Влияние тритерпеноидов в составе жиросодержащих продуктов на состояние печени лабораторных животных с острым токсическим гепатитом

• Аверьянова Елена Витальевна
• Школьникова Марина Николаевна
• Чугунова Ольга Викторовна
• Мазко Олеся Николаевна

Резюме

Одним из принципов профилактики и немедикаментозного лечения заболеваний печени, в том числе гепатитов различной этиологии, является нормализация рациона питания за счет ежедневного потребления пищевых продуктов с физиологически активными ингредиентами, в частности бетулином, который способствует устранению причин нарушения обменных и окислительных процессов внутри клеток печени.

Цель работы - оценка влияния in vivo выделенного из бересты березы Betula pendula Roth. тритерпенового спирта бетулина в составе жиросодержащих продуктов (на примере майонеза) на биохимические показатели крови и морфологическую структуру печени крыс с инициированным острым токсическим гепатитом.

Материал и методы. Исследована гепатопротекторная и антиоксидантная активность бетулина в составе образцов майонеза in vivo на модели токсического гепатита, инициированного тетрахлорметаном у крыс-самцов линии Вистар с массой тела 210-265 г. Животные были разделены на 4 группы по 10 особей в каждой: КГ-1 - интактные, КГ-2, ОГ-1 и ОГ-2 - с инициированным тетрахлорметаном токсическим гепатитом. Крысам основных групп перорально вводили майонез 1 раз в сутки в дозировке 1 мл в течение 21 дня после формирования модельной патологии: животным ОГ-1 - с добавлением бетулина (1 мг на 1 кг массы тела), ОГ-2 - без добавления бетулина. Нарушение обменных и окислительных процессов в клетках печени животных оценивали по биохимическим показателям плазмы крови (концентрация глюкозы, альбуминов, общего холестерина, триглицеридов и мочевины) и активности ферментов печеночной пробы (аланин- и аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и γ-глутамилтрансферазы). Показатели окислительного стресса у крыс оценивали по активности каталазы и супероксиддисмутазы в гемолизате крови (в разведении 1:200 и 1:10 соответственно); общую прооксидантную (в плазме крови) и общую антиоксидантную (в гемолизате крови в разведении 1:10) активность определяли спектрофотометрически по образующимся в результате цветной реакции окрашенным комплексам продуктов окисления ТВИН-80 с тиобарбитуровой кислотой. Морфологическую структуру печени крыс оценивали микроскопированием подготовленных срезов печеночной ткани.

Результаты. На основании биохимических исследований плазмы крови крыс установлено, что введение животным майонеза с бетулином предупреждает развитие цитолитического синдрома и подавляет процесс пероксидации посредством прямой нейтрализации свободных радикалов: статистически значимо (p<0,05) снизилась активность аспартатаминотрансферазы (на 20,7%) и щелочной фосфатазы (на 35,2%) в плазме крови животных основной группы ОГ-1 по сравнению с показателями крыс группы ОГ-2, нормализовалась концентрация глюкозы до уровня контрольной группы; уменьшилась концентрация билирубина (на 22,9%) и триглицеридов (на 48,1%), что свидетельствует о достоверном уменьшении показателей холестатического синдрома в группе животных ОГ-1 в сравнении с ОГ-2; снизились общая прооксидантная активность и концентрация тиобарбитурат-реактивных продуктов по сравнению с группами КГ-2 и ОГ-2, что свидетельствует о подавлении окислительного стресса и, как следствие, об улучшении состояния печени животных с токсическим гепатитом даже на фоне приема жиросодержащего продукта. В гистопрепаратах печени животных, получавших майонез с бетулином, некробиотические изменения менее выражены в сравнении с группой ОГ-2 и оцениваются в 1 балл: обнаружены очаги мелкокапельной дистрофии, кровоизлияния в междольковые перегородки с воспалительной инфильтрацией по ходу кровоизлияний против наличия некрозов гепатоцитов с выраженной жировой дистрофией в центрах долек, ступенчатых некрозов с признаками замещения поврежденных гепатоцитов соединительной тканью, сопровождающейся центролобулярными кровоизлияниями.

Заключение. Введенный в состав майонеза бетулин способствует торможению развития синдрома цитолиза при токсическом гепатите у крыс и подавляет процессы перекисного окисления, на основании чего жиросодержащие пищевые продукты с бетулином в составе могут быть рекомендованы к клиническому изучению в качестве специализированных продуктов при острых и хронических заболеваниях печени, в том числе осложненных холестазом.

