Как известно, интенсивные физические нагрузки, сопутствующие современному спорту высших достижений, приводят к развитию утомления со снижением физической работоспособности и изменением биохимических показателей крови, в том числе и ферментов антиоксидантной защиты [2, 17]. Пусковым механизмом торможения антиоксидантной системы при утомлении может быть острое нарушение метаболизма пуринов, описанное нами ранее, на модели тяжелой гипоксии [4, 5]. Суть его заключается в том, что гипоксия и сопутствующий ей лактоацидоз приводят к усилению катаболизма пуриновых мононуклеотидов до мочевой кислоты. Этот процесс сопряжен с выработкой ксантиноксидазой активных кислородных метаболитов (АКМ), повреждающих ненасыщенные и жирные кислоты в фосфолипидах мембран клеток. Эти метаболические изменения являются звеньями единого биохимического процесса. Они приводят к повышенному расходованию антиоксидантов и снижению активности ферментов антиперекисной защиты [4, 5].
Перспективным средством коррекции антиоксидантной системы при интенсивных физических нагрузках может стать моносахарид D-рибоза, положительное влияние которой показано при многих патологических состояниях, сопровождающихся гипоксией и нарушением пуринового обмена [13, 19-21].
Целью настоящего исследования было изучение активности антиоксидантных ферментов эритроцитов при интенсивных физических нагрузках на фоне приема D-рибозы.
Материал и методы
Исследования проводили в 2 этапа: на лабораторных животных (1-й этап) и с участием спортсменов (2-й этап).
На 1-м этапе рибоза была апробирована на 30 клинически здоровых крысах-самцах Вистар массой тела 240±20 г. Крыс были разделены на 3 группы по 10 животных. В 1-ю, контрольную группу включили крыс, которые плавали без груза в течение 3-5 мин через день в течение всего эксперимента, длившегося 35 сут. Во 2-й группе были крысы с интенсивным режимом физической нагрузки (ИФН): они плавали с грузом, равным 10% от массы тела, до полного утомления (до момента, когда крыса начинает тонуть), в течение первых 3 нед через день, а последние 2 нед - ежедневно. В 3-ю группу входили крысы, плававшие по схеме ИФН на фоне ежедневного введения рибозы (ИФН+Р). Углевод растворяли в воде и перорально вводили крысам до и после плавания; разовая доза рибозы составляла 50 мг на 1 кг массы тела. Отметим, что рибозу вводили животным только на последней неделе эксперимента. Температура воздуха в виварии составляла 19-21 С, воды (при плавании) - 28-30 С. Исследования проводили в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.
На 2-м этапе эксперимента были обследованы 50 спортсменов-пловцов мужского пола в возрасте 17-20 лет, имевшие разряды первый спортивный, кандидата в мастера спорта или мастера спорта. Кровь для биохимических исследований брали у спортсменов (натощак из локтевой вены) в период втягивающего мезоцикла (группа ВМ), когда объем тренировочной нагрузки составлял 3-4 км, а также контрольно-подготовительного (группа КПМ) при объеме нагрузки более 6-7 км. Часть пловцов, тренировавшихся в период КПМ, принимали рибозу перорально в дозе 30 мг/кг до и после тренировок в течение 7 дней (группа КПМ+Р).
Для биохимических исследований было отобрано по 20 проб из групп ВМ и КПМ, а также 10 проб - из группы КПМ+Р. При проведении 2го этапа эксперимента спортсмены соблюдали требования Хельсинкской декларации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека". Кровь, взятую для исследований, центрифугировали при 3000 об. в течение 15 мин. Далее отдельно собирали плазму и эритроцитную массу. При этом верхний слой осажденных форменных элементов, имеющий смешанный состав, отбрасывали, а из нижнего, состоящего практически полностью из эритроцитов, формировали пробы. В плазме крови крыс, а также спортсменов определяли концентрации молочной [14] и мочевой [18] кислот. Кроме того, в плазме крови крыс определяли концентрацию глюкозы - по [9]. Эритроциты подвергали гемолизу с последующим центрифугированием при 2000 об. в течение 15 мин. В надосадочной жидкости гемолизатов определяли содержание общего белка - по [15], малонового диальдегида (МДА) - по [6], активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) - по [8], глутатионпероксидазы (ГПО, КФ 1.11.1.9) - по [1], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, КФ 1.1.1.49) - по [3]. В ходе работы использовали D-рибозу фирмы "SciFit" (США) и реактивы фирм "Ольвекс" (Россия), "Hospitex" (Швейцария, Италия), "Hronolab" (Швейцария), "Randox" (Великобритания), а также центрифугу "C-80" и биохимический анализатор "Screen Master" фирмы "Hospitex" (Швейцария, Италия).
