Development of allergenic potential’s assessment approaches of protein hydrolysates obtained from alternative food sources

• Marina D. Trebukh
• Elvira O. Sadykova
• Antonina A. Shumakova
• Svetlana I. Shestakova

Abstract

The investigation of the perspectives for the application of alternative protein sources in food production has allowed us to identify two main directions requiring comprehensive scientific support: firstly, the development of production and processing of food protein technologies to obtain food hydrolysates with a given composition and properties, and secondly, the assessment of the such product safety, including evaluation of their allergenic potential. Currently, within the second direction, research is being conducted to improve approaches to assessing the allergenic potential of innovative food, search for new in vitro and in vivo models and biomarkers to guarantee the safety of these products for consumers.

The purpose of the study was to research the allergenic potential of the methanotrophic bacteria protein hydrolysates on the model of systemic anaphylaxis in rats and to formulate approaches to assessing the novel foods’ safety.

Material and methods. The allergenic potential of acid and enzymatic hydrolysates of Methylococcus capsulatus methanotrophic bacteria was investigated on the systemic anaphylaxis’ model in two 30-day experiments on Wistar rats’ male fed diet containing acid hydrolysate in the 1^st experiment and enzymatic hydrolysate in the 2^nd experiment. Animals of the corresponding control groups were kept on semi-synthetic casein diet. The ingredients of the experimental groups’ diets were substituted taking into account the content of protein, fat, carbohydrates and dietary fibers in the hydrolysates in compliance with the principle of isocaloric content and identity of chemical composition. Allergenic potential of hydrolysates was assessed using an expanded pool of indicators: severity of active anaphylactic shock (mortality, number of severe anaphylaxis reactions); cytokine profile (content of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, as well as regulators of cellular and humoral immune response), ovalbumin specific IgG immunoglobulin level before administration of ovalbumi permissive dose.

Results. In the sensitised rats the inclusion of methanotrophic bacteria hydrolysates in the diet caused an increase in allergic reactivity. The systemic anaphylaxis severity was 20% (p˂0.05) higher in rats of the 1^st experimental group receiving acid hydrolysate with the diet than in animals of the 1st control group; in rats of the 2^nd experimental group it was 33% (p˂0.05) lower than the corresponding control. The assessment of the humoral immune response intensity shows a slight statistically unreliable increase by 11% (p>0.05) in the sum of IgG1 + IgG4 antibodies in rats of the 1^st experimental group compared to the corresponding control group. This indicator in rats of the 2^nd experimental group was 81% (p˂0.05) higher than in rats of the 2^nd control group. The study of serum cytokine profiles revealed an increase in Th1/Th2-regulators of the immune response in rats of both experimental groups compared to the corresponding controls: in rats of the 1^st experimental group 8 out of 12 indices exceeded control values by 4–69% (p>0.05), in rats of the 2^nd experimental group 7 out of 12 indices exceeded control values by 5–19% (p>0.05), and 2 out of 12 – by 88–191% (p˂0.05). The experimental data processed by nonparametric ranked two-factor dispersion analysis confirmed the influence of the methanotrophic bacteria protein hydrolysis’ technology on the hydrolysates allergenicity and the influence of the diet protein source.

Conclusion. The results of the allergenic potential’ investigation of Methylococcus capsulatus protein hydrolysates in the systemic anaphylaxis rats’ model indicate the promising use of enzymatic hydrolysis. However, further optimisation of the technology is required to create a product with low residual antigenicity and immunogenicity. Approaches to allergenic potential assessment of innovative food obtained by microbial synthesis, including a number of in vitro and in vivo studies, were formed on the basis of the obtained data analysis.

Keywords: novel food; allergenic potential; Methylococcus capsulatus; enzymatic hydrolysis; acid hydrolysis

Динамическое развитие технологий пищевых производств, обусловленное достижениями современной науки в области глубокой переработки, выделения и очистки отдельных ингредиентов, в том числе из нетрадиционного сырья, не только расширяет сырьевую базу соответствующих отраслей промышленности, но и накладывает дополнительные обязательства в части обеспечения безопасности такой продукции [1]. Пищевая продукция нового вида, не имеющая истории безопасного применения в пищу, в большинстве юрисдикций рассматривается как источник потенциальных рисков для здоровья человека, поэтому важнейшим условием возможности использования такой продукции является доказательство ее безопасности, полученное в рамках комплексных исследований. Согласно практике, сложившейся в Российской Федерации, изучение аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида представляет собой один из важнейших этапов оценки безопасности, требующий непрерывного научного обеспечения в части совершенствования методологии этих исследований [2].

