Качество и безопасность пищевой продукции, в особенности предназначенной для детского питания, - одна из глобальных проблем современности [1]. И в России, и во Вьетнаме в связи с ростом спроса сегмент рынка пищевой продукции для детей развивается наиболее быстрыми темпами. В структуре детского питания значительный удельный вес занимают мясо и мясные продукты, так как животный белок содержит ряд жизненно необходимых для детей аминокислот в наиболее предпочтительном соотношении [2]. Союз педиатров РФ рекомендует в питании ребенка использовать продукты и блюда прикорма промышленного производства, которые изготавливают из высококачественного сырья, они соответствуют строгим гигиеническим требованиям к показателям безопасности и имеют гарантированный химический состав [3, 4].
Химическая безопасность пищевой продукции для детей гарантируется соблюдением определенного уровня содержания загрязнителей химического и биологического происхождения в соответствии с гигиеническими нормативами, установленными Техническим регламентом ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции", СанПиН 2.3.2.1078 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" и международными документами - Стандартами Комиссии Кодекс Алиментариус и Регламентом комиссии (ЕС) № 1881/2006. В соответствии с российскими санитарными нормами в составе мясорастительных консервов для детского питания должны отсутствовать такие соединения, как микотоксины, антибиотики, нитраты, нитриты и N-нитрозоамины. Вместе с тем не все потенциально опасные соединения регламентируются в перечисленных документах. Особую опасность представляет группа высокотоксичных, канцерогенных N-нитрозоаминов [5]. В настоящее время во Вьетнаме отсутствуют нормативы для N-нитрозоаминов в детских мясорастительных консервах.
Основным источником поступления нитратов и N-нитрозоаминов в детский организм являются продукты растительного происхождения (овощи до 70%), также мясо и консервированные продукты (до 10%) [6, 7]. Большую роль играет процесс приготовления, хранения и кулинарной обработки продуктов. Чем более интенсивна тепловая обработка, тем больше срок хранения продукта и больше образуется в нем производных N-нитрозосоединений [5] (в том числе N-нитрозодиметиламина), оказывающих широкий спектр канцерогенного и мутагенного действия и высокотоксичных по отношению к печени и почкам [8]. В процессе изучения возможных путей метаболизма N-нитрозоаминов установлено, что большая их часть (свыше 99%) метаболизируется в кишечнике и печени. Метаболизм N-нитрозоаминов микросомальной системой окисления приводит к образованию иона метилдиазония, который способен метилировать ДНК клеток, индуцируя возникновение злокачественных опухолей легких, желудка, пищевода, печени и почек. Основным продуктом взаимодействия N-нитрозоаминов с ДНК клетки является 7-метилгуанин-ДНК, но наибольшей канцерогенностью обладает минорный продукт этого взаимодействия - О6-метилированный гуанин-ДНК [8].
Контаминация пищевых продуктов опасными органическими соединениями делает актуальным мониторинг содержания N-нитрозоаминов [9]. Для обеспечения химической безопасности пищевой продукции для детей необходимо совершенствовать систему организации контроля, включая создание и развитие современной технической и методической базы.
Цель исследования - сравнительная оценка контаминации консервированных мясорастительных продуктов для детского питания высокотоксичными N-нитрозоаминами методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) с использованием автоматической системы твердофазной экстракции (ТФЭ) и методом тандемной масс-спектрометрии с газовой хроматографией QuEChERS (ГХ-МС/МС).
Материал и методы
В соответствии с Меморандумом о взаимопонимании между ФБУН "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Роспотребнадзора (Пермь, Россия; далее - Федеральный центр г. Перми) и Национальным институтом по контролю пищевых продуктов (Ханой, Республика Вьетнам), подписанным в августе 2018 г, выполнена научно-исследовательская работа по количественному определению N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-метилэтилнитрозоамин, N-нитрозодиэтиламин, N-нитрозодипропиламин, N-нитрозодибутиламин, N-нитрозопиперидин, N-нитрозопирролидин, N-нитрозоморфолин, N-нитрозодифениламин) в образцах мясорастительных консервов для детского питания, выпущенных и находящихся в обороте Республики Вьетнам.
