Промышленное птицеводство, являясь наиболее наукоемкой и динамичной отраслью агропромышленного комплекса, вносит значительный вклад в обеспечение населения страны продовольствием. Особенно быстрыми темпами растет производство мяса птицы, потребление которого в стране в 2016 г. превысило 30 кг на душу населения. В то же время развитие производства зачастую предусматривает использование некоторых антимикробных препаратов для профилактики и лечения ряда заболеваний птицы, которые связаны с нарушением кишечного биоценоза, снижением резистентности, обусловленной ослаблением иммунной системы.
На протяжении многих лет для этого используются кормовые антибиотики. Практически до 2006 г., пока ЕС не отказался от их применения из-за риска появления устойчивых штаммов бактерий в пищевых продуктах животного происхождения, они занимали прочные позиции в качестве добавок в комбикорма. Однако из-за постоянного, а в ряде случаев несистемного применения антибиотиков эффективность их воздействия на организм животных заметно упала вследствие привыкания к ним патогенных и условно-патогенных бактерий, снижения численности полезной микрофлоры, в составе которой накапливаются штаммы с измененными экологическими характеристиками. Некоторые антибиотики накапливаются в яйце, мясе, а затем в организме людей, их потребляющих. Устойчивость к антибиотикам, которая развивается в микроорганизмах животных, может быть передана патогенным микроорганизмам, поражающим человека. В результате применения антибиотиков возросла лекарственная устойчивость таких условно-патогенных микробов, как кишечная палочка, энтерококки, кампилобактерии, стафилококки.
В последнее время стали искать замену кормовым антибиотикам. Многочисленные исследования в области микробиологии, физиологии, биохимии и нутрициологии привели к разработке целого ряда препаратов, не уступающих им по эффективности и при этом исключающих негативные последствия. Их отличительной чертой является экологическая безопасность, они не оказывают побочных эффектов, утилизируются организмом животных и не наносят угрозы ни потребителю продукции, ни окружающей среде.
К таким препаратам относятся пробиотики, пребиотики, симбиотики, синбиотики и фитобиотики. Все эти препараты объединяет то, что они влияют на микрофлору желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). С этих позиций их следует рассматривать как добавки для поддержания здоровья животных и получения продукции высокого качества, безопасной как в бактериальном, так и в химическом отношении. Таким образом, поддержание эффективного симбиоза между организмом птицы и ее кишечной микрофлорой сегодня считается необходимым компонентом разработки кормовой стратегии и сохранения здоровья птицы. Одним из перспективных направлений является использование микробных препаратов направленного действия - пробиотиков, именно им отводится ведущая роль при замене кормовых антибиотиков [1, 2].
Состав и свойства пробиотиков зависят от числа входящих в них штаммов и видового состава микроорганизмов [3, 4]. Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков, классифицируются на 4 группы: бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, неспорообразующие), дрожжи, анаэробы - спорообразующие бактерии рода Clos-tridium, аэробы - спорообразующие бактерии рода Bacillus [5, 6].
Основными отличиями пробиотиков от кормовых антибиотиков являются нулевые сроки ожидания, когда реализацию продукции можно осуществлять непосредственно после применения. Отсутствие привыкания к препарату, безвредность в концентрациях, многократно превышающих рекомендуемые нормы.
Исходя из важнейших функций пробиотиков в качестве альтернативы кормовым антибиотикам, важно правильно построить стратегию кормления птицы, с учетом перспективных программ, обеспечивающих получение продукции высокого качества для питания людей. Действие пробиотиков в организме птицы во многом зависит от рационов кормления, так как некоторые ингредиенты могут препятствовать их эффективному применению. Кроме того, именно рационы кормления цыплят-бройлеров являются основным фактором, влияющим на продуктивность птицы, биохимический состав, качество и пищевую ценность мяса. Считается, что качество мяса примерно на 2/3 зависит от уровня кормления и других факторов внешней среды, а на 1/3 - от кросса птицы.
В рационах бройлеров учитывают потребность и нормируют содержание обменной энергии, белка, клетчатки, жира, в том числе линолевой кислоты, макроэлементов: кальция, фосфора, натрия. Кроме того, учитывают потребность птицы в 13 аминокислотах с учетом их доступности, 7 микроэлементах, 14 витаминах и витаминоподобных веществ и др. (всего более 40 показателей). В настоящее время разработано руководство по оптимизации рецептов комбикормов для сельскохозяйственной птицы.
Оптимальный рацион по набору зерновых компонентов, сбалансированный по обменной энергии, пищевым и биологически активным веществам, положительно влияет на микрофлору кишечника, обеспечивая высокую перевариваемость и усвояемость корма, а главное, позволяет использовать генетический потенциал продуктивности современных кроссов бройлеров и высокие вкусовые качества мяса.