Результаты обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Расчеты проводили в программе Statistica 6.0 фирмы "StatSoft Inc." (США). Результаты представлены как M±m, где М - выборочное среднее, m - ошибка средней (р<0,05).
Результаты и обсуждение
В результате 1-го этапа исследований было установлено, что интенсивные физические нагрузки у крыс приводят к увеличению концентрации лактата в плазме крови до 10,8±0,43 ммоль/л (в контроле - 6,53±0,21 ммоль/л; p<0,001) (табл. 1). Уровень глюкозы, напротив, снижается до 6,34±0,29 ммоль/л (у контрольных животных - 7,36±0,31 ммоль/л; p<0,05). Лактоацидоз на фоне дефицита углеводов способствует активации АМФ-дезаминазы и других ферментов, участвующих в катаболизме пуриновых мононуклеотидов до мочевой кислоты [11] (см. рисунок). Концентрация последней в плазме крови крыс группы ИФН увеличивается до 131±5,9 мкмоль/л (в контроле - 80,1±5,3 мкмоль/л). Катаболизму пуринов в этих условиях также способствует торможение их реутилизации через реакцию, катализируемую гипоксантинфосфорибозилтрансферазой (ГФТФ) [12]. Для протекания данной реакции необходимо достаточное количество рибозо-5-фосфата (Р-5-Ф), генерируемого в пентозном цикле. Активность ключевого фермента данного метаболического пути - Г-6-ФДГ в эритроцитах крыс группы ИФН понижена до 2,69±0,54 мМЕ/мг белка (в контроле - 7,52±1,05 мМЕ/мг белка).
Усиленный катаболизм пуриновых мононуклеотидов сопряжен с активацией ксантиноксидазной реакции, продуцирующей АКМ [4, 7, 16]. Последние "атакуют" ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов мембранных оболочек эритроцитов с образованием перекисных соединений, в частности МДА (см. рисунок). Содержание его в эритроцитах крыс группы ИФН увеличено до 3,27±0,15 нмоль/мг белка (в контроле - 2,56±0,18 нмоль/мг белка). Активной липопероксидации мембран эритроцитов способствует также торможение активности ферментов, участвующих в инактивации АКМ и перекисных соединений. Наиболее важными из них являются СОД и ГПО, активность которых в эритроцитах крыс группы ИФН понижена: СОД - до 6,44±0,37 Ед/мг белка (в контроле - 10,73±0,87 Ед/мг), ГПО - до 2,11±0,12 МЕ/мг белка (в контроле - 2,96±0,15 МЕ/мг).
Таблица 1. Биохимические показатели в крови крыс (M±m)
Благодаря применению рибозы на протяжении последней недели эксперимента у крыс группы ИФН+Р наблюдались положительные изменения в биохимических показателях крови. Концентрация глюкозы у них возросла до 8,02±0,51 ммоль/л (в группе ИФН - 6,34±0,29 ммоль/л), а уровень лактата, напротив, понизился до 6,04±0,60 ммоль/л (в группе ИФН - 10,8±0,43 ммоль/л). В результате уменьшилась интенсивность катаболизма пуринов, о чем свидетельствует снижение уровня мочевой кислоты в плазме крови крыс группы ИФН+Р до 94,7±5,8 (в группе ИФН - 131±5,9 мкмоль/л). Это указывает на снижение активности ксантиноксидазы, уменьшение продукции АКМ и подтверждается уменьшением уровня МДА в эритроцитах крыс группы ИФН+Р до 2,57±0,16 нмоль/мг по сравнению с 3,27±0,15 нмоль/мг белка у животных группы ИФН.
Попадая в организм, находящийся в условиях гипоксии, рибоза превращается в Р-5-Ф под действием рибокиназы [10] (см. схему). Далее Р-5-Ф вовлекается в реутилизацию пуриновых мононуклеотидов через реакцию, катализируемую ГФТФ [12]. Вероятно, Р-5-Ф также вовлекается в пластическую ветвь пентозного цикла, где превращается в глюкозо-6-фосфат, компенсируя тем самым дефицит глюкозы и других углеводов в условиях интенсивных физических нагрузок (см. рисунок). Достаточный уровень углеводов и снижение продукции АКМ способствуют увеличению активности Г-6-ФДГ в эритроцитах крыс группы ИФН+Р до 4,92±0,65 мМЕ/мг (в группе ИФН - 2,69±0,54 мМЕ/мг белка). Одновременно усиливается и активность ферментов антиоксидантной системы. Активность СОД в эритроцитах крыс группы ИФН+Р увеличивается до 7,87±0,53 Ед/мг белка (в группе ИФН - 6,44±0,37 Ед/мг). В свою очередь, активность ГПО у животных группы ИФН+Р возрастает до 2,91±0,2 МЕ/мг (в группе ИФН - 2,11±0,12 МЕ/мг белка).
