Сладкий белок браззеин как перспективный подсластитель

• Маркова Екатерина Валерьевна
• Леонова Елена Ивановна
• Сопова Юлия Викторовна

Резюме

Неумеренное употребление сахаросодержащих продуктов способствует развитию целого ряда заболеваний, включая ожирение, сахарный диабет и пр. В качестве замены сахара чаще всего используются подсластители. Сладкие белки, в частности браззеин, - это альтернатива синтетическим подсластителям, которая имеет природное происхождение, расщепляется в кишечнике вместе с белками пищи и не влияет на уровни глюкозы и инсулина в крови.

Цель обзора - проанализировать имеющиеся данные относительно сладкого белка браззеина, его физико-химических свойств, существующих биотехнологических способов получения и перспектив применения в пищевой промышленности для дальнейшего создания оптимизированной гетерологичной системы экспрессии.

Материал и методы. Для сбора и анализа информации были использованы базы данных Google Scholar, Scopus, Web of Science, PubMed, РИНЦ, eLibrary.Ru. Глубина поиска - 30 лет.

Результаты. Многочисленные исследования физико-химических свойств браззеина продемонстрировали его высокий потенциал для использования в пищевой промышленности. В частности, короткая аминокислотная последовательность, термостабильность, способность сохранять свою структуру и сладкие свойства в широком диапазоне pH, гипоаллергенность, отсутствие генотоксичности и высокий уровень сладости по сравнению с сахарозой позволяют сделать вывод о перспективности его использования. Были получены мутантные варианты браззеина, самый сладкий из которых (с 3 аминокислотными заменами H31R/E36D/E41A) превосходит уровень сладости сахарозы в 22 500 раз. На сегодняшний день уже разработаны различные системы экспрессии рекомбинантного браззеина, в качестве продуцентов в которых использовали бактерии (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis), дрожжи (Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae), растения (Zea mays, Oryza sativa, Lactuca sativa, Nicotiana tabacum, Daucus carota) и животных (Mus musculus).

Заключение. Благодаря своей высокой сладости, органолептическим свойствам и длительной истории потребления человеком, браззеин можно рассматривать как многообещающий натуральный подсластитель. Несмотря на короткую пептидную последовательность, производство рекомбинантного белка столкнулось с рядом проблем, включая низкий выход белка (например, в молоке мышей его можно было обнаружить только с помощью вестерн-блот гибридизации) и потерю сладости. Таким образом, для широкого использования в пищевой промышленности необходима дальнейшая оптимизация процесса, включающая в себя выбор адекватного продуцента и использование систем внеклеточной экспрессии для снижения конечной стоимости продукта.

Ключевые слова:подсластители; браззеин; сладкие белки; рецепторы сладкого вкуса; экспрессия браззеина; мутантные варианты браззеина

В ходе эволюции у наших предков сформировалась способность ощущать сладкий вкус, а также получать удовольствие от его восприятия. Предполагается, что такая реакция обусловлена наличием легкоусвояемых моно- и дисахаридов, таких как глюкоза, в сладких продуктах, которые представляли собой выгодные энергоемкие источники питания, а возможность их эффективно обнаруживать за счет вкусового анализатора имела эволюционное значение для выживания вида [1].

В современном мире большинство людей без труда могут ежедневно обеспечивать себя достаточным количеством энергии. Однако в силу того, что предпочтение сладкого вкуса присутствует уже у новорожденных [2] и обусловлено активацией путей вознаграждения в мозге [3-5], оно может привести к аддиктивному поведению [3]. В частности, из-за чрезмерного потребления сладких продуктов в XXI в. во множестве стран мира как никогда актуальна проблема избыточной массы тела и ожирения среди всех возрастных групп населения [6]. По данным ВОЗ, на 2016 г. более 1,9 млрд людей старше 18 лет (39% популяции) имели избыточную массу тела (индекс массы тела ≥25 кг/м²). Из этого числа более 650 млн имели ожирение (индекс массы тела ≥30 кг/м²), что составило 13% от общего числа взрослых людей в мире. В России, по данным ВОЗ, на 2016 г. ожирение было диагностировано у 23,1% совершеннолетнего населения [7]. Помимо риска увеличения массы тела, избыточное или даже умеренное употребление сахаросодержащих пищевых продуктов может повлечь за собой ряд других патологий, среди которых сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, онкологические заболевания (ассоциированные с ожирением), кариес, а также когнитивные нарушения и эмоциональные расстройства [8]. Вопросы об изменении потребления сахара также активно обсуждаются в научном сообществе [9]. Для решения такой важной проблемы разрабатываются различные программы, в частности сфокусированные на устранении психологических аспектов чрезмерного потребления сахара [10] либо предлагающие увеличить потребление сахарозаменителей [11]. По причинам, изложенным выше, в наше время очень актуальны исследования веществ с пониженной калорийностью и сладким вкусом.