Ключевые слова:бетулин; майонез; токсический гепатит; крысы; биохимические показатели крови; антиоксидантная активность; морфологическая структура печени

Печень млекопитающих имеет зональную организацию на доли и дольки, паренхиматозные клетки и гепатоциты которых обусловливают функциональное влияние на высокую метаболическую способность и способность к детоксикации [1]. Таким образом, печень является эндокринным органом и центром химической обработки, синтеза новых субстанций и обезвреживания токсических веществ; при этом ее поражение возможно под воздействием различных факторов, включая гепатотропные вирусы (гепатита от А до Е), токсические вещества (алкогольные напитки, лекарственные средства и т.д.) и ксенобиотики (промышленные загрязнители, пестициды, препараты бытовой химии), дисметаболические нарушения и др., в результате чего возможно развитие хронической патологии печени [2]. По данным Всемирной организации здравоохранения, в последние два десятилетия наблюдается тенденция к росту заболеваний печени как вирусной, так и невирусной этиологии, при этом хронические заболевания печени занимают существенное место среди причин ранней нетрудоспособности и смертности населения [2]. Поражения печени, независимо от этиологии, проявляются примерно в одной и той же последовательности, называемой "печеночным континуумом", конечным звеном которого становятся хронические диффузные заболевания печени, профилактика которых, по мнению гепатологов, наряду с терапией представляет большой научно-практический интерес с точки зрения общественного здравоохранения [2, 3].

Несмотря на достижения последних лет в области клинической фармакологии, основным и обязательным этапом лечения и профилактики хронических диффузных заболеваний печени является изменение образа жизни, основанное на 2 основных принципах: во-первых, нормализация рациона питания, в частности уменьшение энергетической ценности рациона за счет ограничения потребления жиров животного происхождения и легкоусвояемых углеводов; во-вторых, введение в привычку ежедневной физической активности [4].

При этом диета рассматривается в качестве основы немедикаментозного лечения и подразумевает ограничительный принцип. Однако, по мнению А.Н. Сасуновой и соавт., изменение сформировавшихся привычек пищевого поведения, а также необходимость постоянно подбирать ингредиентный состав рациона и рассчитывать его калорийность могут приводить к отказу пациентов от диеты и в результате к снижению эффективности лечения [5]. Кроме того, сочетание диетотерапии с аэробной физической нагрузкой и силовыми упражнениями ограничено для некоторых групп пациентов, например с сопутствующими заболеваниями опорно-двигательного аппарата и сердечно-сосудистой системы, а они составляют значительное число больных, в связи с чем принципиальное значение для данного сегмента потребителей имеет совершенствование рациона - разработка и выпуск пищевых продуктов ежедневного рациона с подтвержденными безопасностью и полезными свойствами.

С этой позиции представлялось интересным изучить возможность разработки такого продукта, как майонез - эмульсионого масложирового, предназначенного для улучшения вкуса и усвояемости основных блюд. Несмотря на то что майонез не считается продуктом здорового питания из-за высокого содержания жировой составляющей, это привычный пищевой продукт для потребителей во многих странах мира. Так, по данным Росстата, 37,7% россиян старше 14 лет потребляют майонез чаще 1 раза в неделю, почти 50,0% опрошенных - хотя бы раз в месяц и лишь 12,5% ответили, что практически не употребляют майонез. В 2021 г. в России произведено 765,2 тыс. т майонеза, что на 3% больше, чем в 2020 г., и в целом за последние 5 лет объемы производства майонеза стабильны на уровне 760-780 тыс. т [6].

С точки зрения пищевой матрицы, майонезы в большинстве случаев - прямые концентрированные эмульсии или дисперсные системы, состоящие из взаимно нерастворимых жидкостей, где одна жидкость равномерно распределена в другой в виде мельчайших капель [7].

Возможность обогащения рациона растворимыми пищевыми волокнами, полиненасыщенными жирными кислотами, веществами с антиоксидантной активностью и другими, способствующими уменьшению воспалительного процесса в ткани печени, оценена в ряде исследований [5, 8-10]. В работах [11, 12] показано, что наиболее часто для ослабления воспалительного процесса в ткани печени используют антиоксиданты (отдельно или в сочетании) - силимарин, витамин Е, тиоктовую (α-липоевую) кислоту, фенольные вещества и др. В частности, для регуляция клеточных факторов, опосредующих повреждение печени и регенерацию после острого токсического повреждения печени, применяют природный фитоалексин, производное транс-стильбена - ресвератрол [13]; гепатотоксичность, вызванную мышьяком, кадмием, хромом, медью, свинцом и ртутью, снижает производное феруловой кислоты - куркумин [14].

Следует отметить, что при разработке "полезных" майонеза, соусов и заправок на его основе в приоритете использование местного растительного сырья, в том числе вторичного, действующие вещества которого придают функциональную направленность готовому продукту и обладают хорошими технологическими свойствами (эмульгаторы, антиоксиданты, стабилизаторы консистенции и др.). Это хорошо согласуется с современными исследованиями по разработке составов майонеза, которые развиваются в 2 основных направлениях: использование заменителей жира и/или добавление в майонез функциональных пищевых ингредиентов, в частности пребиотиков, антиоксидантов, а также пищевых добавок - консервантов и др. [15-17].

