Борьба с глобальной пандемией COVID-19 выявила первостепенные задачи, необходимые для ограничения распространения возбудителя этой инфекции: вакцинация населения и формирование коллективного иммунитета популяции [1, 2]. Одним из факторов, лимитирующих эффективность вакцинации, является состояние иммунной системы человека. Поддержание гуморального и клеточного звеньев иммунной системы человека во многом зависит от оптимального рациона питания, отвечающего потребностям организма в макро- и микронутриентах, в минорных биологически активных веществах пищи. Иммуномодулирующие и противовоспалительные эффекты нутриентов в значительной степени обусловлены их антиоксидантным действием. К числу таких биологически активных соединений относится фикоцианин (PC), выделяемый из биомассы пищевой цианобактерии (сине-зеленой водоросли) Arthrospira platensis (A. platensis).
Фикобилины в составе A. platensis - это С-фикоцианин и аллофикоцианин, представляющие комплексы белков с пигментом - фикоцианобилином. Его небелковая часть - фикоцианобилин - представляет собой цепочку тетрапирролов, которые, в отличие от порфиринов гемоглобина и хлорофилла, не замкнуты в цикл и не имеют атомов металлов. Белковая часть фикоцианина состоит из 2 субъединиц α и β с гексамерной конформацией (αβ) 6 при pH 5,0-6,0 и тримерной конформацией (αβ) 3 при pH 7,0 [3, 4]. Известно также, что субъединицы могут образовывать димеры или более крупные, чем гексамеры, агрегаты. С белковой частью фикоцианобилин связан ковалентной тиоэфирной связью через НS-группы Cys84 α-цепи и через остатки Cys84 и Cys155 β-цепи. Следовательно, в одном комплексе фикоцианина может быть от 6 до 18 и больше хромофорных структур.
Фикоцианин представляет интерес не только как одобренный пищевой краситель, но и как биологически активный ингредиент для создания специализированных пищевых продуктов [5]. Однако из данных литературы известно, что хромофорная часть фикоцианина фото- и термолабильна и может подвергаться перестройке, в результате которой фикоцианин утрачивает биологическую ценность [6, 7].
Естественной защитой хромофорных соединений при создании специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище могут служить различные пищевые белки. В своей работе мы остановили выбор на 3 видах белков: казеин, белок молочной сыворотки, нефракционированный белок яйца. Эти протеины содержат полный набор незаменимых аминокислот в количестве, достаточном для биосинтеза белка в организме человека.
Протективная способность белков яйца и молока связана с их гетерогенностью и свойствами, обусловленными природой. Например, в белках яйца идентифицировано несколько фракций: овальбумин, овомукоид, овомуцин, овокональбумин и овоглобулин. Овальбумин и овомуцин в растворимой форме устойчивы к воздействию тепла. Овомукоид способен ингибировать трипсин и химотрипсин, а также подавлять протеазное действие грибков или бактерий. Кроме того, белки яйца могут связывать углеводы и биогенные минеральные вещества. Подобные свойства присущи и белкам молока. Казеиновые фракции термоустойчивы при нейтральных значениях среды. Белки молочной сыворотки могут образовывать комплексы с такими низкомолекулярными соединениями, как витамины, а также с углеводами и минеральными веществами.
Именно способность пищевых белков связывать небелковые компоненты предопределяет исследования, направленные на создание комплексов белков и биологически активных соединений. В таких комплексах белки могут быть полезны для защиты и сохранности биологически активных соединений от разрушения при хранении, в технологическом процессе, а возможно, и при переваривании в желудочно-кишечном тракте.
Цель работы заключалась в выявлении термозащитного действия белков яйца и молока в отношении фикоцианина путем использования методов колориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).