Рецепторы сладкого вкуса и их лиганды

Рецепторы сладкого вкуса, расположенные во вкусовых сосочках на языке, представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из вкусового рецептора 1 типа 2 подтипа (T1R2) и вкусового рецептора 1 типа 3 подтипа (T1R3), которые формируют гетеродимеры T1R2-T1R3 [12]. Эти рецепторы принадлежат к классу С семейства рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCR), и могут осуществлять передачу сигнала не только при связывании моно- и дисахаридов (глюкоза, сахароза, фруктоза), но и различных природных и синтетических сахарозаменителей и подсластителей за счет множественных сайтов связывания рецептора с лигандами [13].

Каждая субъединица рецепторов, входящих в состав гетеродимера, состоит из 3 основных структурных доменов. Внеклеточный лиганд-связывающий домен (домен "венериной мухоловки" - Venus flytrap module, VFTM) состоит из 2 долей, которые могут быть в открытой или закрытой конформации. В закрытой конформации между нижней частью доли 1 и вершиной доли 2 каждого домена VFTM образуется полость для связывания лиганда. Было высказано предположение, что в субъединице T1R2 эта полость является ортостерическим сайтом связывания природных сахаров и сайтом связывания дипептидных искусственных подсластителей, таких как аспартам и неотам (рис. 1). Домен, богатый цистеином (cysteine rich domain, CRD), содержит 9 консервативных цистеиновых остатков и выполняет роль линкера между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом TMD, состоящим из 7 a-спиралей. Активация рецептора после связывания лиганда запускает сигнальный каскад через G-белки, что приводит к высвобождению внутриклеточных ионов Ca²⁺, деполяризации мембраны клетки, экзоцитозу аденозинтрифосфата и активации пуринергических рецепторов на афферентных волокнах [14-17]. На основании знаний о строении рецептора сладкого вкуса был сконструирован биоэлектронный сенсор сладкого, успешно детектирующий микроколичества сладкого в образцах [18].

Характеристика сладкого белка браззеина

История промышленного применения подсластителей восходит к 1878 г., когда Константин Фальберг синтезировал очень сладкое вещество (примерно в 300 раз слаще сахарозы), орто-сульфобензойную кислоту, которое стало первым синтетическим подсластителем и получило торговое название "сахарин" [19]. Впоследствии в течение XX-XXI вв. были синтезированы и открыты другие подсластители, среди которых особое место заняли сладкие белки: неокулин, миракулин, браззеин, тауматин, мабинлин, монеллин и пентадин [20]. Уровень сладости перечисленных белков хоть и может немного отличаться в зависимости от качества воды, в которой их растворяют [21], но в среднем на 2-3 порядка слаще сахарозы, что делает их употребление в пищу особенно привлекательным для лиц, страдающих ожирением и сахарным диабетом 1 и 2 типа, поскольку было показано, что данные подсластители в экспериментах на мышах не оказывают влияния на уровень глюкозы и инсулина в крови, а также на возникновение воспаления в жировой ткани [22]. Браззеин является самым маленьким из сладких белков, однако его физико-химические свойства делают этот белок крайне перспективным для промышленного производства и употребления. Он был выделен из мякоти плодов растения Pentadiplandra brazzeana в 1994 г., а затем была определена его аминокислотная последовательность [23]. Оказалось, что выделенный из зрелых фруктов белок представляет собой совокупность из 2 форм, различающихся по наличию остатка пироглутамата на N-конце: pyrE-brazzein (80% выделенного браззеина, основная форма) и des-pyrE-brazzein (20% выделенного браззеина, побочная форма, лишенная остатка пироглутамата). Браззеин состоит из 54 аминокислотных остатков, а его молекулярная масса составляет 6473 Да. Трехмерная структура, полученная методом рентгеноструктурного анализа, и аминокислотная последовательность браззеина приведены на рис. 2.

Кристаллическая структура браззеина содержит следующие элементы вторичной структуры: 2 α-спирали (аминокислотные остатки 13-17, 21-30) и 3 β-цепи (аминокислотные остатки 4-6; 34-39; 45-50), которые образуют антипараллельный β-лист [24]. Следует отметить, что структура молекулы браззеина в растворе, полученная методом ядерного магнитного резонанса, отличается от кристаллической отсутствием первой α-спирали [24]. 8 цистеиновых остатков образуют 4 внутримолекулярных дисульфидных связи: Cys4-Cys52, Cys16-Cys37, Cys22-Cys47 и Cys26-Cys49; что обеспечивает стабилизацию вторичной структуры [25]. Браззеин хорошо растворим в воде (50 мг/см³, или >7 мМ), а также обладает высокими показателями термоустойчивости: было продемонстрировано сохранение им сладкого вкуса при нагревании до 80 ^oC в течение 4 ч в широком диапазоне значений pH - от 2 до 8 [23]. Официальных данных о возможности безопасного применения браззеина в питании человека в настоящее время нет. Однако в пользу использования браззеина в пищевой промышленности свидетельствуют результаты тестов на отсутствие аллергенности и генотоксичности, в которых было показано, что рекомбинантный браззеин является безопасным для употребления в составе рационов питания [26].