Одним из таких природных ингредиентов является бетулин [луп-20(29)-ен-3,28-диол, C₃₀H₅₀O₂, CAS: 473-98-3] - пентациклический тритерпеновый спирт лупанового ряда, содержащийся в количестве от 25 до 50% во внешней части коры белоствольных берез (бересте). Бетулин и его производные обладают доказанной терапевтической активностью при лечении нарушений обмена веществ [18], инфекционных [19, 20], гепатопротекторных [21] и сердечно-сосудистых заболеваний [20], неврологических расстройств и др. [22, 23]. Он не токсичен, не вызывает аллергических реакций, не оказывает тератогенного, кожнораздражающего, канцерогенного, кумулятивного, мутагенного действия и не влияет на развитие плаценты [24, 25].

В морфологических исследованиях показана высокая активность бетулина и его окисленной формы - бетулоновой кислоты - против острого токсического гепатита, а их регулярный прием уменьшает нефротический синдром [26].

Бетулин имеет в своей структуре двойную связь в изопропенильной группе (С-20, 29) и 2 гидроксильные группы: первичную (С-28) и вторичную (С-3), обе связаны с алкильными фрагментами и проявляют классические спиртовые свойства, благодаря чему бетулин имеет большее сходство с растворителями средней полярности, чем с малополярными растворителями (рис. 1).

Однако бетулин нерастворим в воде, так как его молекула слишком велика для реализации пустотного механизма растворения, поэтому необходима такая его форма или пищевая матрица, которая будет способствовать растворению и максимальному усвоению. Состав матрицы пищевых продуктов имеет решающее значение для биодоступности микроингредиентов вообще и тритерпенов в частности, так как, прежде чем попасть к месту абсорбции в тонкую кишку, они перевариваются в ротовой полости, желудке и двенадцатиперстной кишке, подвергаясь механическому и ферментативному воздействию при различных значениях pH. Кроме того, тритерпены в составе пищевой матрицы взаимодействуют с макроингредиентами. Так, комплексы тритерпенов с белками, углеводами и пищевыми волокнами снижают их усвояемость, а присутствие жира в пищевой матрице, напротив, способствует солюбилизации и мицелляризации липофильных соединений до абсорбции, усиливая их всасывание [27].

Данные факты послужили предпосылкой для введения в состав майонеза функционального пищевого ингредиента бетулина, потребление которого предотвращает нарушения обменных и окислительных процессов внутри клеток печени.

Цель исследования - оценка влияния in vivo выделенного из бересты березы Betula pendula Roth. тритерпенового спирта бетулина в составе жиросодержащих продуктов (на примере майонеза) на биохимические показатели крови и морфологическую структуру печени крыс с инициированным острым токсическим гепатитом.

Материал и методы

Бетулин получен по методу, разработанному и запатентованному в [28] экстракцией предварительно активированной бересты 86% этиловым спиртом. Коэффициент извлечения 97%; Т_пл = 259-260 °С (из этилового спирта). Подлинность экспериментального образца бетулина подтверждена данными ИК-спектроскопии: ν(О-Н) 3374,42 см^-1, для СН₃-групп ν(С-Н)_s 2939,92 см^-1 и δ(С-Н)_s 1375,62 см^-1, ν(С-О) 1029,57 см^-1, что соответствует данным литературы [29], и результатами элементного анализа (найдено: C - 81,2%; H - 11,5%; О - 7,2%; вычислено: C - 81,4%; H - 11,3%; О - 7,2%). Описанные выше проявления биологической активности бетулина и качество опытного образца позволяют рассматривать это биоактивное вещество как физиологически активный ингредиент в составе пищевых продуктов, в частности жиросодержащих - в майонезе.

Экспериментальные образцы майонеза приготовлены из традиционных ингредиентов по рецептуре майонеза "Провансаль" (67% жирности) по классической технологии с внесением в опытный образец 0,2% раствора бетулина в растительном масле в количестве 6% на этапе эмульгирования рецептурных компонентов, контролем являлся приготовленный аналогичным способом образец майонеза без внесения бетулина. Образцы получены без каких-либо химических консервантов, исследование их качества проведено в день приготовления. Подробно матрикс экспериментального образца майонеза "Провансаль" представлен в [30]. По результатам оценки на соответствие требованиям ГОСТ 31761-2012 "Майонезы и соусы майонезные. Общие технические условия" и ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" образцы признаны безопасными и стандартного качества.

Физиолого-биохимические исследования гепатопротекторной активности бетулина в составе образцов майонеза проводили in vivo на 40 сертифицированных крысах-самцах линии Вистар массой тела 210-265 г, предоставленных ФГБНУ ФИЦ ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, Россия), в зимне-весенний период в течение 28 дней. Эксперименты проводили в соответствии с ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". Крысы были подвижны и активны, шерсть гладкая, чистая, кожные покровы и слизистые бледно-розового цвета.