Объектами исследований являлись стандартные образцы смеси 9 N-нитрозоаминов EPA 521 Nitrosamine Mix, состоящие из N-нитрозодиметиламина (N-DMNA), N-нитрозометилэтиламина (N-MENA), N-нитрозодиэтиламина (N-DENA), N-нитрозодипропиламина (N-DPNA), N-нитрозодибутиламина (N-DBNA), N-нитрозопиперидинамина (N-PIPNA), N-нитрозопирролидинамина (N-PYRNA), N-нитрозоморфолинамина (N-MORNA) и N-нитрозодифениламина (N-DPHNA) концентрацией 2000 мкг/см3 в метаноле (Supelco, США), CAS № 62-75-9, а также гомогенизированные консервированные мясорастительные продукты для детского питания (далее - детские мясорастительные консервы) - 21 образец, отобранный из торговой сети Республики Вьетнам методом случайной выборки. Они включали следующие виды: овощи и рис с цыпленком (образец № 1), сладкую кукурузу с картофельным пюре и индейкой (образец № 2), картофель с телятиной (образец № 3), каждого вида по 7 образцов. Каждый образец пищевого продукта анализировали трижды двумя методами. Всего выполнено 63 исследования, 567 элементоопределений.
Российская Федерация. В Федеральном центре г. Перми выполнены скрининговые исследования мясных консервов ГХ/МС с использованием автоматической системы ТФЭ на этапе пробоподготовки. Для построения градуировочной характеристики использовали стандартный раствор (0,16 мкг/см3) смеси 9 N-нитрозоаминов. Для работы автоматической системы ТФЭ использовали растворители дихлорметан (HPLC) 99,9% (PanReac AppliChem); ацетонитрил (HPLC) 99,9% (PanReac AppliChem); 2-пропанол multisolvent (HPLC) 99,99% (Scharlau); этилацетат multisolvent (HPLC) 99,97% (Scharlau), а также картридж угольный Coconut Charcoal SPE (30 pk 2 г/6 мл) (Supelco, США).
В режиме селективного ионного детектирования (SIM) с использованием стандартных растворов 9 N-нитрозоаминов по характеристическим ионам соединений 74, 88, 102, 130, 84, 114, 100, 116, 168 m/z в диапазоне концентраций 0,0002-0,0016 и 0,016-5,0 мг/кг строили градуировочную зависимость для количественного определения содержания N-нитрозоаминов. Проведенная аттестация методики в соответствии с РМГ 61-2010 [10] и ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений" позволила установить метрологические характеристики: показатель внутрилабораторной прецизионности 4,84%, показатель правильности не более 10% и показатель точности 19%. Исследования стандартных образцов и пищевой продукции выполняли на газовом хроматографе Agilent 7890А (Agilent, США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (MCD) 5975С. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ. Высокая эффективность хроматографического разделения 9 N-нитрозоаминов с различными физико-химическими свойствами достигнута на капиллярной колонке серии HP-FFAP длиной 50 м, внутренним диаметром 0,320 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,50 мкм. Режим программирования температуры колонки: первоначально температуру устанавливали на 50 °C и выдерживали в течение 1 мин, затем температуру увеличивали до 120 °С со скоростью 8 °С/мин; от 120 до 180 °С со скоростью 12 °С/мин и от 185 °С до 240 °С со скоростью 25 °С/мин с выдержкой при конечной температуре 5 мин. Общее время анализа составляло 22,4 мин. Газ-носитель гелий; скорость газаносителя 1,0 см3/мин в режиме постоянного потока. Температура аналитического интерфейса 220 °С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера Agilent ALS в режиме pulsed/splitless; объем пробы 2 мкм3.
Для устранения влияния матричных эффектов образцов консервов и недостаточной селективности процедур пробоподготовки на результаты ГХ/МС-определения N-нитрозоаминов выполняли очистку образцов от мешающих компонентов и жира методом дистилляции с использованием щелочного катализа, что обеспечивало увеличение полноты и селективности экстракционного извлечения аналитов из образца [11, 12]. После окончания процедуры дистилляции N-нитрозоаминов полученный дистиллят (объемом 70 см3) пропускали через картридж Coconut 6 см3 автоматической системы ТФЭ с использованием оптимальной схемы элюирования (полнота извлечения 92-99%), идентификации соединений по масс-спектрам и времени выхода; количественного ГХ/МС-определения по градуировочному графику. Для подтверждения присутствия N-нитрозоаминов в образцах применяли идентификационные параметры: время удерживания N-нитрозоаминов, два иона: основной и подтверждающий ионы m/z, соотношение интенсивностей сигналов основного и подтверждающего ионов.