Материал и методы
Объектами исследования были сухой пищевой казеинат натрия (CasNa) с массовой долей белка 85% (ООО "Тагрис", РФ) по ГОСТ 33920-2016; сухой концентрат сывороточных белков молока (WPC) с массовой долей белка 80% (WPС-80) в сухом веществе (ООО "Тагрис молоко", РФ); сухой пищевой яичный белок (OVA) 90% (Ovopol Ltd., Польша); сухой концентрат фикоцианинов с суммарным содержанием С-фикоцианина и аллофикоцианина 49,0%, полученный из биомассы A. platensis (НПО "Биосоляр МГУ", РФ), как описано ранее [8]. Водный раствор фикоцианина с массовой долей 1% готовили из сухого концентрата.
Методология исследований включала:
- исследование термодинамических характеристик пищевых ингредиентов по отдельности и в комбинации с фикоцианином методом ДСК;
- спектроколориметрическую оценку изменения цвета растворов фикоцианина в процессе хранения.
Комбинации фикоцианина с белками готовили, смешивая равные объемы 1% водных растворов, с последующим термостатированием смесей при температуре 28±0,5 °C в течение 60 мин в шейкере-инкубаторе при скорости перемешивания 100 об/мин.
Исследования термодинамических характеристик образцов проводили ДСК с помощью прибора DSC-3 (Mettler Toledo, Швейцария). Образцы взвешивали в алюминиевых тиглях объемом 40 мкл с точностью 0,1 мг и укупоривали. Масса навесок в зависимости от образца составляла 3,0-7,0 мг. Нагрев образцов проводили в диапазоне от 25 до 200 °С со скоростью 5 °C/мин.
Измерение цвета проводили при помощи спектрофотометра BS7016 (3NH, Китай). Образцы хранили в течение 20 мин при температуре 50 °С. Оценку цветового допуска проводили по формуле:
)
где L1* , 2 - показатель светлоты, а1* , 2 - цвет в диапазоне от зеленого к красному, b1* , 2 - цвет в диапазоне от синего к желтому сравниваемых образцов.
Испытания образцов проводили в 3 повторностях. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ Microsoft Excel. Вычисляли среднее значение (М), стандартную ошибку среднего (m), данные представлены как M±m. Анализ полученных результатов методом главных компонент проводили с использованием пакета программ SensoMiner в среде R (версия 4.2.2).
Результаты и обсуждение
При проведении исследований были получены термограммы всех исследуемых образцов. На рис. 1 приведены кривые тепловых эффектов отдельных ингредиентов в диапазоне от 30 до 180 °C.
)
Тепловые эффекты, обнаруженные в данной области, характеризуют наличие лабильных структур в изучаемых образцах. Как видно на рис. 1, наиболее выраженный низкотемпературный эндотермический эффект (пик при 60 °C) характерен для образца концентрата сывороточных белков, что может соответствовать начальной температуре их денатурации [9]. Образец овальбумина имеет небольшой тепловой эффект при 70 и 100 °C, что характерно для пиков денатурации этого белка [10], а казеината натрия - при 132 °C аналогично результатам, представленным в [11]. Сухой образец фикоцианина в этой области имеет 2 пика при 80 и 121 °C и начало термической деструкции при 65 °C [12].
Наличие данных тепловых эффектов, на порядок меньших по сравнению с основными пиками, вероятно, объяснимо природой самих белков, являющихся гетерогенными объектами, которые имеют несколько фазовых переходов при нагревании. Кроме того, изучаемые образцы не были химически чистыми веществами, а представляли собой смесь различных соединений, которые также могут вносить свой вклад в формирование наблюдаемых эндотермических процессов.
Наиболее выраженными в изучаемом температурном диапазоне являются высокотемпературные пики, отражающие температуры денатурации и плавления изучаемых образцов (рис. 2).
Как видно из данных рис. 2, последовательность пиков в данной температурной области соответствует последовательности низкотемпературных пиков (WPC <OVA <PC <CasNa). Принимая во внимание существенно бо́льшие значения теплового потока в данном регионе (60 против 0,7 мВт) и, как следствие, бо́льшие соотношения сигнал-шум, оценку термической стабильности растворов фикоцианина в смеси с пищевыми белками проводили посредством анализа этого региона. Результаты измерения температур плавления растворов исследуемых образцов приведены в таблице.
)
Как видно из данных таблицы, температура деструкции изучаемых образцов варьирует в достаточно широком диапазоне.
