Репродуктивная функция крыс в условиях токсической нагрузки на фоне белковой недостаточности

Шестакова Светлана Игоревна; Станкевич Ангелина Андреевна; Котова Дарина Сергеевна; Требух Марина Дмитриевна; Никитин Николай Сергеевич; Садыкова Эльвира Олеговна; Тышко Надежда Валерьевна

Резюме

Подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида, принятые в настоящее время в Российской Федерации, предполагают обязательное проведение репротоксикологических исследований с изучением репродуктивной функции и развития потомства подопытных животных, с целью получения исчерпывающих доказательств отсутствия отдаленных негативных последствий, которые могут проявиться только в следующем поколении. Комплексное изучение репродуктивной функции, пре- и постнатального развития потомства, как правило, включает исследование большого числа параметров, каждый из которых имеет широкий диапазон физиологических колебаний, при этом неоднородное распределение значений некоторых показателей усложняет интерпретацию результатов.

Цель исследования - изучение эффективности модели снижения адаптационного потенциала у крыс, основанной на сокращении поступления белка с рационом, для применения в экспериментах по изучению репродуктивной токсичности.

Материал и методы. Исследования продолжительностью 155 дней проведены на крысах поколений F₀ (180 самок и 90 самцов) и F₁ (773 крысенка, 456 плодов). Животные родительского поколения F₀ были разделены на 3 группы - контрольная, 1-я и 2-я опытные, по 30 самцов и 60 самок в каждой. Исходный возраст крыс F₀ составлял 28-35 дней. Животные всех групп в период роста и полового созревания (25-90-й дни жизни) получали рацион со сниженным содержанием белка (9,4 г на 100 г рациона, что составляет 9% по калорийности), после достижения ими возраста физиологической зрелости (100 дней) крысы были переведены на рационы с более низким содержанием белка (6,1 г на 100 г рациона, 6% по калорийности) и получали этот рацион на протяжении ссаживания, беременности и вскармливания потомства F₁. Крысы опытных групп получали с кормом модельный гербицид глифосат (изопропиламинная соль, концентрация 360 г/л) в дозе 0,3 г/кг массы тела (6% от LD₅₀): 1-я опытная группа - с 70-го дня жизни, 2-я опытная группа - с 30-го дня жизни на протяжении всего срока эксперимента. Репродуктивную функцию оценивали по фертильности животных F₀ и по характеру пренатального и постнатального развития потомства F₁.

Результаты. Действие токсического фактора на фоне пониженной обеспеченности белком не приводило к комплексным изменениям репродуктивной функции крыс, опытные группы отличались от контрольной только по показателю постимплантационной гибели и среднему размеру пометов в постнатальный период развития: постимплантационная гибель в 1-й и 2-й опытных группах была выше нормы, превышая величину данного показателя у крыс контрольной группы (4,7±1,6%) в 3,1 (p<0,05) и 2,2 (р>0,05) раза; средний размер пометов у крыс 1-й и 2-й опытных групп был на 15,8 и 21,3% (р<0,05) ниже, чем в контрольной группе (11,3±0,6). Выживаемость потомства в течение 1-го месяца жизни во всех группах составляла не менее 72%, что соответствует нижней границе нормы, характерной для крыс линии Вистар.

Заключение. Использование в репротоксикологических исследованиях алиментарной модели снижения адаптационного потенциала лабораторных животных, основанной на дефиците белка в рационе, не представляется целесообразным, поскольку не повышает ни выраженность реакции на токсическое воздействие, ни достоверность получаемых результатов. Данная модель может быть рекомендована для подострых токсикологических исследований малотоксичных объектов, в частности при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Ключевые слова: токсикологические исследования; репродуктивная функция; развитие потомства; алиментарная модель снижения адаптационного потенциала; дефицит белка в рационе; пищевая продукция нового вида

Концепция зеленой экономики, в последнее десятилетие являющаяся одним из стратегических приоритетов большинства развитых стран, определила повышение интереса к альтернативным источникам пищевого белка, полученного из насекомых, микроорганизмов и других нетрадиционных объектов. В русле данного тренда утверждено Решение Высшего Евразийского экономического совета от 11 декабря 2020 г. № 12, определяющее направления развития евразийской экономической интеграции до 2025 г., в том числе экономического сотрудничества в сфере зеленых технологий и защиты окружающей среды. Такая трансформация будет способствовать переходу Евразийского экономического союза (ЕАЭС) к новому технологическому укладу, выходу на траекторию устойчивого развития, сопровождающегося внедрением новых экологических и промышленных технологий.

