Влияние пробиотического продукта, содержащего бифидобактерии и биогель из бурых водорослей, на кишечную микрофлору и показатели врожденного иммунитета у мышей с экспериментальным лекарственным дисбактериозом кишечника

РезюмеИзучено влияние нового ферментированного пробиотического продукта (ПП), содержащего штамм бифидобактерий B. bifidum 791 и биогель из бурых водорослей Laminaria japonica, на состав кишечной микрофлоры и показатели врожденного иммунитета у мышей с экспериментальным дисбактериозом, индуцированным введением в течение 7 дней гентамицина в дозе 25 мг/кг массы тела. Животные опытной группы получали ПП в течение 6 нед дополнительно к рациону, что составляло 2% от средневзвешенного объема потребления корма. Под влиянием ПП у мышей наблюдались более быстрое купирование симптомов диспепсии, восстановление массы тела и баланса микробиоты кишечника (увеличение содержания бифидо- и лактобактерий, типичной кишечной палочки, уменьшение количества бактерий родов Proteus и Clostridium, элиминация S. aureus). У мышей этой группы также выявлено статистически значимое снижение лейкоцитарного индекса интоксикации и содержания молекул средней массы, характеризующих эндогенную интоксикацию организма, и усиление показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, относящихся к клеткамэффекторам врожденного иммунитета, по сравнению с животными, не получавшими ПП. Наблюдаемые эффекты ПП обусловлены как его пробиотическими свойствами за счет содержания бифидобактерий, так и альгинатной составляющей, обеспечивающей иммуномодулирующую и энтеросорбционную активность.

Ключевые слова:пробиотические продукты, пробиотики, антибиотикассоциированный дисбактериоз, альгинат, биогель из бурых водорослей, микробиоценоз кишечника, врожденный иммунитет

Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 73-79.

Условия жизни человека при воздействии ряда негативных факторов окружающей среды способствуют развитию нарушений обмена веществ, ослаблению иммунитета, нарушению микробной экологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и развитию дисбактериозов. К важнейшим средствам профилактики дисбактериозов относят пробиотики и пребиотики, в том числе в составе продуктов функционального питания, причем наиболее эффективны в этом отношении комплексы из пробиотиков и пребиотиков - синбиотики [16, 19].

В последние годы появились публикации, посвященные экспериментальным и клиническим испытаниям биогелей из бурых водорослей, причем ряд из них свидетельствует об эффективности последних не только при лечении различных гастроэнтерологических заболеваний, но и как средств коррекции дисбактериозов [1, 9]. Альгинаты, составляющие основу биогеля, относятся к растворимым пищевым волокнам [2, 18, 21, 22, 24], обладают уникальными иммуностимулирующими свойствами [4, 8, 11], являются мощными энтеросорбентами, способными связывать и удалять из организма побочные продукты обмена веществ, соли тяжелых металлов и радионуклиды [2, 15, 18]. По данным Н.М. Амининой [1], включение в рационы биогеля из морской капусты в количестве 100 г в течение 14 дней подавляло патогенные микроорганизмы в содержимом кишечника у больных хроническими гастроэнтерологическими заболеваниями (хронический эрозивный гастрит, гастроэнтероколит, дисбактериоз), способствуя сохранению основной облигатной микрофлоры.

В работах этого и других авторов [6, 7] также показано, что биогель стимулирует рост пробиотического штамма Bifidobacterium bifidum in vitro.

Вместе с тем в настоящее время недостаточно данных о наличии у альгиновой кислоты, ламинарана, фукоидана и других полисахаридов, входящих в состав бурых водорослей, пребиотических свойств: способности селективно улучшать рост и активность определенных популяций защитной кишечной микрофлоры.

В связи с этим целью работы явилось изучение влияния пробиотического продукта (ПП), содержащего бифидобактерии и биогель из бурых водорослей, на состав кишечной микрофлоры и показатели врожденного иммунитета у мышей с экспериментальным дисбактериозом кишечника, индуцированным введением антибиотика широкого спектра действия (гентамицина).