Целью исследований было изучение качества мяса бройлеров при замене в рационах разной структуры, рассчитанных с использованием современных программ оптимизации пищевой ценности, кормового антибиотика пробиотиком и их воздействие на состав и структуру микробиоценоза кишечника.
Материал и методы
Проведено 3 эксперимента в условиях вивария ФГУП "Загорское ЭПХ ВНИТИП" на цыплятах-бройлерах кросса "Кобб 500" с суточного до 36-дневного возраста (табл. 1).
&hide_Cookie=yes)
Кормление птицы осуществляли вручную, вволю, сухими полнорационными комбикормами различного состава в соответствии с нормами для кросса. Птицу содержали в клеточных батареях по 70 голов в каждой группе (без разделения по полу), с соблюдением всех технологических норм ВНИТИП. В опытах использовали кормовой антибиотик Бацитрацин 120 и пробиотик - бактерийный препарат Целлобактерин®-Т на основе целлюлозолитических и молочнокислых микроорганизмов (табл. 1). В ходе экспериментов изучали продуктивность бройлеров, а также качественные показатели мяса.
Кормовой антибиотик исключали из состава комбикорма за 7 сут перед убоем цыплят. Остаточное количество антибиотика бацитрацина определяли методом иммуноферментного анализа в соответствии с МУК 4.13379-16.
Мясные качества бройлеров и органолептическую оценку мяса проводили в соответствии с Методическими рекомендациями по проведению анатомической разделки тушек, органолептической оценки качества мяса и яиц сельскохозяйственной птицы и морфологии яиц (2013 г.).
Пробы мяса птицы готовили из охлажденных тушек 3 петушков и 3 курочек после отделения костей.
Содержание аминокислот в мясе после кислотного гидролиза образцов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с постколоночной дериватизацией на хроматографической системе YL 9100 HPLC System ("Young Lin Instrument Co., Ltd", Южная Корея); содержание витаминов - с использованием ВЭЖХ-системы Smartline ("KNAUER", Германия) по методикам пробоподготовки и анализа [7].
Состав бактериального сообщества содержимого слепых отростков и двенадцатиперстного отдела кишечника бройлеров в конце опыта (36 дней) исследовали методом T-RFLP-анализа [8, 9]. Отбор проб и подготовку образцов для определения структуры микробиоценоза кишечника проводили в ООО "БИОТРОФ+" со строгим соблюдением стерильности в соответствии с требованиями [10].
Тотальную ДНК из образцов (из среднесмешанного содержимого кишечника 3 птиц) выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas, Inc.", Литва). ПЦР-амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе Verity ("Life Technologies, Inc., США), используя эубактериальные праймеры 63F (CAGGCCTAACFCFTGCAAGTC) с меткой на 5-м конце флуорофор WellRed D4 и 1492R (TACGGHTACCTTGTTACGACTT).
Флуоресцентно меченные ампликоны гена 16S pPHK очищали по стандартной методике. Рестрикцию 30-50 нг ампликонов 16S pPHK осуществляли рестриктазами Hael, Hhal и Mspl по рекомендации изготовителя ("Fermentas", Литва). Продукты рестрикции анализировали на секвенаторе CEQ 8000 ("Beckman Coulter", США). Принадлежность бактерий к филогенетическим группам определяли в программе Fragment Sorter [11, 12].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили для учета общего количества бактерий в содержимом кишечника птицы по модифицированной методике [13, 14].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью дисперсионного анализа с использованием Microsoft Excel 2010 с применением f-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных опытов было установлено, что самая высокая сохранность цыплят-бройлеров была отмечена в 1-м опыте при использовании комбикормов кукурузно-соевого типа с добавкой антибиотика или пробиотика и составила 100%, тогда как при других типах рационов этот показатель был на уровне 97,198,6%.
Конверсия корма в опытных группах бройлеров при использовании в рационах пробиотика улучшалась на 1,20-1,75% (р≤0,05) и составляли 1,62; 1,65 и 1,68 против 1,64; 1,67 и 1,71 в контрольных группах.
По убойному выходу мяса различий между группами цыплят не установлено.
Результаты проведенной анатомической разделки цыплят-бройлеров свидетельствуют о довольно высоких мясных качествах птицы во всех контрольных и опытных группах. Так, выход наиболее ценной части тушки - грудного филе - составил около 24,4% от массы потрошеной тушки. Замена кормового антибиотика пробиотиком на этот показатель не влияла.
Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что мясо бройлеров по своему химическому составу имело высокую пищевую ценность. Содержание белка в грудных мышцах выше, чем в ножных. При этом у бройлеров, получавших пробиотик, количество белка в грудных мышцах было выше на 5-10%.
&hide_Cookie=yes)
Содержание жира в грудных мышцах птицы было в 3,0-3,7 раза ниже, чем в ножных. Значимых отличий по данному показателю в грудных мышцах между опытными и контрольными группами не было. В ножных мышцах отмечена тенденция к снижению количества жира у бройлеров опытных групп по отношению к контрольным. Значимые различия были во 2-м и 3-м опытах у животных, комбикорма которых содержали пшеницу и подсолнечный шрот; ячмень и подсолнечниковый жмых. Снижение составило 8,8 и 14,1% по сравнению с соответствующим контролем.
Содержание аминокислот в грудных и ножных мышцах 6-недельных бройлеров представлено в табл. 3 и 4.
&hide_Cookie=yes)
Количественный состав аминокислот в мышцах бройлеров опытных и контрольных групп не различался.
Содержание витаминов в мясе бройлеров в расчете на 100 г естественной влажности приведено в табл. 5.
Мясо бройлеров является одним из важных источников витаминов для человека. Содержание витаминов в мясе определяется их уровнем в корме и возможностью усвоения организмом птицы. Из данных табл. 6 видны существенные различия по накоплению витаминов между цыплятами контрольных и опытных групп.
&hide_Cookie=yes)
Их содержание повышалось при замене в комбикормах антибиотика пробиотиком независимо от структуры рецепта комбикорма. Так, содержание витамина А в мясе бройлеров увеличилось на 33-50%; Е - практически в 2 раза; тиамина при применении рецепта с преимущественным содержанием пшеницы - в 2,2 раза, а в 1-м и 3-м опытах - на 50-55%; рибофлавина -на 32-69%; витамина В6 - на 15-46%; холина - на 42-54%; пантотеновой кислоты - на 11-25%; никотиновой кислоты -на 86-98% в опытных группах 1-го и 3-го опытов, а во 2-м опыте - в 2,5 раза, фолиевой кислоты - на 76-86% в 1-м и 3-м опытах и в 2,3 раза - во 2-м опыте. Существенное увеличение отмечено и по биотину. Что касается содержания в мясе аскорбиновой кислоты, то ее увеличение не носило достоверного характера.
При органолептической оценке вареного мяса бройлеров и бульона не выявлено влияния добавки пробиотика на вкусовые и другие показатели как мяса, так и бульона.
Содержание бацитрацина в мясе бройлеров контрольных групп в трех опытах не превышало 0,02 ед/г, что соответствует требованиям СанПиН 2.3.1078-01. Структура рецепта комбикорма не оказывала влияния на накопление антибиотика в мясе. Применение пробиотика позволило получить мясо без содержания антибиотика.
Используя молекулярно-генетические методы T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) и ПЦР в реальном времени, мы сравнили численность и состав бактериального сообщества в кишечнике у 6 групп цыплят-бройлеров кросса в возрасте 37 сут. Для исследований было выбрано два отдела: двенадцатиперстная кишка, поскольку именно сюда впадают протоки поджелудочной железы и желчного пузыря и начинается кишечное пищеварение, а следовательно, интенсивно протекают амилолитические, протеолитические и липолитические процессы, и слепые отростки - по причине того, что в данном отделе кишечника содержится наибольшее количество микроорганизмов по сравнению с другими отделами пищеварительной системы птиц, а также активно протекают процессы расщепления клетчатки и других некрахмалистых полисахаридов, сбраживание полисахаридов до летучих жирных кислот, синтез витаминов группы В [15, 16].
В результате проведенных опытов было установлено, что общее количество бактерий в изучаемых отделах кишечника у подопытной птицы находилось в соответствии с данными, приводимыми другими авторами [17, 18].
Показано, что замена кормового антибиотика пробиотиком на общее содержание бактерий в двенадцатиперстной кишке и в слепых отростках кишечника бройлеров при использовании разных рационов кормления птицы существенного влияния не оказала (см. табл. 6).
В содержимом кишечника птицы было оценено количество целлюлозолитических микроорганизмов, лакто-, бифидобактерий, бацилл, селеномонад, которые, по современным представлениям [17, 18], составляют основу микробных сообществ кишечника клинически здоровой птицы. Результаты анализа количества представителей перечисленных групп микроорганизмов свидетельствуют о положительном эффекте замены антибиотика в рационах птицы на пробиотик (табл. 7).