В крови спортсменов под действием физических нагрузок большой интенсивности в период КПМ наблюдалось изменение биохимических показателей (табл. 2). Так, уровень лактата в плазме крови возрос до 3,93±0,37 ммоль/л (в группе ВМ -
2,81±0,37 ммоль/л); кроме того, у пловцов при увеличении нагрузок происходит усиление катаболизма пуринов. Концентрация урата в плазме крови в группе КПМ составляла 369±9 мкмоль/л, в группе ВМ - 328±12 мкмоль/л.
Усиление распада пуринов сопряжено с продукцией АКМ в ксантиноксидазной реакции. Уровень МДА в эритроцитах пловцов в период КПМ увеличивается до 431±24 мкмоль/г (в группе ВМ - 387±16 мкмоль/г). Это свидетельствует об усилении процессов липопероксидации мембран эритроцитов под действием АКМ. При этом у спортсменов группы КПМ усиливается, по сравнению с группой ВМ, активность СОД (соответственно 361±19 и 225±22 МЕ/мл). Как и на 1-м этапе исследований (на лабораторных животных), в эритроцитах спортсменов при увеличении нагрузок снижается активность ГПО (25,2±0,9 МЕ/мл - группа КПМ и 31,0±1,4 МЕ/мл - группа ВМ). Однако снижения активности Г-6-ФДГ, как и на 1-м этапе исследований, не происходит. Активность этого энзима у спортсменов группы КПМ составила 98,0±5,7 мМЕ/кг, группы ВМ - 90,1±7,6 мМЕ/мг белка.
Схема острого нарушения метаболизма пуринов в эритроцитах при интенсивных физических нагрузках
1 - АТФаза; 2 - NADH-метгемоглобинредуктаза; 3 - аденилосукцинатлиаза; 4 - 5’-нуклеотидаза; 5 - аденозинкиназа; 6 - АМФ-дезаминаза; 7 - аденилосукцинатсинтетаза; 8 - аденозиндезаминаза; 9 - ненасыщенные жирные кислоты в мембранных оболочках эритроцитов; 10 - нуклеозидфосфорилаза; 11 - гипоксантинфосфорибозилтрансфераза; 12 - ксантиндегидрогеназа; 13 - ксантиноксидаза; 14 - рибозо-1-фосфатсинтетаза; 15 - фосфорибозилдифосфаткиназа; 16 - рибокиназа; 17 - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа; 18 - окислительная ветвь пентозного цикла; 19 - гексокиназа; 20 - пластическая ветвь пентозного цикла; 6-ФГ - 6-фосфоглюконат; АМФ - аденозинмонофосфат; АТФ - аденозинтрифосфат; Г-6-Ф - глюкозо-6-фосфат; Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ГПО - глутатионпероксидаза; ГР - глутатионредуктаза; ИМФ - инозинмонофосфат; ИФН - интенсивные физические нагрузки; КАТ - каталаза; ЛФПП - липофусциноподобный пигмент; МДА - малоновый диальдегид; Р-1-Ф - рибозо-1-фосфат; Р-5-Ф - рибозо-5-фосфат; СОД - супероксиддисмутаза; Ф-6-Ф - фруктозо-6-фосфат; ФРДФ - фосфорибозилдифосфат; G-S-H - глутатион; G-S-S-G - глутатиондисульфид; H2O2 - перекись водорода; HO2' - гидродиоксид; Hb - гемоглобин; L-OH - перекиси липидов; LOOH гидроперекиси липидов; MetHb - метгемоглобин; О2'- - супероксидный анион-радикал.
Сплошными стрелками обозначены направления биохимических реакций, точечными - действие негативных факторов.
У спортсменов, принимавших рибозу во время КПМ, биохимические показатели в плазме крови претерпевали положительные изменения. У пловцов группы КПМ+Р снижается уровень лактата (3,02±0,22 ммоль/л; в группе КПМ - 3,93±0,37 ммоль/л), благодаря чему у них не происходит резкого нарушения метаболизма пуринов. Об этом свидетельствует снижение в плазме пловцов группы КПМ+Р уровня мочевой кислоты до 329±8 мкмоль/л (в группе КПМ - 369±9 мкмоль/л).
