Выявление термозащитного действия пищевых белков в отношении фикоцианина

Билялова Анастасия Сергеевна; Бирюлина Надежда Александровна; Новокшанова Алла Львовна

Резюме

Одним из перспективных источников для создания специализированных пищевых продуктов является биомасса пищевой микроводоросли Arthrospira platensis. Биомасса A. platensis и ее водные экстракты используются в качестве источника биологически активных веществ, в первую очередь фикоцианинов - белковых макромолекул, во многом определяющих антиоксидантные, иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства этой цианобактерии. Хромофорная часть фикоцианина фото- и термолабильна и может подвергаться перестройке, в результате которой фикоцианин утрачивает биологическую ценность. Для защиты хромофорных соединений могут использоваться различные пищевые белки. В данной работе были изучены 2 вида белков в комплексе с фикоцианином: молочные и белок куриного яйца.

Цель исследования - выявление термозащитного действия белков яйца и молока в отношении фикоцианина путем использования методов колориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Материал и методы. В качестве объектов исследования использовали пищевой казеинат натрия, концентрат сывороточных белков молока, нефракционированный пищевой яичный белок и концентрат фикоцианинов. Комбинации фикоцианина с белками готовили путем смешивания равных объемов 1% водных растворов, с последующим термостатированием смесей при температуре 28±0,5 ^oC в течение 60 мин в шейкере-инкубаторе при скорости перемешивания 100 об/ мин. Исследования термодинамических характеристик образцов по отдельности и в комбинации с фикоцианином проводили методом дифференциальной сканирующей калориметрии при нагреве образцов от 25 до 200 °С со скоростью 5 °C/мин. Изменение цвета растворов фикоцианина в процессе хранения в течение 20 мин при температуре 50 °С оценивали методом спектроколориметрии.

Результаты. Наиболее выраженный низкотемпературный эндотермический эффект (пик при 60 °C) выявлен у образца концентрата сывороточных белков. Образец овальбумина имел небольшой тепловой эффект при 70 и 100 °C, а казеинат натрия - при 132 °C. Сухой образец фикоцианина имел 2 пика при 80 и 121 °C и начало термической деструкции при 65 °C. Температура деструкции раствора казеината натрия составила 100,8±1,3 °C, концентрата сывороточных белков - 113,7±0,8 °C. Водный раствор фикоцианина имел пик теплового эффекта при 103,3±1,7 °C. Смешивание фикоцианина с исследуемыми пищевыми белками приводило к изменению температур пиков деструкции. Наиболее заметное снижение отмечено для овальбумина в комплексе с фикоцианином (101,9±1,9 °C), что свидетельствует о снижении термической стабильности фикоцианина в присутствии этого белка. К значимому повышению температуры деструкции приводило сочетание фикоцианина с концентратом сывороточного белка - до 112,0±2,1 °C. По показателю цветности растворы комплексов фикоцианина с белком существенно отличались от водного раствора фикоцианина. Образцы имели пороговые значения по показателю цветового допуска (ΔE) в районе 2 единиц, т.е. были визуально различимы сразу после приготовления. Все образцы имели тенденцию к потемнению в процессе нагрева до 50 °C.

Заключение. Повышение термической стабильности фикоцианина возможно при его сочетании с концентратом белков молочной сыворотки. Наблюдаемое термозащитное действие концентрата белков молочной сыворотки значительно превосходило такой эффект от сочетания фикоцианина с казеинатом натрия и яичным белком. Изменение цвета растворов исследуемых комплексов при нагреве до 50 °C происходило в меньшей степени в присутствии концентрата сывороточных белков, что может свидетельствовать о большей сохранности хромофорных групп фикоцианина. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования концентратов белков молочной сыворотки для разработки новых форм функциональных пищевых ингредиентов, содержащих фикоцианин.