После недельной адаптации крысы были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой - 2 контрольные (КГ) и 2 основные группы (ОГ). Животных содержали в клетке в контролируемых условиях окружающей среды: T = 22±2 °C, относительная влажность воздуха 40-45%, с 12-часовым циклом освещения. Животные получали общевиварный рацион и воду ad libitum. Животные КГ-1 - интактные, КГ-2 - с инициированным тетрахлорметаном (ССl₄) токсическим гепатитом, обеих ОГ - с инициированным ССl₄ токсическим гепатитом, дополнительно животным ОГ-1 в общевиварный рацион был введен майонез с добавлением бетулина, ОГ-2 - майонез без добавления бетулина. Образцы майонеза (с бетулином и без) вводили 1 раз в сутки перорально в дозировке 1 мл на 1 животное в течение 21 дня после формирования модельной патологии.

Токсический гепатит инициировали внутрибрюшным введением животным 1 мл 25% масляного раствора ССl₄ в течение 6 сут. Животных выводили из эксперимента на 28-е сутки после 16-часового голодания, под эфирным наркозом путем декапитации осуществляли эвтаназию экспериментальных животных с последующим забором крови и тканей печени для исследований в асептических условиях.

ССl₄-индуцированная модель токсического гепатита выбрана как широко используемая в практике доклинических исследований для воспроизведения печеночной недостаточности у мелких лабораторных животных, наряду с хирургическими манипуляциями и инициированием инфекционного процесса, провоцирующая цитолиз и гибель гепатоцитов [31].

Нарушение обменных и окислительных процессов в клетках печени оценивали по характеризующим функцию печени биохимическим показателям крови: концентрация глюкозы, альбуминов, общего холестерина, триглицеридов и мочевины [32], а также по активности печеночных ферментов: аланин- (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и γ-глутамилтрансферазы (ГГТ), являющихся индикаторами цитолиза при косвенной оценке тяжести повреждения гепатоцитов [33] и определяемых фотометрически кинетическим методом с использованием наборов реагентов (АО "Витал Девелопмент Корпорэйшн", Россия).

Показатели окислительного стресса у крыс оценивали по активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате крови: активность каталазы - по подавлению ферментом окисления молибдата натрия перекисью водорода (разведение 1:200); активность СОД - по содержанию в пробе нитроформазана, окрашенного продукта восстановления нитротетразолия супероксидными радикалами (в разведении 1:10). Концентрацию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП) - определяли фотометрически в плазме крови животных по интенсивности окраски образования оснований Шиффа с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Общую антиоксидантную активность определяли в гемолизате крови в разведении 1:10 по способности подавлять Fe²⁺/аскорбат-индуцированное окисление ТВИН-80 с последующим спектрофотометрическим определением образующихся в результате цветной реакции окрашенных комплексов продуктов окисления с ТБК. Общую прооксидантную активность (ОПА) определяли в плазме крови по способности подавлять окисление ТВИН-80 с последующим спектрофотометрическим определением образующихся в результате цветной реакции окрашенных комплексов продуктов окисления с ТБК [34].

Влияние экспериментальных образцов майонеза с бетулином на морфологическую структуру печени крыс с токсическим гепатитом, вызванным введением ССl₄, оценивали полуколичественным методом, согласно которому подготовленные срезы печеночной ткани толщиной 10-15 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и затем микроскопировали.

Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований проводили с использованием программы Statistica 6.1 с вычислением значений средней величины (M) и стандартного отклонения (σ). Соответствие выборок закону нормального распределения оценивали по критерию Шапиро-Уилка. При определении статистической значимости различий использовали критерии Манна-Уитни, Стьюдента и Вилкоксона.

Результаты и обсуждение

Эффективность майонеза с добавлением 0,2% раствора бетулина в растительном масле в обеспечивающем функциональные свойства продукта количестве 6%, оценивали в эксперименте in vivo при пероральном введении.

Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что маркеры цитолиза гепатоцитов в крови животных с инициированным ССl₄ гепатитом (КГ-2) значительно отличались от нормы (КГ-1): повысилась активность ферментов - АЛТ на 88,4%, АСТ на 59,0%, ЩФ на 72,0% и ГГТ на 21,0%. Бетулин в составе майонеза ослаблял гепатотоксическое действие ССl₄, на что указывает значительное снижение активности ферментов АСТ и ЩФ в крови животных ОГ-1 по сравнению с биохимическими показателями крови крыс ОГ-2 - АСТ на 20,7% и ЩФ на 35,2% (р≤0,05). Понижение активности ГГТ на 13,9% у животных ОГ-1, получавших майонез с бетулином, свидетельствует о тенденции к увеличению азотистого обмена при снижении уровня цитолиза гепатоцитов по сравнению с животными ОГ-2, получавшими майонез без бетулина (р≤0,09).

Согласно данным табл. 1, острый токсический гепатит, вызванный ССl₄, приводил к развитию холестатического синдрома, о чем свидетельствует повышение в сыворотке крови животных КГ-2 уровня билирубина на 53,4%. О нарушении глюкогенеза свидетельствует понижение уровня глюкозы на 42,5%, а уменьшение концентрации альбумина в плазме крови на 32,2% в совокупности с другими показателями указывает на нарушение белок-синтезирующей функции печени.