Браззеин примерно в 2000 раз слаще сахарозы на весовой основе и в 9500 раз слаще сахарозы на молярной основе [23, 27]. На настоящий момент в экспериментах по сайт-направленному мутагенезу показано, что ключевую роль во взаимодействии с рецепторами сладкого вкуса на поверхности молекулы браззеина играют следующие 3 сайта полипептидной цепи:

1) петля, сформированная Arg43;

2) N- и C-концевые остатки, Glu36 и петля, сформированная Arg33;

3) петля 9-19.

Однако точный механизм активации браззеином рецептора до конца не установлен. Предполагается, что он взаимодействует с доменом VFTM T1R2 и CRD T1R3 [14, 28] (см. рис. 1), что приводит к изменению конформации рецептора, активации внутриклеточных G-белков и дальнейшей передаче сигнала через фосфолипазный путь [19]. Поскольку аминокислотные остатки, необходимые для восприятия сладости браззеина, распределены по всей поверхности белка, что подтверждают мутантные варианты белка, приведенные ниже, была предложена модель, согласно которой водородные связи внутри молекулы браззеина определяют формирование на поверхности молекулы так называемых белковых секторов, взаимодействующих с рецептором сладкого вкуса [29, 30].

Наряду со связыванием с рецептором сладкого вкуса для браззеина недавно была показана возможность связывания с Toll-подобным рецептором 5 (TLR5), относящимся к паттерн-распознающим рецепторам (PRRs, pattern recognition receptors) [31].

Мутантные варианты браззеина

С момента выделения браззеина и определения его аминокислотной последовательности были получены различные аминокислотные замены в этом белке для повышения уровня сладости. Сведения о мутантных вариантах браззеина и влиянии внесенных мутаций на уровень сладости представлены в табл. 1. На основе этих данных можно отметить, что мутации, которые нарушают формирование дисульфидных связей, приводят к потере сладкого вкуса. Самые сладкие формы браззеина были получены благодаря мутациям, внесенным в 3 сайтах взаимодействия с рецептором сладкого вкуса, приведенных выше. Кроме того, существенную роль во взаимодействии браззеина с T1R2-T1R3, по-видимому, играет аминокислотный остаток E53, который также существенным образом повлиял на сладость браззеина в одном из исследований. На настоящий момент самым сладким из всех полученных мутантных вариантов браззеина является вариант с 3 аминокислотными заменами H31R/E36D/E41A, уровень сладости которого на весовой основе превосходит уровень сладости сахарозы в 22 500 раз и в 18 раз превосходит уровень сладости браззеина дикого типа [32].

Гетерологичные системы экспрессии браззеина

Поскольку процесс выделения браззеина из природного источника имеет ряд существенных недостатков, одним из которых является низкий выход продукта (содержание белка в плодах Pentadiplandra brazzeana составляет примерно 0,2% [22]), с целью потенциальной дальнейшей коммерциализации и понижения затрат на производство были разработаны различные варианты получения браззеина с использованием гетерологичных экспрессионных систем (на основе растений, животных, бактерий и дрожжей), а также путем пептидного синтеза [40].