Доказано, что аллергенный профиль пищевой продукции изменяется в зависимости от способа ее технологической обработки. Одним из эффективных инструментов снижения аллергенности посредством разрушения конформационных или линейных эпитопов, пептидных связей, образования низкомолекулярных (короткоцепочечных) пептидов и аминокислот, модификации структуры аллергенов (в том числе снижения способности IgE-связывания) служит технология ферментативного гидролиза [3, 4]. Короткоцепочечные пептиды и свободные аминокислоты теряют способность взаимодействовать с антиген-презентирующими Т-клетками и индуцировать реакцию дегрануляции клеток-мишеней. По разным оценкам, молекулярная масса пептидов, ниже которой аллергенность гидролизата становится минимальной, составляет ~3,5-10 кДа [5-7]. Однако на практике ферментативный гидролиз может и не оказать влияния на IgE-эпитопы аллергена или привести к образованию новых эпитопов вместо существующих. Также сохранность антигенных свойств ферментативного гидролизата обусловлена наличием низкомолекулярных пептидов, которые образуют иммуногенные комплексы с высокомолекулярными ингредиентами в составе пищевых продуктов [8, 9].

Цель исследования - на модели системной анафилаксии у крыс изучить аллергенный потенциал белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий и сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Материал и методы

Исследования являются частью комплексного изучения пищевой ценности [10-12] и безопасности белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus. Материалом для экспериментов в рамках данной публикации послужили белковые гидролизаты метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus: кислотный гидролизат (1-й эксперимент), полученный методом гидролиза соляной кислотой в мягких условиях, и ферментативный гидролизат (2-й эксперимент), полученный при помощи комплекса ферментных препаратов - амилазы, липазы и протеазы. Дизайны обоих экспериментов были идентичны. Исследования длительностью 30 дней каждый воспроизведены на модели системной анафилаксии индуцированного анафилактического шока на крысах-самцах линии Вистар поколения F1, выведенных от животных, получавших экспериментальные рационы на протяжении всего периода онтогенеза. Животные были разделены на группы: в рамках 1-го эксперимента - на 1-ю контрольную (n=30) и 1-ю опытную (n=30), в рамках 2-го эксперимента - на 2-ю контрольную (n=30) и 2-ю опытную (n=30). Исходный возраст крыс в 1-м эксперименте составлял ~41 день, во 2-м эксперименте - ~36 дней. Крысы 1-й и 2-й контрольных групп получали полусинтетический казеиновый рацион [13], 1-й опытной - рацион с добавлением кислотного гидролизата (12 г/100 г рациона), 2-й опытной - с добавлением ферментативного гидролизата (28 г/100 г рациона). Замену ингредиентов рациона опытных групп производили с учетом содержания белка, жиров, углеводов и пищевых волокон во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности и идентичности химического состава.

Аллергенный потенциал белковых гидролизатов изучен на модели системной анафилаксии у крыс, воспроизведенной в соответствии с МУ 2.3.2.3388-16 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками", с незначительными модификациями [2]. На 1, 3, 5-е сутки эксперимента крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали овальбумином куриного яйца (ОВА). На 21-й день после первой сенсибилизации однократно вводили ОВА для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-е сутки внутривенно вводили разрешающую дозу ОВА. В течение 1-х суток после этого оценивали тяжесть реакции анафилаксии, выраженной в баллах. Интенсивность гуморального иммунного ответа определяли по концентрации циркулирующих специфических IgG к ОВА, выполняющих у животных данной линии функцию аллергических антител.