Материал и методы

Объект исследования - ПП на основе ферментированной Bifidobacterium bifidum 791 смеси молока с биогелем "Ламиналь" из морской капусты (охлажденным, массовая доля в составе продукта составляет 20%). В состав биогеля входят альгинат натрия (71,5% на сухую массу), белок (0,52% на сухую массу) и другие компоненты (клетчатка, манит, липиды, пигменты). ПП получен по разработанной ранее технологии, включающей стадии подготовки сырья, восстановления сухого молока, стерилизации, внесения биогеля, гомогенизацию и пастеризацию, охлаждение до температуры заквашивания, заквашивание, ферментацию при 38±1 °С до рН 4,7±0,1, охлаждение до 20-25 °С, розлив, упаковку, маркировку и хранение [6]. Содержание альгината натрия в продукте составляет 0,58 г/100 г, бифидобактерий - не менее 10 9 КОЕ/г (см3).

Экспериментальные исследования выполнены на неинбредных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая", находившихся на стандартном рационе вивария в боксированных помещениях. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций Европейской конвенции по за щите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [20]. Выведение животных из опыта проводили с использованием эфирного наркоза.

У мышей 1-й группы (60 животных) воспроизводили экспериментально дисбактериоз кишечника путем внутрибрюшинного введения в течение 7 дней антибиотика широкого спектра действия (гентамицина) в дозе 25 мг/кг массы тела. Мыши 2-й группы (60 животных), у которых также индуцировали дисбактериоз кишечника, ежедневно получали дополнительно к рациону перорально ПП 2 раза в сутки по 100 мкл на прием, что составляло 2% от средневзвешенного объема потребления корма. Получение животными ПП начиналось одновременно с введением гентамицина и продолжалось в течение 6 нед. Вскрытие и обследование животных 1-й и 2-й групп проводили в динамике (через 1, 4, 6 нед). 20 животных 3-й группы (интактный контроль) содержали на стандартном рационе вивария и обследовали однократно через 1 нед.

У экспериментальных животных оценивали массу тела, общее состояние, характер стула, исследовали состав кишечного микробиоценоза, формулу крови с определением лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), определяли уровень молекул средней массы (МСМ) в крови, показатели функциональной активности клеток перитонеального экссудата.

Микробиологическое исследование фекалий животных проводили в соответствии с отраслевым стандартом ОСТ 91500.11.0004-2003 [12].

Лейкоцитарный индекс интоксикации рассчитывали по формуле Каль-Калифа. Содержание МСМ определяли по методу, описанному И.И. Жаденовым и соавт. [13], с измерением уровня оптической плотности пробы на спектрофотометре "Multiscan RC" ("Labsystems", Финляндия) при длине волны 254 нм. Фагоцитарную активность нейтрофилов перитонеального экссудата мышей оценивали по фагоцитарному показателю (ФП) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и фагоцитарному числу (ФЧ) - среднее число латексных частиц, поглощенных одним фагоцитом [14].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica7. Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения независимых выборок).

Результаты и обсуждение

При моделировании дисбактериоза у мышей 1-й группы через 12 ч после введения гентамицина проявлялись клинические симптомы заболевания, которые сохранялись в течение недели и выражались в полифекалии, изменении консистенции стула сначала в виде поноса, а затем запора, снижении аппетита и массы тела животных. Так, мыши этой группы потеряли в среднем до 2,4 г за 1-ю неделю, к концу наблюдаемого периода (через 6 нед) их масса тела постепенно восстанавливалась, составив 18,6±0,7 г.

По окончании введения гентамицина в фекалиях мышей 1-й группы наблюдалось статистически значимое снижение количества бифидобактерий, лактобактерий и энтерококков по сравнению с показателями 3-й группы (интактный контроль) (табл. 1). У животных этой группы наблюдалось появление представителя патогенной микрофлоры - Staphylococcus aureus, который в кишечнике здоровых животных отсутствовал. Также выявлено увеличение содержания условно-патогенных бактерий родов Clostridium и Proteus по сравнению с контролем (см. табл. 1). При проведении повторного обследования животных этой группы (через 4 и 6 нед после моделирования дисбактериоза) восстановления кишечной микрофлоры до нормы не выявлено (см. табл. 1).