Количество целлюлозолитических бактерий (представителей филума Bacteroidetes, сем. Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae) в слепых отростках кишечника птицы, где происходят основные процессы ферментации кормов при помощи микробных ферментов, достоверно возрастало с применением пробиотика в 13,8, 3,3 и 3,6 раза для опытных групп соответственно в 1, 2 и 3-м опытах по сравнению с контролем.
Аналогичная тенденция наблюдалась и в отношении других представителей нормофлоры кишечника птицы. Количество лактобактерий из семейства Lactobacteriaceae, способных к конкурентному вытеснению патогенов благодаря синтезу органических кислот и бактериоцинов [18], при введении в рацион подопытной птицы пробиотика возрастало в 1,8-2,5 раза в слепых отростках и в 1,6-1,7 раза в двенадцатиперстном отделе кишечника. Стоит отметить тенденцию к снижению численности бифидобактерий семейства Bifidobacteriaceae в двенадцатиперстном отделе кишечника при введении в рацион птицы пробиотика, в отличие от слепых отростков птицы, где численность бифидобактерий, напротив, повышалась.
Общая численность бацилл из семейства Bacillaceae, обладающих способностью к подавлению развития патогенов и другими полезными свойствами (например, расщепление клетчатки кормов), в кишечнике птицы в опытных группах с добавлением в рацион пробиотика статистически значимо повышалась, что, очевидно, связано с успешной приживаемостью и размножением интродуцированных бацилл, входящих в состав пробиотика, в содержимом кишечника. Полученные результаты согласуются с результатами авторов о том, что некоторые виды бацилл, включая Bacillus subtilis, способны к адгезии на слизистой кишки, что позволяет им колонизировать пищеварительный тракт и занимать свободные экологические ниши в микробиоме кишечного тракта, оказывая пробиотический эффект [19, 20]. Самая высокая численность бацилл была выявлена в 1-й опытной группе на фоне рациона кукурузно-соевого типа, где повышение численности данных бактерий отмечено в 155 раз.
Замена антибиотика в рационах на пробиотик положительно отразилась и на численности селеномонад -бактерий семейства Veillonellaceae, играющих важную роль в пищеварительных процессах птицы в связи с их способностью ферментировать широкий спектр органических кислот, включая лактат, с образованием различных летучих жирных кислот, необходимых для обеспечения птицы энергией [18]. Установлено, что количество селеномонад наиболее значительно повышалось в двенадцатиперстном отделе кишечника птицы: в 25-35 раз в зависимости от рациона птицы. Наибольшее увеличение численности селеномонад отмечено во 2-й опытной группе на фоне рациона, основу которого составляли пшеница и подсолнечный шрот.
Введение в рацион пробиотического препарата оказало положительное влияние на содержание нежелательной микрофлоры в кишечнике птицы (табл. 8). Так, количество актиномицетов, среди которых нередко встречаются возбудители актиномикозов, в двенадцатиперстном отделе кишечника птицы 1-й и 2-й опытных групп снижалось в 2,3 и 1,6 раза соответственно по сравнению с контролем. Исключением стала группа энтеробактерий семейства Enterobacteriaceae (в состав которой входят сальмонелла, кишечная палочка, протей и др.), доля которых несколько повышалась при отсутствии антибиотика в рационе.
&hide_Cookie=yes)
Численность псевдомонад Pseudomonadales - представителей транзитной микрофлоры птицы, высокая доля которых в кишечнике связана с дисбиотическими нарушениями ЖКТ у млекопитающих и птицы, -в содержимом кишечника исследуемой птицы при применении в рационе пробиотика существенно снижалась. Наибольшее уменьшение количества транзитных псевдомонад отмечено в 1-й и 3-й опытных группах на фоне применения пробиотика в рационе - в 15 и 10 раз в двенадцатиперстном отделе кишечника, а также в 11 и 8,8 раза в слепых отростках кишечника соответственно.
Заключение
Установлено, что в грудных мышцах бройлеров опытных групп, получавших c рационом подсолнечник (2-й и 3-й опыты), содержание белка было значимо выше на 10,0 и 6,8% (р<0,05). В ножных мышцах было меньше содержание жира на 8,8 (р<0,05) и 14,1% (р<0,01).
Содержание витаминов в мясе птицы опытных групп, получавших пробиотик, было статистически значимо выше (р<0,001) по сравнению с бройлерами контрольных групп, получавших кормовой антибиотик. Замена антибиотика на пробиотик также оказала положительное воздействие на состав бактериального сообщества в двенадцатиперстном отделе и слепых отростках кишечника бройлеров на фоне разных рационов. Применение пробиотика позволило получить мясо без содержания антибиотиков и снижения продуктивности бройлеров.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14-16-00140).