Пероральное введение животным майонеза с бетулином (ОГ-1) привело к снижению содержания в плазме крови триглицеридов на 48,1% по сравнению с показателем животных ОГ-2. Однако этот показатель не достигал значения интактной группы (КГ-1), что, вероятно, связано со снижением активности митохондриального бета-окисления жирных кислот при токсическом поражении печени и высокой концентрацией жиров (не менее 67%) в самом продукте. Нормализующее влияние бетулина отмечено в изменении концентрации билирубина и триглицеридов, что свидетельствует о достоверном уменьшении показателей холестатического синдрома в экспериментальной группе животных ОГ-1.

Таким образом, биохимические исследования крови показали, что пероральное введение животным майонеза с бетулином в дозе 1 мл (что соответствует 1 мг бетулина на 1 кг массы тела животного) в течение 21 сут снижает развитие цитолитического синдрома на модели острого токсического гепатита, инициированного ССl₄.

Гепатопротекторный эффект тритерпеноидов связывают с их антиоксидантными свойствами - уменьшением активации ПОЛ и повышением устойчивости клеточных структур к свободнорадикальным процессам [35], в результате которых образуются активные формы кислорода (АФК), а мишенями для их атаки являются ненасыщенные жирные кислоты и фосфолипиды в составе цитоплазматических мембран [24]. Это дает основание предположить, что внесение бетулина в пищевые продукты может снизить риск развития окислительного стресса.

В условиях экспериментального гепатита наблюдаются признаки выраженного окислительного стресса, о чем свидетельствует увеличение концентрации ТБРП окисления жирных кислот и ОПА, а также повышение активности антиоксидантных ферментов: СОД и каталазы. Результаты исследования антиоксидантной активности майонеза с бетулином в экспериментах in vivo представлены в табл. 2.

На модели острого токсического гепатита установлено, что концентрация ТБРП относительно контроля КГ-2 снижалась в 2,1 раза в группе ОГ-1 и не отличалась от концентрации ТБРП у интактных крыс (КГ-1); значение ОПА в группе ОГ-1 снизилось в 1,9 раза относительно контрольной группы (КГ-2) и было несколько меньше значения ОПА у интактных крыс (КГ-1).

В сравнении с показателями интактных крыс (КГ-1) более чем в 2 раза возрастала активность СОД у крыс с индуцированным гепатитом, максимально для группы ОГ-1 (~2,3 раза). Активация СОД при гепатите может носить компенсаторный характер в ответ на гиперпродукцию супероксидного анион-радикала. Некоторое дополнительное увеличение активности СОД у крыс ОГ-1 можно объяснить тем, что тритерпеноиды в плазме крови проявляют антиоксидантные свойства, уменьшая процессы липопероксидации (на это указывает нормализация уровня ТБРП в группе ОГ-1 до уровня интактных животных), что, вероятно, стимулирует антиоксидантную защиту, проявляющуюся в увеличении активности СОД. Полученные результаты согласуются с данными по влиянию бетулина на окислительный стресс при воспалительном процессе [36]. Стимуляция свободнорадикального окисления, возникающая при гепатите, приводит к образованию значительного количества АФК, и, как следствие, к увеличению активности каталазы. Значительное увеличение активности каталазы в крови животных с гепатитом по сравнению с КГ-1 связано со способностью этого фермента катализировать разложение перекиси водорода, являющейся АФК, индуцируемой в условиях окислительного стресса.

Таким образом, повышение прооксидантной активности и уровня ТБРП у крыс группы КГ-2 по отношению к показателям животных группы КГ-1 свидетельствует о развитии окислительного стресса. Введение животным майонеза с бетулином приводило к достоверному (р≤0,05) уменьшению ОПА и снижению образования ТБРП по сравнению с группами КГ-2 и ОГ-2, что свидетельствует о снижении окислительного стресса и, как следствие, к улучшению состояния печени животных с токсическим гепатитом даже на фоне приема жиросодержащего продукта.

Согласно данным литературы, антиоксидантные функциональные группы бетулина встраиваются в мембраны гепатоцитов и превращают гидроперекиси полиеновых жирных кислот в нетоксичные оксикислоты с обрывом цепей ПОЛ [36]. Таким образом, ингибирующее действие бетулина на свободнорадикальные процессы, протекающие в клетке, обусловлено наличием спиртовых групп, участвующих в обмене активных радикалов на оксипероксильные, что приводит к уменьшению энтропии при образовании активированного окислительного комплекса и увеличению вероятности обрыва цепи [36, 37]. Изменения у С-28, как правило, сочетаются с окислением вторичной спиртовой группы у C-3 до кетона и являются более перспективными по сравнению с окислением двойной связи С-20, 29 изопренильного заместителя у С-19 лупанового ядра [38] (рис. 2).

Первичная спиртовая группа C-28 вносит наибольший вклад в обеспечение брутто-ингибирующего действия бетулина на ПОЛ, что составляет порядка 54% эффективности молекулярной структуры в целом [39].