Полученные результаты свидетельствуют о количественных и качественных нарушениях состава кишечной микрофлоры, которые проявлялись значимым уменьшением числа бифидо- и лактобактерий, а также появлением S. aureus, возрастанием содержания бактерий родов Clostridium и Proteus.

У животных 2-й группы, получавших ПП, через 12 ч после введения гентамицина также были отмечены клинические симптомы дисбактериоза, которые купировались к концу недели. Масса тела животных восстановилась через 4 нед, а затем наблюдалось ее возрастание до 21,8±0,8 г.

В результате недельного курса приема продукта у животных выявлено увеличение содержания бифидобактерий, а в последующем (через 4 и 6 нед) их содержание значительно превышало показатели у животных с модельным дисбактериозом и достигало уровня интактного контроля (см. табл. 1). Такая же тенденция отмечена в отношении лактобактерий. Кроме того, у животных этой группы к концу лечения выявлена элиминация S. aureus и отмечено снижение содержания бактерий родов Proteus и Clostridium по сравнению с их уровнем у животных 1-й группы (см. табл. 1).

При анализе формулы крови у животных 1-й группы с экспериментальным дисбактериозом через 1 нед выявлен незначительный лейкоцитоз (8,5±0,9×109/л против 7,4±0,6×109/л в контроле). Лейкоцитарная реакция сопровождалась изменением клеточного состава лейкограммы: в периферической крови увеличивалось процентное содержание палочкоядерных (3,6±0,3 против 3,0±0,2%) и сегментоядерных лейкоцитов (37,2±5,3 против 26,3±2,3%) и снижалось процентное содержание лимфоцитов (53,3±4,4 против 66,2±3,4%). Эти изменения могут свидетельствовать о возможной эндогенной интоксикации. Для более достоверной оценки реакции системы крови или степени интоксикации определяли ЛИИ, который, кроме того, служит косвенным признаком, характеризующим состояние иммунной системы.

У животных 1-й группы выявлено значимое увеличение ЛИИ по сравнению с таковым показателем у интактных животных 3-й группы (0,62±0,07 против 0,46±0,03 усл. ед.). В группе животных, получавших ПП, по истечении недели лейкоцитарная реакция сохранялась (8,2±0,6×109/л), ЛИИ также оставался повышенным (0,57±0,04 усл. ед.).

При оценке уровня МСМ (см. рисунок) как маркера эндотоксикоза у животных с экспериментальным дисбактериозом (1-я группа) выявлена их повышенная по сравнению с контролем концентрация в динамике наблюдения (1, 4 и 6 нед). При этом степень повышения МСМ (до 17%) характеризуется как слабый уровень интоксикации . Под влиянием ПП (2-я группа) установлено статистически значимое снижение концентрации МСМ по сравнению с их уровнем в 1-й группе животных на протяжении всего исследования. К 4-6-й неделе у животных 2-й группы концентрация МСМ достигала уровня таковой у контрольных животных (3-я группа), что свидетельствует о купировании интоксикации.

Исследование показателей фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов перитонеальной полости у животных с экспериментальным дисбактериозом как принимавших в течение недели ПП (2-я группа), так и не принимавших ПП (1-я группа) выявило ее статистически значимое снижение по сравнению с интактным контролем (3-я группа).

Через 4 нед у мышей 2-й группы наблюдалось восстановление этих показателей до уровня интактного контроля, а к концу наблюдаемого периода (через 6 нед) у этих животных выявлено статистически значимое повышение ФП и ФЧ по сравнению с животными 1-й группы (табл. 2).

Таким образом, нами установлено, что применение ПП у мышей с экспериментальным дисбактериозом способствовало купированию симптомов диспепсии, восстановлению массы тела и оказывало корригирующее влияние на состав кишечной микрофлоры: наблюдалось восстановление содержания бифидо- и лактобактерий, типичной кишечной палочки, уменьшение количества бактерий родов Proteus и Clostridium, элиминация S. aureus. Применение ПП также приводило к снижению уровня МСМ как маркера эндогенной интоксикации организма и увеличению показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, относящихся к клеткам-эффекторам врожденного иммунитета.