Изучение цитокинового профиля сыворотки крови крыс [гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерферон γ, интерлейкин (ИЛ)10, ИЛ-12(p70), ИЛ-13, ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, фактор некроза опухоли α] проводили методом мультиплексного анализа (панель Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 12-Plex, Bio-Rad, США) на проточном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США).

Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой (по 2 особи в клетке), в отапливаемом (при температуре от 20 до 24 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. На протяжении эксперимента вели ежедневные наблюдения за внешним видом, поведением, поедаемостью корма и общим состоянием животных, массу тела крыс измеряли еженедельно. Работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33215- 2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами".

Статистическую обработку данных осуществляли при помощи программы SPSS Statistics 23 (IBM, США), с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, точного теста Фишера, многомерного критерия χ², рангового двухфакторного дисперсионного анализа. Проверку нормальности распределения полученных данных осуществляли методом Колмогорова-Смирнова, однородности дисперсии - с помощью теста Левена. Во всех случаях различия признавали достоверными на уровне значимости р≤0,05. Результаты исследований представлены в виде М±m, где М - среднее значение показателей, m - стандартная ошибка.

Результаты и обсуждение

Общее состояние животных в течение каждого эксперимента было удовлетворительным, гибели крыс не отмечено. Крысы 1-й опытной группы, получавшие кислотный гидролизат, в отличие от 3 других групп, демонстрировали сниженную двигательную активность, а также повышенный уровень тревожности и низкий прирост массы тела. В конце эксперимента масса тела крыс 1-й опытной группы составляла 282±3 г и была на 18% (p˂0,05) ниже, чем у крыс 1-й контрольной группы (343±4 г); во 2-й опытной группе масса тела крыс значимо не отличалась от таковой у крыс 2-й контрольной группы, составив 349±5 против 339±5 г (p>0,05).

Тяжесть системной анафилаксии у крыс 1-й опытной группы, получавших с рационом кислотный гидролизат, была на 20% (p˂0,05) выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й опытной группы - на 33% (p˂0,05) ниже, чем у соответствующей контрольной группы (табл. 1). Оценка интенсивности гуморального иммунного ответа показала незначительное статистически недостоверное повышение суммы антител IgG1 + IgG4 у крыс 1-й опытной группы по сравнению с соответствующей контрольной группой - на 11% (p>0,05), величина данного показателя у крыс 2-й опытной группы была статистически значимо - на 81% (p˂0,05) выше, чем у крыс 2-й контрольной группы.

Изучение цитокиновых профилей сыворотки крови выявило повышение их концентрации у крыс обеих опытных групп по сравнению с соответствующими контролями: у крыс 1-й опытной группы 8 из 12 показателей превышали контрольные значения на 4-69% (p>0,05), у крыс 2-й опытной группы 7 из 12 показателей превышали контрольные значения на 5-19% (p>0,05), а 2 из 12 - на 88-191% (p˂0,05) (табл. 2). Полученные данные были обработаны с помощью непараметрического рангового двухфакторного дисперсионного анализа, в рамках которого подтверждено влияние технологии гидролиза белка метанокисляющих бактерий (кислотный/ферментативный), а также влияние источника белка рациона (казеин/гидролизат метанокисляющих бактерий) (см. табл. 2).

Проведенные исследования показали, что в обеих группах сенсибилизированных крыс, получавших рационы с добавлением кислотного и ферментативного гидролизатов белка M. capsulatus, наблюдался рост аллергической реактивности, выраженный в повышении содержания иммуноглобулинов и цитокинов. Увеличение летальности и частоты шоковых реакций, отмеченное у получавших кислотный гидролизат крыс 1-й опытной группы, может быть опосредованно связано с неполной реализацией потенциала физического развития этих животных, о чем свидетельствует низкая масса тела в конце эксперимента, которая явилась причиной их низкой устойчивости при воздействии индуцированного анафилактического шока [14, 15].

Уменьшение прироста массы тела у крыс 1-й опытной группы при одинаковом содержании белка в рационах опытных и контрольных групп может быть обусловлено плохой поедаемостью из-за неудовлетворительных органолептических свойств исследуемого гидролизата (горький вкус) и его низкой биологической ценностью (дефицит триптофана) [16].