С учетом результатов биохимического исследования крови крыс, характеризующих интенсивность процессов свободнорадикального окисления, моделируемых in vivo, можно предположить, что бетулин, являясь физиологически активным ингредиентом в составе жиросодержащего пищевого продукта - майонеза, способен подавлять процесс ПОЛ посредством прямой нейтрализации образующихся свободных радикалов.

Состояние печени оценивали полуколичественным методом. Сравнение групп проводили по следующим параметрам: дистрофия, некробиотические изменения, воспаление, сохранность балочно-радиарного строения, а также состояние сосудов печени (рис. 3).

В печени крыс интактной группы КГ-1 отсутствовали дистрофические и некробиотические изменения (рис. 3А). Гепатоциты имели нормальную форму и окраску. По ходу междольковых перегородок выявлена воспалительная инфильтрация. Морфогистохимические исследования печени крыс с токсическим гепатитом, вызванным ССl₄, из КГ-2 показали наличие мелкокапельной дистрофии в 2-3 балла, с очагами крупнокапельной (рис. 3Б). Видны выраженные некробиотические изменения, затрагивающие периферию и центр долек, а также полная декомпенсация балочно-радиарного строения и гиперемия сосудов. В печени крыс, получавших майонез с бетулином, обнаружились очаги мелкокапельной дистрофии в 1 балл без некробиотических изменений (рис. 3В); наблюдались кровоизлияния в междольковые перегородки и воспалительная инфильтрация по ходу кровоизлияний; балочно-радиарное строение прослеживалось с явлениями декомпенсации. В то же время в печени крыс, получавших майонез без добавления бетулина, из ОГ-2 в центрах долек определялись некрозы гепатоцитов с выраженной жировой дистрофией (рис. 3Г), формированием ступенчатых некрозов и признаками замещения поврежденных гепатоцитов соединительной тканью, сопровождающейся центролобулярными кровоизлияниями.

Заключение

Согласно полученным экспериментальным данным введенный в состав майонеза бетулин тормозит развитие синдрома цитолиза при токсическом гепатите и подавляет процессы перекисного окисления за счет взаимодействия с АФК и нейтрализации свободных радикалов.

На основании биохимических исследований плазмы крови крыс установлено, что пероральное введение животным майонеза с бетулином в дозе 1 мл (что соответствует 1 мг бетулина на 1 кг массы тела животного) в течение 21 сут снижает развитие цитолитического синдрома на модели острого токсического гепатита, инициированного ССl₄, на что указывает значительное снижение активности ферментов АСТ и ЩФ в крови животных ОГ-1 по сравнению с биохимическими показателями крови крыс ОГ-2 и нормализация концентрации глюкозы по сравнению с показателями плазмы крови КГ-2. Нормализующее влияние бетулина отмечено в изменении концентрации билирубина и триглицеридов, что свидетельствует об уменьшении показателей холестатического синдрома в экспериментальной группе животных ОГ-1 в сравнении с ОГ-2.

Показано, что пероральное введение животным майонеза с бетулином сопровождалось подавлением окислительного стресса, о чем свидетельствует значимое (р≤0,05) снижение ОПА и образование ТБРП по сравнению с крысами КГ-2 и ОГ-2.

По результатам морфогистохимического исследования печени крыс можно сделать вывод, что в гистопрепаратах печени животных, получавших майонез с бетулином, некробиотические изменения менее выражены в сравнении с показателями крыс ОГ-2 и оцениваются в 1 балл: обнаружены очаги мелкокапельной дистрофии, кровоизлияния в междольковые перегородки с воспалительной инфильтрацией по ходу кровоизлияний.

Таким образом, жиросодержащие пищевые продукты с бетулином в составе, адекватные нормы потребления которого (40-80 мг/сут) внесены в "Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) Таможенного союза ЕврАзЭС для биологически активных веществ" (Приложение 5), могут быть рекомендованы к клиническому изучению в качестве специализированных продуктов при острых и хронических заболеваниях печени, в том числе осложненных холестазом.

Литература

1. Schenk A., Ghallab A., Hofmann U., Hassan R., Schwarz M., Schuppert A. et al. Physiologically-based modelling in mice suggests an aggravated loss of clearance capacity after toxic liver damage // Sci. Rep. 2017. Vol. 7, N 1. P. 6224. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-04574-z

2. Балукова Е.В., Успенский Ю.П., Фоминых Ю.А. Поражения печени различного генеза (токсического, лекарственного, дисметаболического): от этиологической гетерогенности к единой унифицированной терапии пациентов // РМЖ. Медицинское обозрение. 2018. Т. 2, № 1-1. С. 35-40.

3. Губергриц Н.Б., Беляева Н.В., Клочков А.Е., Лукашевич Г.М., Фоменко П.Г. Лекарственные поражения печени: от патогенеза к лечению // Вестник клуба панкреатологов. 2020. Т. 1, № 46. С. 72-80. DOI: https://doi.org/10.33149/vkp.2020.01.10

4. Губергриц Н.Б., Беляева Н.В., Клочков А.Е., Лукашевич Г.М., Фоменко П.Г. Современные представления о питании и физической активности в лечении неалкогольной жировой болезни печени // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018. № 2. С. 100-109.