Рассматривая возможные механизмы корригирующего влияния ПП, следует учитывать, что в его состав входят 2 биологически активных компонента - пробиотический штамм B. bifidum 791 и альгинат натрия, содержащийся в биогеле из морской капусты.

Альгинаты обладают всеми характерными для пищевых волокон свойствами: не расщепляются пищеварительными ферментами в верхних отделах ЖКТ, в неизмененном виде достигают толстого кишечника, селективно ферментируются его микрофлорой [18, 22], а также стимулируют активный рост бифидо- и лактобактерий как in vitro, так и in vivo [21, 24].

Выявленное нами восстановление микробиоценоза кишечника также может быть связано с повышением местного иммунитета при применении ПП. Хорошо известно, что кишечная микрофлора с первых дней жизни участвует сначала в формировании иммунной системы, а затем и в поддержании нормального ее функционирования [23]. Напротив, нарушение микробиоценоза ЖКТ снижает резистентность организма к вирусным и бактериальным инфекциям, способствует развитию атопических заболеваний, аллергического дерматита, нейродермита и др. [3, 16, 25].







При развитии дисбиотических изменений в кровь поступает повышенное количество экзо- и эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры, что может приводить к развитию эндогенной интоксикации, в свою очередь усугубляющей клинические проявления дисбактериоза [17]. С депрессивным влиянием бактериальных эндотоксинов может быть связано угнетение функциональной активности фагоцитов, что свидетельствует об иммунных нарушениях. Под влиянием ПП наблюдалось восстановление поглотительной и переваривающей функций нейтрофилов, относящихся к клеткам-эффекторам врожденного иммунитета.

Увеличение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов у животных 2-й группы, вероятно, связано с действием биогеля и его основной составляющей - альгинатом натрия и обусловлено его стимулирующим влиянием на качественные и количественные параметры врожденного иммунитета [4, 8, 11].

Среди факторов патогенеза, значимых при формировании иммунодепрессии при синдроме эндогенной интоксикации, выделяют накопление МСМ.

Последние являются важным маркером эндоинтоксикации и включают компоненты различной природы, в том числе высокомолекулярные полисахаридные комплексы, локализованные на наружной мембране бактерий [5, 10]. В нашем эксперименте в процессе применения ПП уровень МСМ снижался, приближаясь к показателю у интактных животных (см. рисунок), что, по-видимому, свидетельствует о снижении уровня эндогенной интоксикации организма. Известно, что альгинаты обладают широким спектром биологической активности и применяются с целью купирования проявлений эндогенной интоксикации в составе комплексной терапии [15, 18]. Результаты проведенных нами исследований показывают, что в составе нового ПП альгинаты сохраняют свою иммуностимулирующую активность, в результате которой активируются фагоцитарные процессы и снижается уровень МСМ.

Таким образом, на примере экспериментального лекарственного дисбактериоза нами продемонстрирована положительная динамика восстановления нарушений микроэкологии кишечника и снижение степени интоксикации, а также стимулирующее влияние ПП на показатели врожденного иммунитета, что обусловлено как пробиотическими свойствами продукта за счет содержания бифидобактерий, так и его альгинатной составляющей, обеспечивающей иммуномодулирующую и энтеросорбционную активность. Полученные результаты открывают перспективы для использования ПП, содержащего бифидобактерии и биогель из бурых водорослей, для лечебного питания больных с антибиотикассоциированным дисбиозом, сопровождающимся микробной эндотоксемией.

Литература

1. Аминина Н.М. Лечебно-профилактический продукт "Ламиналь - биогель из морских водорослей". - Владивосток: ТИНРО, 2006. - 34 с.

2. Беспалов В.Г. Альгинат кальция. Источник растворимых пищевых волокон и кальция. - М., 2010. - 26 с.

3. Бондаренко В.М. Молекулярно-клеточные механизмы терапевтического действия пробиотических препаратов // Фарматека. - 2010. - № 2. - С. 26-32.