Ключевые слова: фикоцианин; яичный белок; казеинат натрия; сывороточные белки молока; дифференциально сканирующая калориметрия; спектроколориметрия

Борьба с глобальной пандемией COVID-19 выявила первостепенные задачи, необходимые для ограничения распространения возбудителя этой инфекции: вакцинация населения и формирование коллективного иммунитета популяции [1, 2]. Одним из факторов, лимитирующих эффективность вакцинации, является состояние иммунной системы человека. Поддержание гуморального и клеточного звеньев иммунной системы человека во многом зависит от оптимального рациона питания, отвечающего потребностям организма в макро- и микронутриентах, в минорных биологически активных веществах пищи. Иммуномодулирующие и противовоспалительные эффекты нутриентов в значительной степени обусловлены их антиоксидантным действием. К числу таких биологически активных соединений относится фикоцианин (PC), выделяемый из биомассы пищевой цианобактерии (сине-зеленой водоросли) Arthrospira platensis (A. platensis).

Фикобилины в составе A. platensis - это С-фикоцианин и аллофикоцианин, представляющие комплексы белков с пигментом - фикоцианобилином. Его небелковая часть - фикоцианобилин - представляет собой цепочку тетрапирролов, которые, в отличие от порфиринов гемоглобина и хлорофилла, не замкнуты в цикл и не имеют атомов металлов. Белковая часть фикоцианина состоит из 2 субъединиц α и β с гексамерной конформацией (αβ) 6 при pH 5,0-6,0 и тримерной конформацией (αβ) 3 при pH 7,0 [3, 4]. Известно также, что субъединицы могут образовывать димеры или более крупные, чем гексамеры, агрегаты. С белковой частью фикоцианобилин связан ковалентной тиоэфирной связью через НS-группы Cys₈₄ α-цепи и через остатки Cys₈₄ и Cys₁₅₅ β-цепи. Следовательно, в одном комплексе фикоцианина может быть от 6 до 18 и больше хромофорных структур.

Фикоцианин представляет интерес не только как одобренный пищевой краситель, но и как биологически активный ингредиент для создания специализированных пищевых продуктов [5]. Однако из данных литературы известно, что хромофорная часть фикоцианина фото- и термолабильна и может подвергаться перестройке, в результате которой фикоцианин утрачивает биологическую ценность [6, 7].

Естественной защитой хромофорных соединений при создании специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище могут служить различные пищевые белки. В своей работе мы остановили выбор на 3 видах белков: казеин, белок молочной сыворотки, нефракционированный белок яйца. Эти протеины содержат полный набор незаменимых аминокислот в количестве, достаточном для биосинтеза белка в организме человека.

Протективная способность белков яйца и молока связана с их гетерогенностью и свойствами, обусловленными природой. Например, в белках яйца идентифицировано несколько фракций: овальбумин, овомукоид, овомуцин, овокональбумин и овоглобулин. Овальбумин и овомуцин в растворимой форме устойчивы к воздействию тепла. Овомукоид способен ингибировать трипсин и химотрипсин, а также подавлять протеазное действие грибков или бактерий. Кроме того, белки яйца могут связывать углеводы и биогенные минеральные вещества. Подобные свойства присущи и белкам молока. Казеиновые фракции термоустойчивы при нейтральных значениях среды. Белки молочной сыворотки могут образовывать комплексы с такими низкомолекулярными соединениями, как витамины, а также с углеводами и минеральными веществами.

Именно способность пищевых белков связывать небелковые компоненты предопределяет исследования, направленные на создание комплексов белков и биологически активных соединений. В таких комплексах белки могут быть полезны для защиты и сохранности биологически активных соединений от разрушения при хранении, в технологическом процессе, а возможно, и при переваривании в желудочно-кишечном тракте.

Цель работы заключалась в выявлении термозащитного действия белков яйца и молока в отношении фикоцианина путем использования методов колориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Материал и методы

Объектами исследования были сухой пищевой казеинат натрия (CasNa) с массовой долей белка 85% (ООО "Тагрис", РФ) по ГОСТ 33920-2016; сухой концентрат сывороточных белков молока (WPC) с массовой долей белка 80% (WPС-80) в сухом веществе (ООО "Тагрис молоко", РФ); сухой пищевой яичный белок (OVA) 90% (Ovopol Ltd., Польша); сухой концентрат фикоцианинов с суммарным содержанием С-фикоцианина и аллофикоцианина 49,0%, полученный из биомассы A. platensis (НПО "Биосоляр МГУ", РФ), как описано ранее [8]. Водный раствор фикоцианина с массовой долей 1% готовили из сухого концентрата.

