Rats’ reproductive function under toxic load against the background of protein deficiency

• Svetlana I. Shestakova
• Angelina A. Stankevich
• Darina S. Kotova
• Marina D. Trebukh
• Nikolay S. Nikitin
• Elvira O. Sadykova
• Nadezhda V. Tyshko

Abstract

Safety assessment approaches of novel food, currently adopted in the Russian Federation, imply mandatory in vivo reproductive toxicity tests with the study of reproductive function and offspring development in order to obtain comprehensive evidence of the absence of distant adverse effects that may manifest only in the next generation. Comprehensive study of reproductive function, pre- and postnatal offspring development, as a rule, includes the research of a large number of parameters, all of which has a wide range of physiological fluctuations, and the heterogeneous distribution of some parameters’ values complicates the interpretation of the results.

The purpose of the study was to investigate the efficiency of a reduced adaptive potential model in rats, based on decreased diet protein intake, for the use in reproductive toxicity experiments.

Material and methods. The research lasting 155 days was carried out on rats of F₀ (180 females and 90 males) and F₁ (773 pups, 456 fetuses) generations. Animals of parental generation F₀ were divided into 3 groups – control, the 1^st and the 2^nd test groups, 30 males and 60 females in each. The initial age of F₀ rats was 28–35 days. Animals of all groups during growth and sexual maturation (25–90 days of life) received a diet with reduced protein content (9.4 g per 100 g of diet, which is 9% in calorie value). After reaching the age of physiological maturity (100 days) rats were transferred to a diet with lower protein content (6.1 g per 100 g of diet, 6% in calorie value), and received this diet during mating, pregnancy and feeding of F₁ offspring. The rats of the test groups received with feed the model herbicide glyphosate (isopropylamine salt, concentration 360 g/l) at a dose of 0.3 g/kg body weight (6% of LD₅₀): the 1^st test group – from day 70 of life, the 2^nd test group – from day 30 of life throughout the duration of the experiment. Reproductive function was evaluated by the fertility of F₀ animals and by the character of prenatal and postnatal development of F1 offspring.

Results. The toxic factor’s influence on the background of reduced protein supply did not lead to complex changes in the reproductive function of rats, the test groups differed from the control group only by the post-implantation loss and the mean litter size in the postnatal period: post-implantation loss in the 1^st and the 2^nd test groups was higher than normal, exceeding the value of this indicator in the control group (4.7±1.6%) by 3.1 (p<0.05) и 2.2 (р>0.05) times; the mean litter size in the 1^st and the 2^nd test groups was by 15.8 and 21.3% (р<0.05) lower than in the control group. Survival rate of offspring during the 1^st month of life in all groups was at least 72%, which corresponds to the lower limit of the norm characteristic for Wistar rats.

Conclusion. The use of the alimentary model of adaptation potential reduction based on diet protein deficiency does not consider appropriate in reproductive toxicity studies, since it does not increase either the severity of the reaction to toxic effects or the reliability of the results obtained. This model can be recommended for subacute toxicological studies of low-toxicity objects, in particular, when assessing the safety of novel food.

Keywords: toxicological studies; reproductive function; offspring development; alimentary model of adaptation potential reduction; diet’s protein deficiency; novel food

References

1. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Loginova M.S. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo. J Toxicol. 2020; 2020 (1): 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630

2. Nikitin N.S., Tyshko N.V. Rats’ liver morphological features under conditions of different supply of vitamins and minerals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 70–9. DOI: DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79 (in Russian)

3. Tsatsakis A., Tyshko N.V., Goumenou M., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M., et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats. Food Chem Toxicol. 2021; 152: 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188

4. Makarova M.N., Makarov V.G., Rybakova A.V., Zozulya O.K. Nutrition of laboratory animals. Basic diets. Report. Mezhdunarodniy vestnik veterinarii [International Journal of Veterinary Medicine]. 2017; (2): 91–105. (in Russian)

5. Van Bruggen A.H., He M.M., Shin K., Mai V., Jeong K.C., Finckh M.R., et al. Environmental and health effects of the herbicide glyphosate. Sci Total Environ. 2018; 616: 255–68. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.10.309

6. Thanomsit C., Saowakoon S., Wattanakornsiri A., Nanuam J., Prasatkaew W., Nanthanawat P., et al. The glyphosate (Roundup): fate in aquatic environment, adverse effect and toxicity assessment in aquatic organisms. Naresuan University Journal: Science and Technology (NUJST). 2020; 28 (1): 65–81. DOI: https://doi.org/10.14456/nujst.2020.7

