular modification associated with the heat treatment of bovine milk. Int Dairy J. 2017; 73: 74–83. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2017.05.008

8. Davies M.J. Protein oxidation and peroxidation. Biochem J. 2016; 73 (7): 805–25. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20151227

9. Shcherbakova Yu.V. The effect of heat treatment on the components of the antioxidant system of milk and its integral antioxidant activity: Autoabstract of Diss. Moscow, 2011. (in Russian)

10. Finot P.A. The absorption and metabolism of modified amino acids in processed foods. J AOAC Int. 2005; 88 (3): 894–903. DOI: https://doi.org/10.1093/jaoac/88.3.894

11. Schoneich C. Sulfur radical-induced redox modifications in proteins: analysis and mechanistic aspects. Antioxid Redox Signal. 2017; 26 (8): 388–405. DOI: https://doi.org/10.1089/ars.2016.6779

12. Kramer A.C., Thulstrup P.W., Lund M.N., Davies M.J. Key role of cysteine residues and sulfenic acids in thermal- and H₂O₂-mediated modification of beta-lactoglobulin. Free Radic Biol Med. 2016; 97: 544–55. DOI: https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016. 07.010

13. Bielecka M., Cichosz G., Czeczot H. Antioxidant, antimicrobial and anticarcinogenic activities of bovine milk proteins and their hydrolysates – a review. Int Dairy J. 2022; 127: 105208. DOI: https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2021.105208

14. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Milzani A., Colombo R. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta. 2003; 329: 23–38. DOI: https://doi.org/10.1016/S0009-8981(03)00003-2

15. Chen Z., Leinisch F., Greco I., Zhang W., Shu N., Chuang Ch. Y., et al. Characterisation and quantification of protein oxidative modifications and amino acid racemisation in powdered infant milk formula. Free Radic Res. 2019; 53 (1): 68–81. DOI: https://doi.org/10.1080/10715762.2018.1554250

16. Shidlovskaya V.P., Yurova E.A. Antioxidant activity of enzymes. Molochnaya promyshlennost’ [Dairy Industry]. 2011; (12): 48–9. (in Russian)

17. Vysokogorsky V.E., Ignat’eva G.V. Chemiluminescent analysis of pasteurized milk. Pishchevaya promyshlennost’ [Food Industry]. 2012; (10): 34–6. (in Russian)

18. Vysokogorsky V.E., Veselov P.V. Evaluation of the antioxidant properties of goat and cow’s milk. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2010; 79 (1): 56–8. (in Russian)

19. Cai W., Gao Q.D., Zhu L., Peppa M., He C., Vlassara H. Oxidative stress-inducing carbonyl compounds from common foods: novel mediators of cellular dysfunction. Mol Med. 2002; 8 (7): 337–46. DOI: https://doi.org/10.1007/BF03402014

20. Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Khodov D.A., Porotov G.E. Oxidative modification of human serum proteins, method of its determination. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of Medical Chemistry]. 1995; 41 (1): 24–6. (in Russian)

21. Fomina M.A., Abalenikhina Uu.V. Method of complex assessment of the content of oxidative modification products of proteins in tissues and biological fluids: methodological recommendations. Ryazan’: RIO RyazGMU, 2014: 60 p. (in Russian)

22. Shakhristova E.V., Stepovaya E.A., Ivanov V.V., Nosareva O.L., Ryazantseva N.V., Novitsky V.V. Oxidative modification of proteins and the glutathione system in adipocytes in diabetes mellitus. Byulleten’ sibirskoy meditsiny [Bulletin of Siberian Medicine]. 2014; 13 (3): 84–90. (in Russian)

23. Dubinina E.E. Products of oxygen metabolism in the functional activity of cells (life and death, creation and destruction). Physiological and clinical-biochemical aspects. Sannt Petersburg: Meditsinskaya pressa, 2006: 400 p. ISBN 5-85474-072-9. (in Russian)

24. Kehm R., Baldensperger T., Raupbach J., Höhn A. Protein oxidation-formation mechanisms, detection and relevance as biomarkers in human diseases. Redox Biol. 2021; 42: 101901. DOI: https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.101901

25. Estévez M., Díaz-Velasco S., Martínez R. Protein carbonylation in food and nutrition: a concise update. Amino Acids. 2022; 54: 559–73. DOI: https://doi.org/10.1007/s00726-021-03085-6

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.