В соответствии с законодательством ЕАЭС нетрадиционные пищевые продукты относятся к продукции нового вида, подлежащей государственной регистрации на основании данных о ее безопасности. Сложившаяся практика оценки безопасности такой продукции предполагает получение исчерпывающих доказательств отсутствия недопустимого риска, связанного с вредным воздействием нового продукта на потребителей и будущие поколения. Именно поэтому важнейшими этапами комплексной оценки безопасности пищевой продукции нового вида являются токсикологические исследования и изучение репродуктивной токсичности, проводимые в соответствии с отечественными и международными требованиями [1].

Комплексная оценка репродуктивной функции, пре- и постнатального развития потомства, как правило, включает изучение большого числа параметров, и каждый из них имеет широкий диапазон физиологических колебаний [1]. Перспективным инструментом повышения диагностической достоверности экспериментальных данных является моделирование дополнительной нагрузки, снижающей адаптационный потенциал подопытных животных. Поскольку одним из наиболее простых и результативных способов снижения адаптационного потенциала является модификация состава рациона, в ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" были проведены исследования, результатом которых стало создание алиментарной модели, повышающей восприимчивость организма к действию токсических факторов за счет снижения обеспеченности витаминами группы В (В₁, В₂, В₃, В₆) и минеральными веществами (Fe³⁺ и Mg²⁺). Преимущества использования модели, позволяющей отличить физиологическую адаптацию от компенсированного скрытого патологического процесса и выявить влияние малотоксичных объектов, были подтверждены в нескольких сериях экспериментов, результаты которых опубликованы ранее [1-3].

Цель данной работы - изучение эффективности модели снижения адаптационного потенциала у крыс, основанной на сокращении поступления белка с рационом, для применения в экспериментах по изучению репродуктивной токсичности.

Материал и методы

Исследования продолжительностью 155 дней проведены на крысах поколений F₀ (180 самок и 90 самцов) и F₁ (773 крысенка, 456 плодов). Животные родительского поколения F₀ были разделены на 3 группы - контрольная, 1-я и 2-я опытные, по 30 самцов и 60 самок в каждой. Исходный возраст крыс F₀ составлял

28-35 дней. Животные всех групп в период роста и полового созревания (25-90-й дни жизни) получали рацион [4] со сниженным содержанием белка (9,4 г на 100 г рациона, что составляет 9% по калорийности), после достижения ими возраста физиологической зрелости (100 дней) крысы были переведены на рационы с более низким содержанием белка (6,1 г на 100 г рациона, 6% по калорийности) и получали этот рацион на протяжении ссаживания, беременности и вскармливания потомства F₁. Крысы опытных групп получали с кормом модельный токсикант - гербицид глифосат (изопропиламинная соль, концентрация 360 г/л), чье действие на репродуктивную функцию подробно охарактеризовано в [5, 6], в дозе 0,3 г на 1 кг массы тела (6% от LD₅₀): 1-я опытная группа - с 70-го дня жизни, 2-я опытная группа - с 30-го дня жизни на протяжении всего срока эксперимента. Схема эксперимента представлена на рисунке.

Репродуктивную функцию оценивали по фертильности самцов и самок F₀ и по характеру пре- и постнатального развития потомства F₁. Работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33215-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами".

Фертильность (способность к оплодотворению) определяли по эффективности спаривания (% отношение забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов) и эндокринной функции яичников (содержание эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови беременных самок).

Для изучения пренатального развития потомства беременных самок F₀ из каждой группы подвергали эвтаназии на 20-й день беременности, подсчитывали количество желтых тел, количество мест резорбции и мест имплантации, определяли число живых и мертвых плодов, вычисляли пред- и постимплантационную гибель. Плоды извлекали, проводили макроскопический осмотр, определяли массу и краниокаудальный размер, исследовали по методам J.G. Wilson и A.B. Dawson [7].

Постнатальное развитие потомства F₁ оценивали в течение 1-го месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (массы тела и краниокаудального размера), общему физическому развитию [7]. Также определяли среднюю величину помета, вычисляли выживаемость потомства в 1-й месяц жизни [7].

Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. В течение эксперимента вели наблюдения за поедаемостью корма, массой тела и общим состоянием животных.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS 23.0 (IBM, США). Результаты приведены в виде М±m и min-max, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка, min и max - соответственно минимальное и максимальное значение измеряемой величины, а также в долях (процентах) или в абсолютных числах. Оценку достоверности различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали ранговый двухфакторный дисперсионный анализ. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05 [8].