Методология исследований включала:

- исследование термодинамических характеристик пищевых ингредиентов по отдельности и в комбинации с фикоцианином методом ДСК;

- спектроколориметрическую оценку изменения цвета растворов фикоцианина в процессе хранения.

Комбинации фикоцианина с белками готовили, смешивая равные объемы 1% водных растворов, с последующим термостатированием смесей при температуре 28±0,5 °C в течение 60 мин в шейкере-инкубаторе при скорости перемешивания 100 об/мин.

Исследования термодинамических характеристик образцов проводили ДСК с помощью прибора DSC-3 (Mettler Toledo, Швейцария). Образцы взвешивали в алюминиевых тиглях объемом 40 мкл с точностью 0,1 мг и укупоривали. Масса навесок в зависимости от образца составляла 3,0-7,0 мг. Нагрев образцов проводили в диапазоне от 25 до 200 °С со скоростью 5 °C/мин.

Измерение цвета проводили при помощи спектрофотометра BS7016 (3NH, Китай). Образцы хранили в течение 20 мин при температуре 50 °С. Оценку цветового допуска проводили по формуле:

где L₁* _{, 2} - показатель светлоты, а₁* _{, 2} - цвет в диапазоне от зеленого к красному, b₁* _{, 2} - цвет в диапазоне от синего к желтому сравниваемых образцов.

Испытания образцов проводили в 3 повторностях. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ Microsoft Excel. Вычисляли среднее значение (М), стандартную ошибку среднего (m), данные представлены как M±m. Анализ полученных результатов методом главных компонент проводили с использованием пакета программ SensoMiner в среде R (версия 4.2.2).

Результаты и обсуждение

При проведении исследований были получены термограммы всех исследуемых образцов. На рис. 1 приведены кривые тепловых эффектов отдельных ингредиентов в диапазоне от 30 до 180 °C.

Тепловые эффекты, обнаруженные в данной области, характеризуют наличие лабильных структур в изучаемых образцах. Как видно на рис. 1, наиболее выраженный низкотемпературный эндотермический эффект (пик при 60 °C) характерен для образца концентрата сывороточных белков, что может соответствовать начальной температуре их денатурации [9]. Образец овальбумина имеет небольшой тепловой эффект при 70 и 100 °C, что характерно для пиков денатурации этого белка [10], а казеината натрия - при 132 °C аналогично результатам, представленным в [11]. Сухой образец фикоцианина в этой области имеет 2 пика при 80 и 121 °C и начало термической деструкции при 65 °C [12].

Наличие данных тепловых эффектов, на порядок меньших по сравнению с основными пиками, вероятно, объяснимо природой самих белков, являющихся гетерогенными объектами, которые имеют несколько фазовых переходов при нагревании. Кроме того, изучаемые образцы не были химически чистыми веществами, а представляли собой смесь различных соединений, которые также могут вносить свой вклад в формирование наблюдаемых эндотермических процессов.

Наиболее выраженными в изучаемом температурном диапазоне являются высокотемпературные пики, отражающие температуры денатурации и плавления изучаемых образцов (рис. 2).

Как видно из данных рис. 2, последовательность пиков в данной температурной области соответствует последовательности низкотемпературных пиков (WPC <OVA <PC <CasNa). Принимая во внимание существенно бо́льшие значения теплового потока в данном регионе (60 против 0,7 мВт) и, как следствие, бо́льшие соотношения сигнал-шум, оценку термической стабильности растворов фикоцианина в смеси с пищевыми белками проводили посредством анализа этого региона. Результаты измерения температур плавления растворов исследуемых образцов приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, температура деструкции изучаемых образцов варьирует в достаточно широком диапазоне.

Смешивание фикоцианина с исследуемыми белковыми препаратами приводило к существенному изменению температур пиков деструкции в сторону как повышения, так и понижения. Наиболее заметное снижение отмечено для овальбумина в комплексе с фикоцианином.