Первая бактериальная рекомбинантная система экспрессии браззеина (pyrEdel) была создана с использованием Escherichia coli в 2000 г. Сладость белка была сопоставима с побочной формой браззеина (pyrEdel), выделенной из природного источника, однако суммарный выход белка был довольно низким, поскольку значительная фракция браззеина была нерастворима и требовала нескольких стадий очистки [27]. В следующем исследовании экспрессия браззеина производилась в бактериях E. coli и Lactococcus lactis. В системе E. сoli сладость выделенного белка была существенно ниже по сравнению с природным браззеином. В системе L. lactis уровень сладости белка был также снижен по сравнению с природным аналогом, а также в обеих экспрессионных системах выход белка был довольно низким, причем оптимизация кодонов последовательности синтетического гена браззеина для L. lactis привела к большему снижению выхода продукта [41]. В дальнейшем экспрессионная система на основе L. lactis была оптимизирована, что привело к увеличению выхода браззеина в 17 раз [42]. Оптимизация экспрессионной системы E. coli также привела к увеличению выхода белка, однако он не превышал 9 мг/л [43]. Также были созданы рекомбинантные системы экспрессии браззеина в таких растениях, как кукуруза, рис, салат и табак [44-47]. В семенах кукурузы был достигнут крайне высокий выход белка, составивший 400 мкг/г [44]. В ряде исследований одного коллектива браззеин экспрессировали в культуре клеток каллуса трансгенной моркови в эрлифтном биореакторе-ферментере [48, 49]. Система экспрессии предусматривала введение гена браззеина путем агробактериальной трансформации и обработку культивируемых клеток абсцизовой кислотой. В ходе этого исследования удалось получить выход браззеина 0,67 мкг/г сырой массы. Помимо этого, были созданы трансгенные мыши, у которых экспрессия браззеина происходила в молочных железах [50]. Один из самых сладких мутантных вариантов браззеина pyrEdel/H31R/E36D/E41A также был экспрессирован в молочных железах мышей, в этом исследовании было продемонстрировано, что уровень сладости полученного белка превышал уровень сладости природного аналога в 10 000 раз [39].

Дрожжевые системы продукции браззеина были созданы с использованием таких видов дрожжей, как Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris), Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae. Первые попытки рекомбинантной экспрессии браззеина в дрожжах (S. cerevisiae) были предприняты в 1995 г. Браззеин, слитый с глутатион-S-трансферазой, экспрессировался внутриклеточно, идентичность экспрессируемого белка была подтверждена с помощью антител, однако выделенный рекомбинантный браззеин в дальнейшем не был охарактеризован [51]. В 2012 г. была разработана система экспрессии браззеина в метилотрофных дрожжах K. phaffii [52]. В этой системе рекомбинантный браззеин эффективно секретировался в минимальную среду за счет использования сигнальной последовательности гена α-фактора S. cerevisiae под контролем индуцируемого метанолом промотора алкогольоксидазы. В данном исследовании экспрессировались 3 формы браззеина: pyrE и pyrEdel, а также Q1pyrE. За период секреции 6 дней клетки P. pastoris секретировали примерно 90, 30 и 90 мг/л браззеина pyrE, Q1pyrE, pyrEdel соответственно. Масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса показали, что рекомбинантные формы браззеина имеют идентичную природным белкам конформацию. Органолептические исследования подтвердили, что рекомбинантный браззеин обладает вкусовыми свойствами, сходными со свойствами 2 природных форм браззеина. Браззеин (pyrEdel) также экспрессировали с помощью дрожжей K. lactis [53]. Браззеин из дрожжевых клеток в культуральную среду экспортировался также за счет сигнальной последовательности гена α-фактора S. cerevisiae. Через 96 ч количество очищенного рекомбинантного браззеина составляло примерно 104 мг/л культуры. Секвенирование N-концевых аминокислот секретируемого браззеина подтвердило идентичность очищенного белка и правильное расщепление сигнального пептида. Нативное конформационное состояние рекомбинантного браззеина было подтверждено при помощи метода спектроскопии кругового дихроизма. Органолептический анализ выявил, что сладость очищенного браззеина, продуцируемого дрожжами K. lactis, была идентична природному браззеину (в 2130 раз слаще сахарозы на весовой основе). В дальнейшем исследователям удалось вдвое повысить уровень экспрессии браззеина в системе K. lactis за счет индукции сверхэкспрессии протеиндисульфидизомеразы и белка Ero1p, необходимых для правильного формирования дисульфидных связей в браззеине [54]. В 2020 г. были проведены новые исследования с использованием S. cerevisiae для гетерологичной экспрессии браззеина (pyrEdel) под контролем промотора GPD [55]. Выход очищенного белка был низким по сравнению с другими дрожжевыми экспрессионными системами, примерно 10 мг/л, что свидетельствует о низкой эффективности систем внутриклеточной экспрессии. Интересным вариантом является удачный пример синтеза браззеина в бесклеточной системе [56], однако масштабируемость данного эксперимента вызывает сомнения. Сведения о гетерологичных системах экспрессии браззеина обобщены в табл. 2.

Обобщая содержание данного раздела, можно сказать, что каждая из гетерологичных систем экспрессии наряду со своими достоинствами обладает существенными недостатками. Так, экспрессия в бактериях обнаружила понижение сладости и низкий выход белка. Экспрессия в клетках молочной железы мышей - низкий выход белка. Экспрессия в семенах кукурузы - высокий выход белка, но сложный и многоэтапный процесс очистки. Дрожжевые системы на основе K. phaffii и K. lactis демонстрировали высокий выход белка, но требовали очень тщательной очистки. Дрожжевая система с продуцентом S. cerevisiae и внутриклеточной экспрессией также показала относительно низкий выход белка.