Результаты и обсуждение

Общее состояние животных всех групп было удовлетворительным. К 100-му дню жизни, соответствующему оптимальному для спаривания возрасту физиологической зрелости, отмечались статистически значимые различия массы тела контрольной и опытных групп: масса тела самок контрольной группы составляла 252,7±2,6 г, самцов - 400,3±8,3 г, 1-й опытной группы - 224,5±1,4 и 320,8±5,3 г, 2-й опытной группы - 211,4±2,4 и 292,5±4,1 г соответственно. Масса тела самок 1-й и 2-й опытных групп была на 11,2 и 16,3% (р<0,05) ниже, чем у самок контрольной группы, самцов - на 19,9 и 26,9% (р<0,05) ниже, чем у контрольных животных.

Эффективность спаривания самок и самцов контрольной группы составляла 76,7 и 100%, 1-й опытной группы - 83,3 и 100%, 2-й опытной группы - 100 и 100% соответственно. Следует отметить, что группа, подвергавшаяся более продолжительному воздействию глифосата, демонстрировала беспрецедентно высокие показатели эффективности спаривания для самок: при данных условиях эксперимента (длительность ссаживания 7 дней) оптимальными значениями считаются 75-90%, поскольку продолжительность эстрального цикла у крыс составляет от 1,5 до 10 дней, и не все крысы достигают фазы эструса в отведенный период. Возможно, длительная экспозиция токсикантом оказала влияние на сокращение эстрального цикла, в результате чего все самки этой группы забеременели.

Общее состояние самок F₀ во время беременности было удовлетворительным, по внешнему виду и поведению самки контрольной и опытных групп не различались между собой, относительный прирост массы тела самок 1-й и 2-й опытных групп был несколько выше, чем у контрольных животных.

Обзорные макроскопические исследования внутренних органов беременных самок не выявили никаких патологических изменений ни в одной группе, массы внутренних органов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар. При изучении эндокринной функции гонад на 20-й день беременности не выявлено различий между группами, содержание половых гормонов находилось в пределах нормы.

Анализ пренатального развития потомства F₁ выявил, что по количеству желтых тел, мест имплантации и живых плодов самки контрольной и опытных групп не имели достоверных различий, тем не менее значения этих показателей у крыс 2-й опытной группы были несколько ниже нормы, характерной для крыс линии Вистар (табл. 1). Предимплантационная гибель эмбрионов во всех группах была несколько выше нормы, тогда как постимплантационная гибель была выше нормы в 1-й и 2-й опытных группах, превышая величину данного показателя у крыс контрольной группы в 3,1 и 2,2 раза соответственно.

Зоометрические показатели и масса внутренних органов плодов варьировали в пределах физиологической нормы, плоды опытных групп не имели достоверных отличий от плодов контрольной группы (табл. 2).

При обследовании плодов всех групп по методу Wilson аномалий развития внутренних органов не выявлено. Формирование основных анатомических систем протекало без особенностей. Обзорные исследования скелета по методу Dawson не выявили аномалий развития скелета плодов контрольной и опытных групп. Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа плодов 1-й и 2-й опытных групп не имела достоверных отличий от контроля.

При анализе постнатального развития крысят было выявлено значимое снижение средней величины пометов у крыс 1-й и 2-й опытных групп по сравнению с контрольными животными - на 15,8% (р<0,05) и 21,3% (р<0,05) соответственно (табл. 3). Принимая во внимание, что диапазон нормы для данного показателя составляет 10,6-14,6 крысят в помете, средняя величина пометов в обеих опытных группах была ниже нормы. Выживаемость потомства в течение 1-го месяца жизни во всех группах составляла 72,3%, что соответствует нижней границе нормы, характерной для крыс линии Вистар [9].

Комплексное изучение постнатального онтогенеза потомства F₁ в течение 1-го месяца жизни выявило значительное отставание развития крысят всех групп от нормы - по морфофункциональным показателям (динамика массы тела и краниокаудального размера) (табл. 4) и показателям физического развития (отлипание ушных раковин, открытие глаз и т.п.) (табл. 5); отставание от нормы составляло от 38,4 до 121,5%. При этом различия между группами были незначительны, например: масса тела крысят 1-й опытной группы на 2-й и 25-й дни жизни была выше, чем у крысят контрольной группы, на 2,7 и 6,6% (р<0,05) соответственно. Краниокаудальный размер крысят 1-й опытной группы не имел значимых отличий от контроля. Масса тела крысят 2-й опытной группы на протяжении всего периода наблюдений была ниже, чем у контрольных: на 2-10-й дни - на 2,5-4,3% (р<0,05), на 15-25-й дни - на 1,0-4,9% (р>0,05). Краниокаудальный размер крысят 2-й опытной группы на 5-25-й дни жизни был на 2,4-3,1% (р<0,05) ниже, чем у крысят контрольной группы.