К значимому повышению температуры деструкции приводило сочетание фикоцианина с концентратом сывороточного белка, что согласуется с данными, полученными ранее [16]. Наблюдаемый эффект может быть связан с образованием комплекса фикоцианина с сывороточными белками, в котором последние оказывают защитное действие на термически лабильные компоненты смеси.

Учитывая результаты исследования методом ДСК, эксперимент по колориметрической оценке стабильности комплексов фикоцианина с различными белками проводили при 50 °C для исключения деградации белков при нагреве.

На рис. 3 показаны результаты сравнения окраски изучаемых образцов в цветовом пространстве CIELab по показателю допуска (ΔE), характеризующему отличия между цветом комплексов и образца фикоцианина. Интенсивность цветности всех образцов сравнивали со средним значением этого показателя для фикоцианина.

Как видно из представленных данных (см. рис. 3), растворы комплексов фикоцианина с белком существенно отличаются от контрольного образца (PC) по показателю цветности. В рамках шкалы использованного цветового пространства принято, что при ΔE<1 образцы не отличимы между собой, при 1 <ΔE <2 - различимы обученным экспертом, при 2 <ΔE <3,5 - различимы неподготовленными людьми [17]. Все исследуемые образцы характеризовались пороговым значением ΔE в районе 2 единиц, т.е. были визуально различимы сразу после приготовления.

Для описания различий в значениях аспектов цветов, результаты измерений были представлены в виде проекции на первые 2 главные компоненты (рис. 4).

Компоненты (Dim1, Dim2) описывают 92,81% всей вариации между образцами. Первая компонента преимущественно коррелирует со значением аспекта светлоты (L*), а вторая - с цветом сравниваемых образцов в диапазоне от синего к желтому (b*) (рис. 4А). Как видно из графика (рис. 4Б), образцы до и после нагрева имели существенные отличия в показателе светлоты. После нагрева для всех образцов была характерна общая тенденция к потемнению. Нагрев контрольного образца фикоцианина без белков характеризовался, кроме потемнения, существенным изменением окраски в области желто-синего спектра в сторону увеличения синего цвета (Δb* = -1,80±0,01), что может быть обусловлено изменением в структуре его хромофорных групп. Наименьшее и статистически значимое изменение цвета (тест Манна-Уитни: U=16, p=0,029) в диапазоне от синего к желтому отмечено для образца фикоцианина с концентратом белков молочной сыворотки (Δb* = 0,53±0,06), что в дополнение к полученным нами результатам термодинамических исследований подтверждает бо́льшую стабильность данного сочетания в условиях проведения эксперимента.

Таким образом, методами колориметрии и ДСК выявлены термозащитные эффекты белков яйца и молока в отношении фикоцианина. Поскольку на текущий период не существует эталонных значений таких эффектов и методических рекомендаций по оценке протективного действия белков относительно фикоцианинов, в связи с чем сравнить полученные данные с общепринятыми не представляется возможным, то научная новизна и практическая ценность работы заключается в получении информации о различной степени термозащитных эффектов белков молока и яйца по отношению к фикоцианинам.

Заключение

Проведенные исследования показали, что повышения термической стабильности фикоцианина возможно достичь при его сочетании с концентратом белков молочной сыворотки. Наблюдаемый протективный эффект сывороточных белков значительно превосходил защитное действие казеината натрия и овальбумина. Изучение окраски растворов фикоцианина при нагреве подтвердило меньшее изменение цвета образцов в диапазоне от синего к желтому в присутствии концентрата сывороточных белков. В целом полученные результаты указывают на более высокую стабильность хромофорных групп фикоцианина в модуле из сывороточных белков. Полученные данные можно использовать в перспективе для разработки новых форм функциональных пищевых ингредиентов, содержащих фикоцианин.