Снижение катаболизма пуринов уменьшает степень пероксидации мембран эритроцитов. Содержание в них МДА снижается до 350±21 мкмоль/г (в группе КПМ - 431±24 мкмоль/г). В результате введения рибозы нормализуется активность ключевых ферментов антиоксидантной системы. Активность СОД в эритроцитах пловцов группы КПМ+Р составляет 237±14 МЕ/мл, в группе КПМ - 361±19 МЕ/мл, а ГПО - соответственно 30,4±1,0 и 25,2±0,9 МЕ/мл. Вероятно, это является следствием того, что экзогенная рибоза способствует усилению работы пентозного цикла. Поскольку в нем рибоза способна превращаться в Г-6-Ф, который служит субстратом для Г-6-ФДГ. Это продуцирует достаточное количество NADPH, необходимого для эффективной работы глутатионзависимых ферментов, в том числе и ГПО. Активность Г-6-ФДГ в эритроцитах пловцов группы КПМ+Р увеличивается до 135±7 МЕ/л (у пловцов групп ВМ и КПМ - соответственно 90,1±7,6 и 98,0±5,7 МЕ/л).
Таблица 2. Биохимические показатели крови у спортсменов-пловцов (М±m)
Таким образом, как показали исследования, проведенные на лабораторных животных, а также у спортсменов, D-рибоза, используемая во время физических нагрузок высокой интенсивности, оказывает положительное влияние на активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов. Происходит это благодаря тому, что данный моносахарид способствует усилению реутилизации пуриновых мононуклеотидов, снижая выработку активных кислородных метаболитов в ксантиноксидазной реакции. Вследствие этого подавляются чрезмерная липопероксидация мембран эритроцитов и накопление в них МДА. Введение рибозы также способствует улучшению работы пентозного цикла, обеспечивающего антиоксидантную систему NADPH.
Литература
1. Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслегина И.А. // Лаб. дело. - 1990. - № 8. - С. 19-21.
2. Горохов Н.М., Тимошенко Л.В. // Теор. и практ. физич. культуры. - 2007. - № 10. - C. 44-45.
3. Захарьин Ю.Л. // Вопр. мед. химии. - 1968. - Т. 14, № 1. - С. 348-355.
4. Конвай В.Д., Лукошкин А.В., Смирнова В.Б. // Пат. физиол. - 1984. - № 6. - С. 58-62.
5. Конвай В.Д., Лукошкин А.В., Поспелов В.С. // Там же. - 1987. - № 5. - С. 57-59.
6. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
7. Чигринский Е.А., Конвай В.Д. // Естеств. и техн. науки. - 2009. - № 3. - C. 69-74.
8. Чумаков В.Н., Осинская Л.Ф. // Вопр. мед. химии. - 1977. - Т. 23, № 5. - С. 712-716.
9. Barham D., Trinder P. // Analyst. - 1972. - Vol. 97, N 151. - P. 142-145.
10. Bork P., Sander C., Valencia A. // Protein Sci. - 1993. - Vol. 2, N 1. - P. 31-40.
11. Buhl M.R. // Dan. Med. Bull. - 1982. - Vol. 29, N 1. - P. 1-26.
12. Giacomello A. // Ann. Nutr. Metab. - 1989. - Vol. 33, N 4. - P. 194-195.
13. Gross, M., Reiter S., Zollner N. // Klin. Wochenschr. - 1989. - Vol. 67, N 23. - P. 1205-1213.
14. Hohorst H.-J. L-(+)-Lactat Bestimung mit Lactat-Dehydrogenase und NAD // Methoden der ensymatischen Analyse. - Berlin: Academie-Verlag, 1970. - Bd 2. - S. 1425-1429.
15. Josephson B., Gyllensward C. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1957. - Vol. 9, N 1. - P. 29-38.
16. Kellogg E.W., Fridovich I. // J. Biol. Chem. - 1975. - Vol. 250, N 22. - P. 8812-8817.
17. Melikoglu M.A., Kaldirimci M., Katkat D. // J. Sports Med. Phys. Fitness. - 2008. - Vol. 48, N 3. - P. 388-390.
18. Otetea G., Mangiuca M., Costescu R. // Timisoara Med. - 1976. -Vol. 21, N2. - P. 90-94.
19. Pauly D., Johnson C., St. Cyr J.A. // Med. Hypotheses. - 2003. -Vol. 60, N2. - P. 149-151.
20. Wallen W.J., Belanger M.P., Wittnich C. // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 81, N 1. - P. 40-47.
21. Zimmer H.-G. // Science. - 1983. - Vol. 220, N 4592. - P. 8 1- 8 2 .