Республика Вьетнам. В Национальном институте контроля пищевых продуктов исследования выполнены методом QuEChERS ГХ-МС/МС. Метод экстракции был разработан на основе подхода QuEChERS, модифицированного из исследования Lehotay et al. [13]. Процедуру экстракции и очистки проводили следующим образом: 5 г гомогенизированных образцов помещали в центрифужные пробирки объемом 50 см3, добавляли 50 мкм3 раствора внутреннего стандарта 10 мкг/см3, выдерживали 15 мин. Затем добавляли 15 см3 смеси ацетонитрила и воды (50:50, об/об), а затем 5,5 г NH4Cl. После интенсивного перемешивания в течение 1 мин обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. 2 см3 супернатанта переносили в пробирку объемом 15 см3, которая содержала 300 мг безводного сульфата магния и 100 мг сорбента С18. После добавления 2 см3 н-гексана пробирку энергично перемешивали и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. Слой н-гексана удаляли и 0,5 см3 ацетонитрила переносили в ампулу, которая содержала 0,5 см3 дихлорметана. Затем 1 мкм3 дихлорметана впрыскивали в систему ГХ-МС/МС, которая состояла из газового хроматографа 7890 и масс-спектрометра 7000B (Agilent, США). Для разделения N-нитрозоаминов использовали колонку DB-1701 (Supelco, США). Режим программирования температуры колонки: первоначально температуру устанавливали на 50 °C и выдерживали в течение 1 мин, затем температуру увеличивали до 160 °С со скоростью 10 °С/мин; от 160 до 250 °С со скоростью 30 °С/мин. Общее время анализа составляло 16 мин.
При настройке MS/MS использовали положительный режим ионизации EI (70 эВ). С целью повышения чувствительности и селективности анализа настройки мониторинга множественных реакций (MRM) были оптимизированы: для каждого N-нитрозоамина и внутреннего стандарта выбраны два иона. Ион N-нитрозоамина с более высокой интенсивностью был использован для количественной оценки, другой ион был использован для подтверждения его присутствия в анализируемой пробе. Для количественной оценки N-нитрозодиметиламина в образцах консервов использовали основной ион m/z 74 и подтверждающий m/z 42.
Оценку содержания суммы N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин), обнаруженных в образцах детских мясорастительных консервов, выполняли относительно допустимого уровня, установленного ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" (приложение 3. Гигиенические требования безопасности к пищевой продукции).
Результаты и обсуждение
Российская Федерация. Результаты исследований образцов детских мясорастительных консервов, полученные в лаборатории методов газовой хроматографии Федерального центра г. Перми, приведены в табл. 1.
Анализ результатов исследований (см. табл. 1) показал, что максимальное количество N-нитрозоаминов обнаружено в образце № 1 (овощи и рис с цыпленком). Наиболее высокое содержание N-нитрозодиметиламина также отмечено в образце № 1, которое превышало содержание контаминанта в образцах № 2 и 3 соответственно в 1,3 и 1,2 раза. В образце № 1 обнаружены N-морфолиннитрозоамин и N-дифенилнитрозоамин.
Хроматограмма N-нитрозоаминов, обнаруженных в образце № 1, представлена на рис. 1.
Анализ полученных результатов (см. табл. 1) показал, что в образце мясорастительных консервов № 1 (овощи и рис с цыпленком) обнаружены N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин. Присутствие N-нитрозодиметиламина в образце № 1 подтверждено получением масс-спектра, что позволило провести его идентификацию с библиотечным масс-спектром. Масс-спектрограмма сравнения масс-спектра N-нитрозодиметиламина, обнаруженного в образце № 1, с библиотечным спектром по характеристическим ионам (m/z 74, 42) представлена на рис. 2.
Соотношение интенсивностей сигнала основного и подтверждающего ионов N-нитрозодиметиламина показано на масс-спектрограмме (рис. 3).
Наличие на масс-хроматограмме пиков с точно заданной массой (m/z=74, 42), временем удерживания (7,255 мин) для N-нитрозодиметиламина и соотношение интенсивностей подтверждающего и основного ионов 70% являются подтверждением его присутствия в исследуемом образце № 1.
Анализ результатов количественного определения N-нитрозоаминов в детских мясорастительных консервах в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) показал, что превышений допустимого уровня по сумме N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин) 0,001 мг/кг согласно ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" не обнаружено. Вместе с тем в исследуемых образцах установлено наличие ряда N-нитрозоаминов: (N-метилэтилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин, N-пирроли-диннитрозоамин и N-дифенилнитрозоамин) в диапазоне концентраций 0,00040,0026 мг/кг (см. табл. 1). Содержание этих соединений в мясорастительных консервах для детей в РФ в настоящее время не регламентировано.
Республика Вьетнам. Результаты исследований образцов детских мясорастительных консервов вьетнамских производителей, полученные в лаборатории национального института контроля пищевых продуктов Республики Вьетнам, приведены в табл. 2.