Смешивание фикоцианина с исследуемыми белковыми препаратами приводило к существенному изменению температур пиков деструкции в сторону как повышения, так и понижения. Наиболее заметное снижение отмечено для овальбумина в комплексе с фикоцианином.
К значимому повышению температуры деструкции приводило сочетание фикоцианина с концентратом сывороточного белка, что согласуется с данными, полученными ранее [16]. Наблюдаемый эффект может быть связан с образованием комплекса фикоцианина с сывороточными белками, в котором последние оказывают защитное действие на термически лабильные компоненты смеси.
Учитывая результаты исследования методом ДСК, эксперимент по колориметрической оценке стабильности комплексов фикоцианина с различными белками проводили при 50 °C для исключения деградации белков при нагреве.
На рис. 3 показаны результаты сравнения окраски изучаемых образцов в цветовом пространстве CIELab по показателю допуска (ΔE), характеризующему отличия между цветом комплексов и образца фикоцианина. Интенсивность цветности всех образцов сравнивали со средним значением этого показателя для фикоцианина.
)
Как видно из представленных данных (см. рис. 3), растворы комплексов фикоцианина с белком существенно отличаются от контрольного образца (PC) по показателю цветности. В рамках шкалы использованного цветового пространства принято, что при ΔE<1 образцы не отличимы между собой, при 1 <ΔE <2 - различимы обученным экспертом, при 2 <ΔE <3,5 - различимы неподготовленными людьми [17]. Все исследуемые образцы характеризовались пороговым значением ΔE в районе 2 единиц, т.е. были визуально различимы сразу после приготовления.
Для описания различий в значениях аспектов цветов, результаты измерений были представлены в виде проекции на первые 2 главные компоненты (рис. 4).
)
Компоненты (Dim1, Dim2) описывают 92,81% всей вариации между образцами. Первая компонента преимущественно коррелирует со значением аспекта светлоты (L*), а вторая - с цветом сравниваемых образцов в диапазоне от синего к желтому (b*) (рис. 4А). Как видно из графика (рис. 4Б), образцы до и после нагрева имели существенные отличия в показателе светлоты. После нагрева для всех образцов была характерна общая тенденция к потемнению. Нагрев контрольного образца фикоцианина без белков характеризовался, кроме потемнения, существенным изменением окраски в области желто-синего спектра в сторону увеличения синего цвета (Δb* = -1,80±0,01), что может быть обусловлено изменением в структуре его хромофорных групп. Наименьшее и статистически значимое изменение цвета (тест Манна-Уитни: U=16, p=0,029) в диапазоне от синего к желтому отмечено для образца фикоцианина с концентратом белков молочной сыворотки (Δb* = 0,53±0,06), что в дополнение к полученным нами результатам термодинамических исследований подтверждает бо́льшую стабильность данного сочетания в условиях проведения эксперимента.
Таким образом, методами колориметрии и ДСК выявлены термозащитные эффекты белков яйца и молока в отношении фикоцианина. Поскольку на текущий период не существует эталонных значений таких эффектов и методических рекомендаций по оценке протективного действия белков относительно фикоцианинов, в связи с чем сравнить полученные данные с общепринятыми не представляется возможным, то научная новизна и практическая ценность работы заключается в получении информации о различной степени термозащитных эффектов белков молока и яйца по отношению к фикоцианинам.
Заключение
Проведенные исследования показали, что повышения термической стабильности фикоцианина возможно достичь при его сочетании с концентратом белков молочной сыворотки. Наблюдаемый протективный эффект сывороточных белков значительно превосходил защитное действие казеината натрия и овальбумина. Изучение окраски растворов фикоцианина при нагреве подтвердило меньшее изменение цвета образцов в диапазоне от синего к желтому в присутствии концентрата сывороточных белков. В целом полученные результаты указывают на более высокую стабильность хромофорных групп фикоцианина в модуле из сывороточных белков. Полученные данные можно использовать в перспективе для разработки новых форм функциональных пищевых ингредиентов, содержащих фикоцианин.