7. Durnev A.D., Smol’nikova N.M., Skosyreva A.M., Nemova E.P., Solomina A.S., Shrede O.V., et al. Guidelines for the study of reproductive toxicity of drugs. In: Mironov A.N. (ed.). Manual for Preclinical Studies of New Pharmacological Substances. Moscow, Grif i K, 2012: 80–93. (in Russian)

8. Riffenburgh R.H., Gillen D.L. Statistics in Medicine. Elsevier Academic Press, 2020: 822 p. ISBN: 9780128153284.

9. Suckow M.A., Wilson R.P., Hankenson F.C., Foley P.L. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, 2019. ISBN: 978-0-12-814338-4. DOI: https://doi.org/10.1016/C2017-0-01188-6

10. Huang Z., Hu Y. Dietary patterns and their association with breast milk macronutrient composition among lactating women. Int Breastfeed J. 2020; 15 (1): 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s13006-020-00293-w

11. Xi Q., Liu W., Zeng T., Chen X., Luo T., Deng Z. Effect of different dietary patterns on macronutrient composition in human breast milk: a systematic review and meta-analysis. Nutrients. 2023; 15 (3): 485. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15030485

12. Adhikari S., Kudla U., Nyakayiru J., Brouwer-Brolsma E.M. Maternal dietary intake, nutritional status and macronutrient composition of human breast milk: systematic review. Br J Nutr. 2022; 127 (12): 1796–820. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114521002786

13. Nikitin N.S Results of morphological studies of rat liver in experiments with low protein content in the diet. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 69–70. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-063 (in Russian)

14. Pashorina V.A., Nikitin N.S., Tyshko N.V. Reference values of the internal organs’ weight of rats fed diets with gradually decreasing protein content. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 71–2. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-066 (in Russian)

Зоометрические показатели и масса внутренних органов плодов варьировали в пределах физиологической нормы, плоды опытных групп не имели достоверных отличий от плодов контрольной группы (табл. 2).

При обследовании плодов всех групп по методу Wilson аномалий развития внутренних органов не выявлено. Формирование основных анатомических систем протекало без особенностей. Обзорные исследования скелета по методу Dawson не выявили аномалий развития скелета плодов контрольной и опытных групп. Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа плодов 1-й и 2-й опытных групп не имела достоверных отличий от контроля.

При анализе постнатального развития крысят было выявлено значимое снижение средней величины пометов у крыс 1-й и 2-й опытных групп по сравнению с контрольными животными - на 15,8% (р<0,05) и 21,3% (р<0,05) соответственно (табл. 3). Принимая во внимание, что диапазон нормы для данного показателя составляет 10,6-14,6 крысят в помете, средняя величина пометов в обеих опытных группах была ниже нормы. Выживаемость потомства в течение 1-го месяца жизни во всех группах составляла 72,3%, что соответствует нижней границе нормы, характерной для крыс линии Вистар [9].

Комплексное изучение постнатального онтогенеза потомства F₁ в течение 1-го месяца жизни выявило значительное отставание развития крысят всех групп от нормы - по морфофункциональным показателям (динамика массы тела и краниокаудального размера) (табл. 4) и показателям физического развития (отлипание ушных раковин, открытие глаз и т.п.) (табл. 5); отставание от нормы составляло от 38,4 до 121,5%. При этом различия между группами были незначительны, например: масса тела крысят 1-й опытной группы на 2-й и 25-й дни жизни была выше, чем у крысят контрольной группы, на 2,7 и 6,6% (р<0,05) соответственно. Краниокаудальный размер крысят 1-й опытной группы не имел значимых отличий от контроля. Масса тела крысят 2-й опытной группы на протяжении всего периода наблюдений была ниже, чем у контрольных: на 2-10-й дни - на 2,5-4,3% (р<0,05), на 15-25-й дни - на 1,0-4,9% (р>0,05). Краниокаудальный размер крысят 2-й опытной группы на 5-25-й дни жизни был на 2,4-3,1% (р<0,05) ниже, чем у крысят контрольной группы.

На основании полученных результатов можно предположить, что превалирующее воздействие на отставание роста и развития крысят 1-го месяца жизни имеет обеспеченность белком, а не токсический фактор. В период вскармливания потомства самки получали рацион с 6% содержанием белка, и поскольку, согласно данным литературы [10-12], состав грудного молока коррелирует с составом рациона в части долевого распределения макронутриентов, очень высока вероятность снижения пищевой ценности молока на протяжении всего периода лактации.