5. Сасунова А.Н., Морозов С.В., Соболев Р.В., Исаков В.А., Кочеткова А.А., Воробьева И.С. Оценка эффективности использования специализированного пищевого продукта в составе диетотерапии пациентов с неалкогольным стеатогепатитом // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 2. С. 31-42. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-2-31-42

6. Официальный сайт. Все масла мира. URL: https://www.oilworld.ru/analytics/localmarket/334695 (дата обращения 05.03.2023).

7. Лабецкий В.В., Феофилактова О.В. Исследование реологических параметров эмульсионных соусов // Пищевая промышленность: наука и технологии. 2022. Т. 15, № 3. С. 86-89. DOI: https://doi.org/10.47612/2073-4794-2022-15-3(57)-86-89

8. Воробьева В.М., Воробьева И.С., Морозов С.В., Сасунова А.Н., Кочеткова А.А., Исаков В.А. Специализированные пищевые продукты для диетической коррекции рациона больных с неалкогольным стеатогепатитом // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 2. С. 100-109. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-2-100-109

9. Morisco F., Vitaglione P., Amoruso D., Russo B., Fogliano V., Caporaso N. Foods and liver health // Mol. Aspects Med. 2008. Vol. 29, N 1-2. P. 144-150. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mam.2007.09.003

10. Ma C., Wang C., Zhang Y., Zhou H., Li Y. Potential natural compounds for the prevention and treatment of nonalcoholic fatty liver disease: a review on molecular mechanisms // Curr. Mol. Pharmacol. 2022. Vol. 15, N 6. P. 846-861. DOI: https://doi.org/10.2174/1874467215666211217120448

11. Cerletti C., Colucci M., Storto M., Semeraro F., Ammollo C.T., Incampo F. et al. Randomised trial of chronic supplementation with a nutraceutical mixture in subjects with non-alcoholic fatty liver disease // Br. J. Nutr. 2020. Vol. 123, N 2. P. 190-197. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114519002484

12. Иноземцев П.О., Федорова Л.И., Лепехова С.А. Современные методы коррекции и профилактики печеночной недостаточности // Эффективная фармакотерапия. 2020. Т. 16, № 1. С. 46-51. DOI: https://doi.org/10.33978/2307-3586-2020-16-1-46-51

13. Chan C.-C., Lee K.-C., Huang Y.-H., Chou C.K., Lin H.C., Lee F.Y. Regulation by resveratrol of the cellular factors mediating liver damage and regeneration after acute toxic liver injury // J. Gastroenterol. Hepatol. 2014. Vol. 29, N 3. P. 603-613. DOI: https://doi.org/10.1111/jgh.12366

14. García-Niño W. R., Pedraza-Chaverrí J. Protective effect of curcumin against heavy metals-induced liver damage // Food Chem. Toxicol. 2014. Vol. 69. P. 182-201. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2014.04.016

15. Mirzanajafi-Zanjani M., Yousefi M., Ehsani A. Challenges and approaches for production of a healthy and functional mayonnaise sauce // Food Sci. Nutr. 2019. Vol. 7, N 8. P. 2471-2484. DOI: https://doi.org/10.1002/fsn3.1132

16. Fenoglio D., Soto M-D., Alarcon M-J., Ferrario M., Guerrero S., Matiacevich S. Active food additive based on encapsulated yerba mate (Ilex paraguariensis) extract: effect of drying methods on the oxidative stability of a real food matrix (mayonnaise) // J. Food Sci. Technol. 2021. Vol. 58. P. 1574-1584. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-020-04669-y

17. Zhang W., Jiang H., Yang J., Jin M., Du Y., Sun Q., Xu H. Safety assessment and antioxidant evaluation of betulin by LC-MS combined with free radical assays // Anal. Biochem. 2019. Vol. 587. Article ID 113460. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.113460

18. Amiri S., Dastghaib S., Ahmadi M., Mehrbod P., Khadem F., Behrouj H. et al. Betulin and its derivatives as novel compounds with different pharmacological effects // Biotechnol. Adv. 2020. Vol. 38. Article ID 107409. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.06.008

19. Boparai A., Niazi J., Bajwa N., Singh P.A. Betulin a pentacyclic triterpenoid: an hour to rethink the compound // Open Access J. Transl. Med. Res. 2017. Vol. 1, N 2. P. 53-59. DOI: https://doi.org/10.15406/oajtmr.2017.01.00012

20. Воробьева О.А., Малыгина Д.С., Грубова Е.В., Мельникова Н.Б. Производные бетулина. Биологическая активность и повышение растворимости // Химия растительного сырья. 2019. № 4. С. 407-430. DOI: https://doi.org/10.14258/jcprm.2019045419

21. Hordyjewska A., Ostapiuk A., Horecka A., Kurzepa J. Betulin and betulinic acid: Triterpenoids derivatives with a powerful biological potential // Phytochem. Rev. 2019. Vol. 18. P. 929-951. DOI: https://doi.org/10.1007/s11101-019-09623-1

22. Ноотропное средство: пат. 2300389C1 Рос. Федерация. № 2005138574/15 / Ковалев Г.И., Салимов Р.М., Балакшин В.В., Чистяков А.Н.; заявл. 12.12.2005; опубл. 10.06.2007, Бюл. № 16. 17 с.