Заключение

Среди многих подсластителей, которые сводят к минимуму потребление сахара, многообещающей является группа сладких белков. Браззеин - самый маленький из сладких белков (54 аминокислотных остатка, 6473 Да), он привлекателен для лиц с ожирением и сахарным диабетом, поскольку не влияет на уровень глюкозы и инсулина в крови. Браззеин обладает высокой термостабильностью в широком диапазоне рН и является безопасным для употребления в составе рациона питания, хотя официальные данные о безопасности данного вещества в настоящее время отсутствуют. Для повышения уровня сладости браззеина путем сайт-направленного мутагенеза были созданы мутантные варианты этого белка, самым сладким из них является тройной мутант H31R/E36D/E41A, который в 22 500 раз слаще сахарозы. Поскольку содержание браззеина в плодах природного источника (Pentadiplandra brazzeana) крайне низкое (0,2%), были разработаны различные способы получения браззеина с использованием гетерологичных экспрессионных систем, в качестве продуцентов которых использовались: бактерии (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis), дрожжи (Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae), растения (Zea mays, Oryza sativa, Lactuca sativa, Nicotiana tabacum, Daucus carota) и животные (Mus musculus). Несмотря на короткую пептидную последовательность, производство рекомбинантного белка столкнулось с рядом проблем, включая низкий выход белка (например, в молоке мышей его можно было обнаружить только с помощью вестерн-блоттинга) и потерю сладости. Таким образом, для широкого использования в пищевой промышленности необходима дальнейшая оптимизация процесса, включающая выбор адекватного продуцента и использование систем внеклеточной экспрессии для снижения конечной стоимости продукта.

Литература

1. Beauchamp G.K. Why do we like sweet taste: a bitter tale? // Physiol. Behav. 2016. Vol. 164. P. 432-437. DOI: https://doi.org/10.1016/J.PHYSBEH.2016.05.007

2. Beauchamp G.K., Mennella J.A. Flavor perception in human infants: development and functional significance // Digestion. 2011. Vol. 83, suppl. 1. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1159/000323397

3. Kendig M.D. Cognitive and behavioural effects of sugar consumption in rodents. A review // Appetite. 2014. Vol. 80. P. 41-54. DOI: https://doi.org/10.1016/j.appet.2014.04.028

4. Han P., Bagenna B., Fu M. The sweet taste signalling pathways in the oral cavity and the gastrointestinal tract affect human appetite and food intake: a review // Int. J. Food Sci. Nutr. 2019. Vol. 70, N 2. P. 125-135. DOI: https://doi.org/10.1080/09637486.2018.1492522

5. Gutierrez R., Fonseca E., Simon S.A. The neuroscience of sugars in taste, gut-reward, feeding circuits, and obesity // Cell. Mol. Life Sci. 2020. Vol. 77, N 18. P. 3469-3502. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-020-03458-2

6. Stanhope K.L. Sugar consumption, metabolic disease and obesity: the state of the controversy // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2016. Vol. 53, N 1. P. 52-67. DOI: https://doi.org/10.3109/10408363.2015.1084990

7. Kholmatova K., Krettek A., Leon D.A., Malyutina S., Cook S., Hopstock L.A. et al. Obesity prevalence and associated socio-demographic characteristics and health behaviors in Russia and Norway // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2022. Vol. 19, N 15. P. 9428. DOI: https://doi.org/10.3390/ijerph19159428

8. Jacques A., Chaaya N., Beecher K., Ali S.A., Belmer A., Bartlett S. The impact of sugar consumption on stress driven, emotional and addictive behaviors // Neurosci. Biobehav. Rev. 2019. Vol. 103. P. 178-199. DOI: https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2019.05.021

9. Yan R.R., Chan C.B., Louie J.C.Y. Current WHO recommendation to reduce free sugar intake from all sources to below 10% of daily energy intake for supporting overall health is not well supported by available evidence // Am. J. Clin. Nutr. 2022. Vol. 116, N 1. P. 15-39. DOI: https://doi.org/10.1093/ajcn/nqac084

10. Joveini H., Sharifi N., Meymary B.K., Mehri A., Shahrabadi R., Rahmanian V. et al. The effect of empowerment program to reduce sugar consumption based on the multi-theory model on body mass index and abdominal obesity in Iranian women // BMC Womens Health. 2023. Vol. 23, N 1. P. 207. DOI: https://doi.org/10.1186/s12905-023-02361-9

11. Warshaw H., Edelman S.V. Practical strategies to help reduce added sugars consumption to support glycemic and weight management goals // Clin. Diabetes. 2021. Vol. 39, N 1. P. 45-56. DOI: https://doi.org/10.2337/cd20-0034