На основании полученных результатов можно предположить, что превалирующее воздействие на отставание роста и развития крысят 1-го месяца жизни имеет обеспеченность белком, а не токсический фактор. В период вскармливания потомства самки получали рацион с 6% содержанием белка, и поскольку, согласно данным литературы [10-12], состав грудного молока коррелирует с составом рациона в части долевого распределения макронутриентов, очень высока вероятность снижения пищевой ценности молока на протяжении всего периода лактации.

Действие токсического фактора на фоне пониженной обеспеченности белком не приводило к комплексным изменениям репродуктивной функции крыс, опытные группы отличались от контрольной только по показателю постимплантационной гибели и среднему размеру пометов в постнатальный период развития. Анализ полученных данных в совокупности с результатами подострого токсикологического эксперимента на самцах крыс линии Вистар, также получавших модельный токсикант глифосат на фоне низкобелковых рационов [13, 14], свидетельствует о сокращении эффективности использования данной алиментарной модели снижения адаптационного потенциала в ряду подострые токсикологические исследования → репротоксикологические исследования. Примечательно, что алиментарная модель снижения адаптационного потенциала за счет дефицита витаминов группы В, солей железа и магния демонстрировала обратную последовательность: репротоксикологические исследования → подострые токсикологические исследования [1-3].

Заключение

Использование в репротоксикологических исследованиях алиментарной модели снижения адаптационного потенциала лабораторных животных, основанной на дефиците белка в рационе, не представляется целесообразным, поскольку не повышает ни выраженность реакции на токсическое воздействие, ни достоверность получаемых результатов. Данная модель может быть рекомендована для подострых токсикологических исследований малотоксичных объектов, в частности при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Литература

1. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Loginova M.S. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo // J. Toxicol. 2020. Vol. 2020, N 1. Article ID 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630

2. Никитин Н.С., Тышко Н.В. Морфологические особенности печени крыс в условиях разной обеспеченности витаминами и минеральными веществами // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 70-79. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79

3. Tsatsakis A., Tyshko N.V., Goumenou M., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M. et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats // Food Chem. Toxicol. 2021. Vol. 152. Article ID 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188

4. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Рыбакова А.В., Зозуля О.К. Питание лабораторных животных. Основные рационы. Сообщение // Международный вестник ветеринарии. 2017. № 2. С. 91-105.

5. Van Bruggen A.H., He M.M., Shin K., Mai V., Jeong K.C., Finckh M.R. et al. Environmental and health effects of the herbicide glyphosate // Sci. Total Environ. 2018. Vol. 616. Р. 255-268. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.10.309

6. Thanomsit C., Saowakoon S., Wattanakornsiri A., Nanuam J., Prasatkaew W., Nanthanawat P. et al. The glyphosate (Roundup): fate in aquatic environment, adverse effect and toxicity assessment in aquatic organisms // Naresuan University Journal: Science and Technology (NUJST). 2020. Vol. 28, N 1. P. 65-81. DOI: https://doi.org/10.14456/nujst.2020.7

7. Дурнев А.Д., Смольникова Н.М., Скосырева А.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Шреде О.В. и др. Методические рекомендации по изучению репродуктивной токсичности лекарственных средств // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / отв. ред. А.Н. Миронов. Москва : Гриф и К, 2012. С. 80-93.

8. Riffenburgh R.H., Gillen D.L. Statistics in Medicine. Elsevier Academic Press, 2020. 822 p. ISBN: 9780128153284.

9. Suckow M.A., Wilson R.P., Hankenson F.C., Foley P.L. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, 2019. ISBN: 978-0-12-814338-4. DOI: https://doi.org/10.1016/C2017-0-01188-6

10. Huang Z., Hu Y. Dietary patterns and their association with breast milk macronutrient composition among lactating women // Int. Breastfeed. J. 2020. Vol. 15, N 1. P. 52. DOI: https://doi.org/10.1186/s13006-020-00293-w

11. Xi Q., Liu W., Zeng T., Chen X., Luo T., Deng Z. Effect of different dietary patterns on macronutrient composition in human breast milk: a systematic review and meta-analysis // Nutrients. 2023. Vol. 15, N 3. P. 485. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15030485

12. Adhikari S., Kudla U., Nyakayiru J., Brouwer-Brolsma E.M. Maternal dietary intake, nutritional status and macronutrient composition of human breast milk: systematic review // Br. J. Nutr. 2022. Vol. 127, N 12. P. 1796-1820. DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114521002786

13. Никитин Н.С. Результаты морфологических исследований печени крыс в экспериментах с низким содержанием белка в рационе // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 69-70. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-063

14. Пашорина В.А., Никитин Н.С., Тышко Н.В. Формирование референсных значений массы внутренних органов крыс, получавших рационы с последовательно снижавшимся содержанием белка // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 71-72. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-066

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.