Вероятной причиной горького вкуса гидролизата является повышение содержания образовавшихся в процессе кислотного гидролиза свободных аминокислот и пептидов (с молекулярной массой <1 кДа), а также пептидов, содержащих концевые гидрофобные аминокислоты. Кроме того, кислотный гидролиз приводит к разрушению незаменимых аминокислот (триптофана, метионина, цистеина и др.), снижая биологическую ценность белковых концентратов [6, 17]. Повышение аллергической реактивности у крыс этой группы также может быть связано с присутствием в кислотных гидролизатах продуктов рацемизации аминокислот (D-аминокислот) [18, 19].

Потребление сенсибилизированными крысами 2-й опытной группы рациона с добавлением ферментативного гидролизата не увеличивало тяжесть реакции системной анафилаксии по сравнению с контрольными животными, получавшими стандартный рацион, однако вызывало повышение уровней иммуноглобулинов и цитокинов. Следовательно, с определенной долей уверенности можно предположить, что изучаемый продукт демонстрировал остаточную антигенность, обусловленную в том числе наличием иммуногенных комплексов, образовавшихся в результате связывания низкомолекулярных пептидов с макромолекулами [8, 20, 21].

Несмотря на очевидные преимущества технологии ферментативного гидролиза, не всегда достигается требуемая степень расщепления белка и разрушение областей антигенных детерминант. Имеются основания полагать, что дальнейшая корректировка технологии гидролиза, с учетом специфичности ферментов (сайтов гидролиза), а также данных эпитопного картирования аллергенов, позволит получить продукт с оптимальным молекулярно-массовым распределением и низкой остаточной антигенностью.

Таким образом, анализ полученных данных позволил сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида. Во-первых, in vitro блок исследований гидролизата должен включать определение степени гидролиза, молекулярно-массового распределения пептидных фракций и остаточной антигенности продукта; во-вторых, in vivo блок исследований на модели системной анафилаксии у крыс (индуцированного анафилактического шока) должен включать изучение расширенного пула показателей тяжести активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии, анафилактический индекс); цитокинового профиля сыворотки крови (содержание про- и противовоспалительных цитокинов, регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), а также иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 и патоморфологическую характеристику лимфоидной ткани иммунокомпетентных органов.

Заключение

Результаты исследования аллергенного потенциала белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus на модели системной анафилаксии у крыс свидетельствуют о перспективности использования ферментативного гидролиза, однако для создания продукта с низкой остаточной антигенностью и иммуногенностью необходима дальнейшая оптимизация технологии.

На основании анализа полученных данных были сформированы подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида, включающие выполнение исследований in vitro и in vivo.

References

1. Mezenova O.Ya. Modern food biotechnology: main problems and challenges. Vestnik Mezhdunarodnoy akademii kholoda [Journal of International Academy of Refrigeration]. 2023; (1): 35–46. DOI: https://doi.org/10.17586/1606-4313-2023-22-1-35-46 (in Russian)

2. Trebukh M.D., Tyshko N.V., Sadykova E.O., Nikitin N.S., Gmoshinski I.V. Impact of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass on the immune status of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 41–51. DOI: DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-41-51 (in Russian)

3. Liang X., Wang Z., Yang H., Luo X., Sun J., Yang M., et al. Evaluation of allergenicity of cow milk treated with enzymatic hydrolysis through a mouse model of allergy. J Dairy Sci. 2022; 105 (2): 1039–50. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-20686

4. Woern C., Grossmann L. Microbial gas fermentation technology for sustainable food protein production. Biotechnol Adv. 2023; 69: 108240 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108240

5. Lukushkina E.F., Baskakova E.Yu., Afraymovich M.G., Gurenko S.P., Vlasova I.N., Kuzmichev Y.G. Place of the extensively hydrolyzed cow’s milk protein-based formulas in the diet of children with different pathologies. Voprosy sovremennoy pediatrii [Problems of Modern Pediatrics]. 2015; 14 (1): 48–54 (in Russian)