12. Temussi P.A. Sweet, bitter and umami receptors: a complex relationship // Trends Biochem. Sci. 2009. Vol. 34, N 6. P. 296-302. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tibs.2009.02.005

13. Jiang P., Cui M., Zhao B., Snyder L.A., Benard L.M., Osman R. et al. Identification of the cyclamate interaction site within the transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3 // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, N 40. P. 34 296-34 305. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M505255200

14. Assadi-Porter F.M., Maillet E.L., Radek J.T., Quijada J., Markley J.L., Max M. Key amino acid residues involved in multi-point binding interactions between brazzein, a sweet protein, and the T1R2-T1R3 human sweet receptor // J. Mol. Biol. 2010. Vol. 398, N 4. P. 584-599. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmb.2010.03.017

15. Nango E., Akiyama S., Maki-Yonekura S., Ashikawa Y., Kusakabe Y., Krayukhina E. et al. Taste substance binding elicits conformational change of taste receptor T1r heterodimer extracellular domains // Sci. Rep. 2016. Vol. 6, N 1. Article ID 25745. DOI: https://doi.org/10.1038/srep25745

16. Ahmad R., Dalziel J.E. G protein-coupled receptors in taste physiology and pharmacology // Front. Pharmacol. 2020. Vol. 11. Article ID 587664. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2020.587664

17. Dutta Banik D., Martin L.E., Freichel M., Torregrossa A.M., Medler K.F. TRPM4 and TRPM5 are both required for normal signaling in taste receptor cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018. Vol. 115, N 4. P. E772-E781. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1718802115

18. Jeong J.-Y., Cha Y.K., Ahn S.R., Shin J., Choi Y., Park T.H. et al. Ultrasensitive bioelectronic tongue based on the Venus Flytrap Domain of a human sweet taste receptor // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2022. Vol. 14, N 2. P. 2478-2487. DOI: https://doi.org/10.1021/acsami.1c17349

19. Mahmood A.A.R., Al-Juboori S.B. A review: saccharin discovery, synthesis, and applications // Ibn AL-Haitham J. Pure Appl. Sci. 2020. Vol. 33, N 2. P. 43-61. DOI: https://doi.org/10.30526/33.2.2442

20. Yusuf E.H. An overview of biotransformation for the sustainability of sweet-tasting proteins as natural sugar replacers // Chem. Proc. 2022. Vol. 8, N 1. P. 85. DOI: https://doi.org/10.3390/ecsoc-25-11640

21. Delfi M., Emendato A., Temussi P.A., Picone D. Striking dependence of protein sweetness on water quality: the role of the ionic strength // Front. Mol. Biosci. 2021. Vol. 8. Article ID 705102. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.705102

22. Kim H., Kang J., Hong S., Jo S., Noh H., Kang B.H. et al. 3M-brazzein as a natural sugar substitute attenuates obesity, metabolic disorder, and inflammation // J. Agric. Food Chem. 2020. Vol. 68, N 7. P. 2183-2192. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00317

23. Bilal M., Ji L., Xu S., Zhang Y., Iqbal H.M.N., Cheng H. Bioprospecting and biotechnological insights into sweet-tasting proteins by microbial hosts - a review // Bioengineered. 2022. Vol. 13, N 4. P. 9815-9828. DOI: https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2061147

24. Nagata K., Hongo N., Kameda Y., Yamamura A., Sasaki H., Lee W.C. et al. The structure of brazzein, a sweet-tasting protein from the wild African plant Pentadiplandra brazzeana // Acta Cryst. 2013. Vol. 69, N 4. P. 642-647. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444913001005

25. Kohmura M., Ota M., Izawa H., Ming D., Hellekant G., Ariyoshi Y. Assignment of the disulfide bonds in the sweet protein brazzein // Biopolymers. 1996. Vol. 38, N 4. P. 553-556. DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0282(199604)38:4%3C553::AID-BIP10%3E3.0.CO;2-B

26. Lynch B., Wang T., Vo T., Tafazoli S., Ryder J. Safety evaluation of oubli fruit sweet protein (brazzein) derived from Komagataella phaffii, intended for use as a sweetener in food and beverages // Toxicol. Res. Appl. 2023. Vol. 7. P. 1-21. DOI: https://doi.org/10.1177/23978473231151258

27. Assadi-Porter F.M., Aceti D.J, Cheng H., Markley J.L. Efficient production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 376, N 2. P. 252-258. DOI: https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1725

28. Singarapu K.K. Tonelli M., Markley J.L., Assadi-Porter F.M. Structure-function relationships of brazzein variants with altered interactions with the human sweet taste receptor // Protein Sci. 2016. Vol. 25, N 3. P. 711-719. DOI: https://doi.org/10.1002/pro.2870