Действие токсического фактора на фоне пониженной обеспеченности белком не приводило к комплексным изменениям репродуктивной функции крыс, опытные группы отличались от контрольной только по показателю постимплантационной гибели и среднему размеру пометов в постнатальный период развития. Анализ полученных данных в совокупности с результатами подострого токсикологического эксперимента на самцах крыс линии Вистар, также получавших модельный токсикант глифосат на фоне низкобелковых рационов [13, 14], свидетельствует о сокращении эффективности использования данной алиментарной модели снижения адаптационного потенциала в ряду подострые токсикологические исследования → репротоксикологические исследования. Примечательно, что алиментарная модель снижения адаптационного потенциала за счет дефицита витаминов группы В, солей железа и магния демонстрировала обратную последовательность: репротоксикологические исследования → подострые токсикологические исследования [1-3].

Заключение

Использование в репротоксикологических исследованиях алиментарной модели снижения адаптационного потенциала лабораторных животных, основанной на дефиците белка в рационе, не представляется целесообразным, поскольку не повышает ни выраженность реакции на токсическое воздействие, ни достоверность получаемых результатов. Данная модель может быть рекомендована для подострых токсикологических исследований малотоксичных объектов, в частности при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Литература

1. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Loginova M.S. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo // J. Toxicol. 2020. Vol. 2020, N 1. Article ID 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630

2. Никитин Н.С., Тышко Н.В. Морфологические особенности печени крыс в условиях разной обеспеченности витаминами и минеральными веществами // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 70-79. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79

3. Tsatsakis A., Tyshko N.V., Goumenou M., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M. et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats // Food Chem. Toxicol. 2021. Vol. 152. Article ID 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188

4. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Рыбакова А.В., Зозуля О.К. Питание лабораторных животных. Основные рационы. Сообщение // Международный вестник ветеринарии. 2017. № 2. С. 91-105.

5. Van Bruggen A.H., He M.M., Shin K., Mai V., Jeong K.C., Finckh M.R. et al. Environmental and health effects of the herbicide glyphosate // Sci. Total Environ. 2018. Vol. 616. Р. 255-268. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.10.309

6. Thanomsit C., Saowakoon S., Wattanakornsiri A., Nanuam J., Prasatkaew W., Nanthanawat P. et al. The glyphosate (Roundup): fate in aquatic environment, adverse effect and toxicity assessment in aquatic organisms // Naresuan University Journal: Science and Technology (NUJST). 2020. Vol. 28, N 1. P. 65-81. DOI: https://doi.org/10.14456/nujst.2020.7

7. Дурнев А.Д., Смольникова Н.М., Скосырева А.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Шреде О.В. и др. Методические рекомендации по изучению репродуктивной токсичности лекарственных средств // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / отв. ред. А.Н. Миронов. Москва : Гриф и К, 2012. С. 80-93.

8. Riffenburgh R.H., Gillen D.L. Statistics in Medicine. Elsevier Academic Press, 2020. 822 p. ISBN: 9780128153284.

9. Suckow M.A., Wilson R.P., Hankenson F.C., Foley P.L. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, 2019. ISBN: 978-0-12-814338-4. DOI: https://doi.org/10.1016/C2017-0-01188-6

10. Huang Z., Hu Y. Dietary patterns and their association with breast milk macronutrient composition among lactating women // Int. Breastfeed. J. 2020. Vol. 15, N 1. P. 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s13006-020-00293-w

11. Xi Q., Liu W., Zeng T., Chen X., Luo T., Deng Z. Effect of different dietary patterns on macronutrient composition in human breast milk: a systematic review and meta-analysis // Nutrients. 2023. Vol. 15, N 3. P. 485. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15030485

12. Adhikari S., Kudla U., Nyakayiru J., Brouwer-Brolsma E.M. Maternal dietary intake, nutritional status and macronutrient composition of human breast milk: systematic review // Br. J. Nutr. 2022. Vol. 127, N 12. P. 1796-1820. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114521002786

13. Никитин Н.С. Результаты морфологических исследований печени крыс в экспериментах с низким содержанием белка в рационе // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 69-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-063

14. Пашорина В.А., Никитин Н.С., Тышко Н.В. Формирование референсных значений массы внутренних органов крыс, получавших рационы с последовательно снижавшимся содержанием белка // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 71-72. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-066

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.