4. Добродеева Л.К., Морозова О.С., Сергеева Е.В. Механизмы иммуномодулиpующих эффектов альгинатов калия и магния // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6. № 1. - С. 238.

5. Карякина Е.В., Белова С.В. Молекулы средней массы как интегральный показатель метаболических нарушений (обзор литературы) // Клин. лаб. диагностика. - 2004. - № 3. - С. 4-8.

6. Конева Е.Л. Обоснование и разработка технологий альгинатсодержащих функциональных продуктов: Дис. - канд. техн. наук. - Владивосток, 2009. 150 с.

7. Конева Е.Л., Аминина Н.М., Якуш Е.В. Бифидогенные свойства продуктов переработки бурых водорослей // Известия ТИНРО. - 2010. - Т. 161. - С. 303-308.

8. Морозова О.С. Влияние солей альгиновой кислоты на клеточные и гуморальные механизмы системы иммунитета: Дис. - канд. биол. наук. - Архангельск, 2010. - 128 с.

9. Морские водоросли в восстановительной медицине, комплексной терапии заболеваний с нарушением метаболизма / Под ред. А.Н. Разумова и др. - М.: МДВ, 2008. - 106 с.

10. Нагоев Б.С, Габрилович М.И. Значение определения средних молекул в плазме крови при инфекционных заболеваниях вирусной и бактериальной этиологии // Клин. лаб. диагностика. - 2000. - № 1. - С. 9-11.

11. Новгородцева Т. П., Виткина Т.И., Караман Ю.К., Аминина Н.М. Использование биологически активной добавки на основе калия и магния при экспериментальной кардиовазопатии // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 55-59.

12. Отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003 (утв. Приказом МЗ РФ от 9.07.2003 №231) "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника".

13. Патент РФ № 2193780 от 27.11 2002 "Способ определения эндогенной интоксикации" / Жаденов И.И., Карякина Е.В., Белова С.В., Горячев В.И.

14. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 352 с.

15. Хотимченко М.Ю. Фармаконутрициология альгинатов. - Владивосток: Дальнаука, 2009. - 169 с.

16. Шендеров Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции "Функциональное питание" // Пищ. пром-сть. - 2003. - № 5. - С. 4-7.

17. Яковлев М.Ю. "Эндотоксиновая агрессия" как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи соврем. биол. - 2003. - Т. 123. № 1. - С. 31-40.

18. Brownlee I.A., Allen A., Pearson J.P. et al. Alginate as a source of dietary fiber // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2005. - Vol. 45. - Р. 497-510.

19. De Preter V., Hamer H.M., Windey K., Verbeke K. The impact of pre- and/or probiotics on human colonic metabolism: Does it affect human health? // Mol. Nutr. Food Res. - 2011. Vol. - 55, N 1. - Р. 46-57.

20. European Convention for Protection of Vertebrate Animals used in Experimental and other Studies. Cets No.: 123. - Strasbourg, 18.03.1986.

21. Janczyk P., Pieper R., Smidt H., Souffrant W.B. Effect of alginate and inulin on intestinal microbial ecology of weanling pigs reared under different husbandry conditions // FEMS Microbiol. Ecol. - 2010. - Vol. 7. - Р. 132-142.

22. Michel C., Benard C., Lahaye M. et al. Algal oligosaccharides as functional foods: in vitro study of their cellular and fermentative effects // Food Sci. - 1999. - Vol. 19. - Р. 311-332.

23. Ouwehand A., Isolauri E., Salminen S. The role of intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood // Eur. J. Nutr. - 2002. - Vol. 41, suppl. 1. - Р. 132-137.

24. Ramnani P., Chitarrari R., Tuohy K. et al. In vitro fermentation and prebiotic potential of novel low molecular weight polysaccharides derived from agar and alginate seaweeds // Anaerobe. - 2012. - Vol. 18. - Р. 1-6.

25. Romeo J., Nova E., Wоrnberg J. et al. Immunomodulatory effect of fibres, probiotics and synbiotics in different life-stages // Nutr. Hosp. - 2010. - Vol. 25, N 3. - Р. 341-349.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»