29. Assadi-Porter F.M., Aceti D.J., Markley J.L. Sweetness determinant sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 376, N 2. P. 259-265. DOI: https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1726

30. Zhao X., Wang C., Zheng Y., Liu B. New insight into the structure-activity relationship of sweet-tasting proteins: protein sector and its role for sweet properties // Front. Nutr. 2021. Vol. 8. Article ID 691368. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2021.691368

31. Poursalim M., Shasaltaneh M.D., Jafarian V., Salehabadi H. The novel anti-cancer feature of brazzein through activating of hTLR5 by integration of biological evaluation: molecular docking and molecular dynamics simulation // Sci. Rep. 2022. Vol. 12, N 1. Article ID 21979. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26487-2

32. Lee J.W., Cha J.E., Jo H.J., Kong K.H. Multiple mutations of the critical amino acid residues for the sweetness of the sweet-tasting protein, brazzein // Food Chem. 2013. Vol. 138, N 2-3. P. 1370-1373. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.10.140

33. Jin Z. Danilova V., Assadi-Porter F.M., Markley J.L., Hellekant G. Monkey electrophysiological and human psychophysical responses to mutants of the sweet protein brazzein: delineating brazzein sweetness // Chem. Senses. 2003. Vol. 28, N 6. P. 491-498. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/28.6.491

34. Jafari S.S., Jafarian V., Khalifeh K., Ghanavatian P., Shirdel S.A. The effect of charge alteration and flexibility on the function and structural stability of sweet-tasting brazzein // RSC Advances. 2016. Vol. 6, N 64. P. 59 834-59 841. DOI: https://doi.org/10.1039/c6ra12626j

35. Yoon S.Y., Kong J.N., Jo D.H., Kong K.H. Residue mutations in the sweetness loops for the sweet-tasting protein brazzein // Food Chem. 2011. Vol. 129, N 4. P. 1327-1330. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.06.054

36. Ghanavatian P., Khalifeh K., Jafarian V. Structural features and activity of brazzein and its mutants upon substitution of a surfaced exposed alanine // Biochimie. 2016. Vol. 131. P. 20-28. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biochi.2016.09.006

37. Walters D.E. Cragin T., Jin Z., Rumbley J.N., Hellekant G. Design and evaluation of new analogs of the sweet protein brazzein // Chem. Senses. 2009. Vol. 34, N 8. P. 679-683. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/bjp048

38. Lim J.K. Jang J.C., Kong J.N., Kim M.C., Kong K.H. Importance of Glu53 in the C-terminal region of brazzein, a sweet-tasting protein // J. Sci. Food Agric. 2016. Vol. 96, N 9. P. 3202-3206. DOI: https://doi.org/10.1002/jsfa.7501

39. Lu R., Li X., Hu J., Zhang Y., Wang Y., Jin L. Expression of a triple mutational des-pGlu brazzein in transgenic mouse milk // FEBS Open Bio. 2022. Vol. 12, N 7. P. 1336-1343. DOI: https://doi.org/10.1002/2211-5463.13411

40. Ota M., Kohmura M., Ariyoshit Y. Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein // Biopolymers. 1996. Vol. 39, N 1. P. 95-101. DOI: https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0282(199607)39:1<95::aid-bip10>3.0.co;2-b

41. Berlec A., Jevnikar Z., Majhenic A.C., Rogelj I., Strukelj B. Expression of the sweet-tasting plant protein brazzein in Escherichia coli and Lactococcus lactis: a path toward sweet lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol. 73, N 1. P. 158-165. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-006-0438-y

42. Berlec A., Tompa G., Slapar N., Fonović U.P., Rogelj I., Strukelj B. Optimization of fermentation conditions for the expression of sweet-tasting protein brazzein in Lactococcus lactis // Lett. Appl. Microbiol. 2008. Vol. 46, N 2. P. 227-231. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2007.02297.x

43. Jafarian V., Bagheri K., Zarei J., Karami S., Ghanavatian P. Improved expression of recombinant sweet-tasting brazzein using codon optimization and host change as new strategies // Food Biotechnol. 2020. Vol. 34, N 1. P. 62-76. DOI: https://doi.org/10.1080/08905436.2019.1711113

44. Lamphear B.J., Barker D.K., Brooks C.A., Delaney D.E., Lane J.R., Beifuss K. et al. Expression of the sweet protein brazzein in maize for production of a new commercial sweetener // Plant Biotechnol. J. 2005. Vol. 3, N 1. P. 103-114. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2004.00105.x