6. Makarova I.V., Korostovtsev D.S., Trusova O.V. Effectiveness of using a mixture based on whey protein hydrolysate «Nutrilon Pepti TSC» in diet therapy of children with allergy to cow’s milk proteins. Pediatriya. Zhurnal imeni G.N. Speranskogo [Pediatrics Journal named after G.N. Speransky]. 2006; 85 (3): 45–9. (in Russian)

7. Semenova E.S., Simonenko E.S., Simonenko S.V., Zorin S.N., Petrov N.A., Mazo V.K. Study of parameters of milk proteins hydrolysis with the help of Russian-produced enzyme preparations. Pishchevye sistemy [Food Systems]. 2023; 6 (2): 224–32. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2023-6-2-224-232 (in Russian)

8. Zorin S.N. Enzymatic hydrolysates of foods for therapeutic and prophylactic nutrition. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 23–31. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10026 (in Russian)

9. Gromov D.A., Borisova A. V., Bakharev V.V. Food allergens and methods for producing hypoallergenic foods. Tekhnika i tekhnologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food Production]. 2021; 51 (2): 232–47. DOI: https://doi.org/10.21603/2074- 9414-2021-2-232-247 (in Russian)

10. Sadykova E.O., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Shumakova A.A., Makarenko M.А., Tyshko N.V. Alternative protein sources: bacteria Methylococcus capsulatus concentrate, characteristic of composition and biological value. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (3): 36–44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44 (in Russian)

11. Tyshko N.V., Shestakova S.I., Shumakova A.A. Biological value of protein concentrate from Methylococcus capsulatus strain GSB-15. In: International Congress: Biotechnology: State of the Art and Perspectives. Moscow, 2022: 199–201. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-199-201 (in Russian)

12. Kotova D.S., Trebukh M.D., Sadykova E.O. Analysis of amino acid composition of protein concentrate obtained by innovative biotechnological methods of microbial synthesis. In: Proceedings of the XVIII All-Russian Congress with international participation «Nutriciology and Nutrition for Health-Saving Population of Russia». Moscow, 2023: 243. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-302 (in Russian)

13. Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Pashorina V.A., Selyaskin K.E., Mel’nik E.A., Mustafina O.K., et al. A comparative assessment of the diet influence on growth and development of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (5): 30–8. (in Russian)

14. Daly J.M., Reynolds J., Sigal R.K., Shou J., Liberman M.D. Effect of dietary protein and amino acids on immune function. Crit Care Med. 1990; 18 (suppl 2): S86–93. DOI: https://doi.org/10.1097/00003246-199002003-00002

15. Tourkochristou E., Triantos C., Mouzaki A. The influence of nutritional factors on immunological outcomes. Front Immunol. 2021; 12: 665968. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.665968

16. Sadykova E.O., Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Shumakova A.A., Makarenko M.А., et al. Alternative protein sources: bacteria Methylococcus capsulatus concentrate, characteristic of composition and biological value. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (3): 36–44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44 (in Russian)

17. Kostyleva E.V., Sereda A.S., Velikoretskaya I.A., Kurbatova E.I., Tsurikova N.V. Proteases for obtaining of food protein hydrolysates from proteinaceous by-products. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (1): 116–32. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-116-132 (in Russian)

18. Gao R., Yu Q., Shen Y., Chu Q., Chen G., Fen S., et al. Production, bioactive properties, and potential applications of fish protein hydrolysates: developments and challenges. Trends Food Sci Technol. 2021; 110: 687–99. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.031

19. Yarnpakdee S., Benjakul S., Kristinsson H.G., Kishimura H. Antioxidant and sensory properties of protein hydrolysate derived from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) by one- and two-step hydrolysis. J Food Sci Technol. 2015; 52 (6): 336–49. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-014-1394-7

20. Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Mazo V.K. Enzymatic hydrolysates of whey protein and chicken egg protein: production, physical-chemical and immunochemical characteristics. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (1): 64–8. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10007 (in Russian)

21. Simonenko E.S., Simonenko S.V., Gmoshinsky I.V., Riger N.A., Shumakova A.A., Zorin S.N. Influence of lactoferrin and enzymatiс hydrolysates of cow’s and mare’s milk proteins on anaphylactic sensitivity and cytokine profile of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 31–40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40 (in Russian)

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.