Литература

1. Попова А.Ю., Тотолян А.А. Методология оценки популяционного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 в условиях пандемии COVID-19 // Инфекция и иммунитет. 2021. Т. 11, № 4. C. 609-616. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-MFA-1770

2. Куличенко А.Н., Малецкая О.В., Саркисян Н.С., Волынкина А.С. COVID-19 как зоонозная инфекция // Инфекция и иммунитет. 2021. Т. 11, № 4. C. 617-623. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-CAA-1621

3. Pagels F., Guedes A.C., Amaro H.M., Kijjoa A., Vasconcelos V. Phycobiliproteins from cyanobacteria: chemistry and biotechnological applications // Biotechnol. Adv. 2019. Vol. 37, N 3. P. 422-443. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.02.010

4. Arashiro L.T., Ferrer I., Pániker C.C., Gómez-Pinchetti J.L., Rousseau D.P., Van Hulle S.W.H. et al. Natural pigments and biogas recovery from microalgae grown in wastewater // ACS Sustainable Chem. Eng. 2020. Vol. 8, N 29. P. 10 691−10 701. DOI: https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.0c01106

5. Pentón-Rol G., Marín-Prida J., McCarty M.F. C-phycocyanin-derived phycocyanobilin as a potential nutraceutical approach for major neurodegenerative disorders and COVID-19-induced damage to the nervous system // Curr. Neuropharmacol. 2021. Vol. 19, N 12. P. 2250-2275. DOI: https://doi.org/10.2174/1570159X19666210408123807

6. Hudz N.I., Turkina V.A., Filipska A.M., Kuzminov O.B., Kоrytniuk R.S., Lubenets V.I. et al. Protein С-phycocyanin, structure, physicochemical and biological properties, methods of extraction // Biopolymers Cell. 2021. Vol. 37, N 6. P. 407-418. DOI: https://doi.org/10.7124/bc.000A66

7. Evaluation of certain food additives: eighty-sixth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Geneva : World Health Organization and Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2019 (WHO technical report series; No. 1014). Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO. URL: https://iris.who.int/handle/10665/279832 ISBN: 9789241210232.

8. Бирюлина Н.А., Зорин С.Н., Никитюк Д.Б., Мазо В.К. Модифицированный метод получения фикоцианинового концентрата биомассы Arthrospira platensis // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 110-116. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-110

9. deWit J.N., Klarenbeek G. Effects of various heat treatments on structure and solubility of whey proteins // J. Dairy Sci. 1984. Vol. 67, N 11. P. 2701-2710. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(84)81628-8

10. Liu L., Dai X., Kang H., Xu Y., Hao W. Structural and functional properties of hydrolyzed/glycosylated ovalbumin under spray drying and microwave freeze drying // Food Sci. Hum. Wellness. 2020. Vol. 9, N 1. P. 80-87. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fshw.2020.01.003

11. Zhang B., Yao Y., Lu Y., Xu Y., Li W., Yan W. Sodium caseinate and OSA-modified starch as carriers for the encapsulation of lutein using spray drying to improve its water solubility and stability // Int. J. Food Sci. Technol. 2022. Vol. 57, N 10. P. 6409-6421. DOI: https://doi.org/10.1111/ijfs.15949

12. Mishra S.K., Shrivastav A., Mishra S. Effect of preservatives for food grade C-PC from Spirulina platensis // Process Biochem. 2008. Vol. 43, N 4. P. 339-345. DOI: https://doi.org/10.1016/j.procbio.2007.12.012

13. Swaisgood H.E. Chemistry of the caseins // Advanced Dairy Chemistry. 1. Proteins / eds P.F. Fox, P.L.H. McSweeney. 3rd ed. Part A. New York : Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003. 1346 p.

14. Xia X., Tobin J.T., Fenelon M.A., Mcsweeney P.L.H., Sheehan J.J. Production, composition and preservation of micellar casein concentrate and its application in cheesemaking: a review // Int. J. Dairy Technol. 2022. Vol. 75, N 1. P. 46-58. DOI: https://doi.org/10.1111/1471-0307.12829

15. Hammam A.R.A., Martínez-Monteagudo S.I., Metzger L.E. Progress in micellar casein concentrate: production and applications // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2021. Vol. 20, N 5. P. 4426-4449. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12795

16. Zhang S., Zhang Z., Dadmohammadi Y., Li Y., Jaiswal A., Abbaspourrad A. Whey protein improves the stability of C-phycocyanin in acidified conditions during light storage // Food Chem. 2021. Vol. 344. Article ID 128642. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128642

17. Mokrzycki W.S., Tatol M. Colour difference ∆E - a survey // Mach. Graph. Vis. 2011. Vol. 20, N 4. P. 383-411.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.