45. Lee Y.R., Akter S., Lee I.H., Jung Y.J., Park S.Y., Cho Y.-G. et al. Stable expression of brazzein protein, a new type of alternative sweetener in transgenic rice // J. Plant Biotechnol. 2018. Vol. 45, N 1. P. 63-70. DOI: https://doi.org/10.5010/JPB.2018.45.1.063

46. Jung Y.J., Kang K.K. Stable expression and characterization of brazzein, thaumatin and miraculin genes related to sweet protein in transgenic lettuce // J. Plant Biotechnol. 2018. Vol. 45, N 3. P. 257-265. DOI: https://doi.org/10.5010/JPB.2018.45.3.257

47. Choi H.E., Lee J.I., Jo S.Y., Chae Y.C., Lee J.H., Sun H.J. et al. Functional expression of the sweet-tasting protein brazzein in transgenic tobacco // Food Sci. Technol. 2022. Vol. 42. Article ID e40521. DOI: https://doi.org/10.1590/fst.40521

48. Han J.E., Lee H., Ho T.-T., Park S.-Y. Brazzein protein production in transgenic carrot cells using air-lift bioreactor culture // Plant Biotechnol. Rep. 2022. Vol. 16, N 2. P. 161-171. DOI: https://doi.org/10.1007/s11816-022-00743-3

49. Han J.-E., Park Y.-J., Lee H., Jeong Y.-J., Park S.-Y. Increased brazzein expression by abiotic stress and bioreactor culture system for the production of sweet protein, brazzein // Plant Biotechnol. Rep. 2020. Vol. 14, N 4. P. 459-466. DOI: https://doi.org/10.1007/s11816-020-00625-6

50. Yan S., Song H., Pang D., Zou Q., Li L., Yan Q. et al. Expression of plant sweet protein brazzein in the milk of transgenic mice // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 10. P. 1-8. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076769

51. Neiers F., Naumer C., Krohn M., Briand L. The recent development of a sweet-tasting brazzein and its potential industrial applications // Sweeteners. Reference Series in Phytochemistry / eds J.M. Merillon, K. Ramawat. Cham : Springer, 2016. P. 1-20. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-319-26478-3_2-1 ISBN978-3-319-26478-3.

52. Poirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin T. et al. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris // J. Agric. Food Chem. 2012. Vol. 60, N 39. P. 9807-9814. DOI: https://doi.org/10.1021/jf301600m

53. Jo H.J., Noh J.S., Kong K.H. Efficient secretory expression of the sweet-tasting protein brazzein in the yeast Kluyveromyces lactis // Protein Expr. Purif. 2013. Vol. 90, N 2. P. 84-89. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2013.05.001

54. Yun C.R., Kong J.N., Chung J.H., Kim M.C., Kong K.H. Improved secretory production of the sweet-tasting protein, brazzein, in Kluyveromyces lactis // J. Agric. Food Chem. 2016. Vol. 64, N 32. P. 6312-6316. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b02446

55. Kazemi-Nasab A., Shahpiri A. Expression of brazzein, a small sweet-tasting protein in Saccharomyces cerevisiae: an introduction for production of sweet yeasts // Protein Pept. Lett. 2020. Vol. 27, N 10. P. 945-952. DOI: https://doi.org/10.2174/0929866527666200331134431

56. Казловский И.С., Бельская И.В., Зинченко А.И. Биосинтез браззеина в бактериальной системе бесклеточного синтеза белка // Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2020. Т. 64, № 1. С. 71-77. DOI: https://doi.org/10.29235/1561-8323-2020-64-1-71-77

57. Assadi-Porter F.M., Patry S., Markley J.L. Efficient and rapid protein expression and purification of small high disulfide containing sweet protein brazzein in E. coli // Protein Expr. Purif. 2008. Vol. 58, N 2. P. 263-268. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2007.11.009

58. Hung C.Y., Cheng L.H., Yeh C.M. Functional expression of recombinant sweet-tasting protein brazzein by Escherichia coli and Bacillus licheniformis // Food Biotechnol. 2019. Vol. 33, N 3. P. 251-271. DOI: https://doi.org/10.1080/08905436.2019.1618323

59. Park S.W., Kang B.H., Lee H.M., Lee S.J., Kim H.S., Choi H.W. et al. Efficient brazzein production in yeast (Kluyveromyces lactis) using a chemically defined medium // Bioprocess Biosyst. Eng. 2021. Vol. 44, N 4. P. 913-925. DOI: https://doi.org/10.1007/s00449-020-02499-y

60. Lee H.M., Park S.W., Lee S.J., Kong K.H. Optimized production and quantification of the tryptophan-deficient sweet-tasting protein brazzein in Kluyveromyces lactis // Prep. Biochem. Biotechnol. 2019. Vol. 49, N 8. P. 790-799. DOI: https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1621892

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)