23. Средство для профилактики и лечения болезни Паркинсона: пат. 2324492C1 Рос. Федерация. № 2006142767/15 / Ковалев Г.И., Абаимов Д.А., Фирстова Ю.Ю., Балакшин В.В., Чистяков А.Н.; заявл. 04.12.2006; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14. 27 с.

24. Rastogi S., Pandey M.M., Kumar Singh Rawat A. Medicinal plants of the genus Betula - traditional uses and a phytochemical-pharmacological review // J. Ethnopharmacol. 2015. Vol. 159. P. 62-83. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jep.2014.11.010

25. Chen H., Xiao H., Pang J. Parameter optimization and potential bioactivity evaluation of a betulin extract from white birch bark // Plants. 2020. Vol. 9, N 3. P. 392-407. DOI: https://doi.org/10.3390/plants9030392

26. Шапекова Н.Л., Аймаков О.А., Сафаров Р.З., Алманов Г.А. Биоактивность бетулина, бетулинового альдегида и их производных // Материалы научно-практической конференции "Global Science and Innovations IV". София, 31 октября 2018. С. 122-131.

27. Furtado J.C., Pirson N., Edelberg L., Miranda H.M., Loira-Pastoriza L., Preat C. Pentacyclic triterpene bioavailability: an overview of in vitro and in vivo studies // Molecules. 2017. Vol. 22, N 3. P. 400. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules22030400

28. Способ получения бетулина: пат. 2640587C1 Рос. Федерация. № 2017104346 / Аверьянова Е.В., Школьникова М.Н., Цыганок С.Н., Хмелев В.Н., Шакура В.А.; заявл. 09.02.2017; опубл. 10.01.2018, Бюл. № 1. 10 с.

29. Кузнецова С.А., Скворцова Г.П., Маляр Ю.Н., Скурыдина Е.С., Веселова О.Ф. Выделение бетулина из бересты березы и изучение его физико-химических и фармакологических свойств // Химия растительного сырья. 2013. № 2. С. 93-100. DOI: https://doi.org/10.14258/jcprm.201302093

30. Аверьянова Е.В., Школьникова М.Н., Чугунова О.В. Исследование антиоксидантных свойств тритерпеноидов в составе жиросодержащих продуктов // Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52, № 2. С. 233-243. DOI: https://doi.org/10.21603/2074-9414-2022-2-2358

31. Скуратов А.Г. Тетрахлорметановая модель гепатита и цирроза печени у крыс // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2012. № 9. С. 37-40.

32. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. 2-е изд. Москва : Медицина, 2005. 832 с. ISBN: 5-225-04219-8.

33. Макарова М.А., Баранова И.А. Основные гепатологические синдромы в практике врача-интерниста // Consilium Medicum. 2017. Т. 19, № 8. С. 69-74. DOI: https://doi.org/10.26442/2075-1753_19.8.69-74

34. Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Жариков А.Ю., Талалаева О.С. Методы доклинического (экспериментального) исследования влияния лекарственных средств на функцию почек. Новосибирск : ГЕО, 2013. 82 с. ISBN 978-5-906284-12-9.

35. Фролов Б.А., Калинина О.В., Кириллова А.В., Штиль А.А. Преодоление гепатотоксичности метотрексата: роль тритерпеноидов // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2013. Т. 6, № 1. С. 1-10.

36. Воробьева О.А., Малыгина Д.С., Соловьева А.Г., Беляева К.Л., Грубова Е.В., Мельникова Н.Б. Антиоксидантные и прооксидантные свойства производных бетулина // Биорадикалы и антиоксиданты. 2018. Т. 5, № 4. С 9-20.

37. Воронова О.А., Плотников Е.В., Калиева С.С., Нурпейис Е.Е., Мамаева Е.А., Ташенов А.К. и др. Исследование антиоксидантной активности представителей тритерпеноидов лупанового и олеанового ряда методом вольтамперометрии // Вестник Карагандинского университета. Серия: Химия. 2017. № 3 (87). С. 31-37.

38. Яковлева М.П., Медведева Н.И., Саитов К.М., Ишмуратов Г.Ю. Химическое поведение производных бетулина в реакциях с органическими надкислотами // Вестник Башкирского университета. 2022. Т. 27, № 2. С. 323-329. DOI: https://doi.org/10.33184/bulletin-bsu-2022.2.12

39. Цымбал И.Н. Закономерности антиоксидантного действия природных и синтетических тритерпеноидов ряда лупана и β-амирина. Тюмень : ТюмГНГУ, 2004. 24 с.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)