Анализ результатов исследований (см. табл. 2) показал, что максимальное количество N-нитрозоаминов обнаружено в образцах № 1 и 2. При этом во всех исследуемых образцах наиболее высоким было содержание N-нитрозодиметиламина. Содержание N-метилэтилнитрозоамина, N-пиперидиннитрозоамина, N-пирролидинамина и N-морфолиннитрозоамина в анализируемых образцах не обнаружено.
Хроматограммы стандартной смеси 9 N-нитрозоаминов и образца мясорастительных консервов, который содержал N-нитрозоамины, представлены на рис. 4.
Идентификацию N-нитрозоаминов, обнаруженных в образце детских мясорастительных консервов методом ГХ-МС/МС, проводили по хроматограмме стандартного раствора с учетом параметров удерживания соединений (см. рис. 4). Совпадение времени удерживания N-нитрозоаминов, обнаруженных в образце детских мясорастительных консервов, с N-нитрозоаминами стандартного раствора свидетельствует об идентичности анализируемых соединений в образце и стандартном растворе.
Сравнение основных валидационных характеристик методик анализа, применяемых в лабораториях методов газовой хроматографии Федерального центра г. Перми и Национального института контроля пищевой продукции Республики Вьетнам (табл. 3), позволяет сделать вывод о том, что методики достоверны и сопоставимы по таким метрологическим показателям, как точность (характеристика погрешности) и нижний предел количественного определения.
Методика анализа N-нитрозоаминов в детских мясорастительных консервах лаборатории газовой хроматографии института контроля пищевой продукции Республики Вьетнам предусматривает экстракцию органическим растворителем на основе подхода QuEChERS с последующим анализом методом ГХ-МС/МС. Следует отметить длительность и трудоемкость выполнения подготовки проб мясорастительных консервов к химическому анализу.
Высокая эффективность, селективность и чувствительность методики определения содержания N-нитрозоаминов в детских мясорастительных консервах Федерального центра г. Перми достигнута использованием автоматической системы ТФЭ на этапе пробоподготовки пищевого продукта. Преимуществами этого метода является то, что все этапы пробоподготовки выполняются селективно, мешающие компоненты и целевые соединения отделяются от матрицы, в результате чего происходит высокоэффективное извлечение и наблюдается хорошая воспроизводимость результатов анализа.
Использование ГХ/МС низкого разрешения и применение автоматической системы ТФЭ позволило выйти на высокую сопоставимость результатов химического анализа N-нитрозоаминов в детских мясорастительных консервах, полученных в лаборатории Федерального центра г Перми и института контроля пищевых продуктов Республики Вьетнам.
Полученные в разных лабораториях результаты химического анализа N-нитрозоаминов показали хорошую воспроизводимость. Так, содержание N-нитрозодиметиламина обнаружено в 3 анализируемых образцах в диапазоне концентраций от 0,00045 до 0,00077 мг/кг обеими методиками. Анализ полученных результатов исследований подтвердил эффективность разработанной в Федеральном центре г. Перми ГХ/МС-методики с использованием автоматической системы ТФЭ на этапе пробоподготовки.
Выводы
1. В процессе исследований, выполненных в лаборатории Центра и института контроля пищевых продуктов Республики Вьетнам, образцов консервированных мясорастительных продуктов для детского питания выявлены химические загрязнители N-нитрозоамины: N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин, N-метилэтилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин, N-пирролидин-нитрозоамин, N-морфолиннитрозоамин и N-дифенилнитрозоамин, не превышающие предельно допустимые уровни, но требующие их гигиенической оценки.
2. Анализ полученных данных показал, что превышений допустимого уровня в образцах мясорастительных консервов по сумме N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин) 0,001 мг/кг (согласно ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции") не установлено.
3. Сопоставлены результаты определения содержания N-нитрозоаминов в детском питании производителей Вьетнама, полученные двумя методиками. N-нитрозодиметиламин обнаружен во всех анализируемых образцах в диапазоне концентраций от 0,00045 до 0,00077 мг/кг обоими методиками. Эти результаты подтвердили, что обе методики сопоставимы и имеют хорошие валидационные характеристики для определения N-нитрозоаминов в детском питании.
4. Полученные данные указывают на необходимость дальнейших исследований содержания химических веществ в продуктах для детского питания с целью обоснования методических подходов к анализу риска одновременного воздействия химических контаминантов на здоровье детского населения. В связи с этим представляется чрезвычайно важным и актуальным вопрос гигиенической регламентации содержания изучаемых соединений в продуктах для детского питания.
Полученные результаты могут использоваться для совершенствования государственного санитарно-эпидемиологического контроля и надзора, а также для принятия управленческих решений.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.