Формирование подходов к оценке аллергенного потенциала белковых гидролизатов, полученных из нетрадиционных источников продовольственного сырья

Требух Марина Дмитриевна; Садыкова Эльвира Олеговна; Шумакова Антонина Александровна; Шестакова Светлана Игоревна

Резюме

Изучение перспектив применения альтернативных источников белка при производстве пищевой продукции позволило определить 2 основных направления, требующих комплексной научной поддержки: во-первых, разработка технологий производства и переработки пищевого белка для получения пищевых гидролизатов с заданным составом и свойствами, а во-вторых - оценка безопасности такой продукции, в том числе аллергенности. В настоящее время

в рамках работы по второму направлению проводятся исследования, включающие совершенствование подходов к оценке аллергенного потенциала инновационной пищевой продукции, поиск новых in vitro и in vivo моделей и биомаркеров, позволяющих гарантировать безопасность продукции для потребителей.

Цель исследования - на модели системной анафилаксии у крыс изучить аллергенный потенциал белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий и сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Материал и методы. Аллергенный потенциал кислотного и ферментативного гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus изучен на модели системной анафилаксии в двух 30-дневных экспериментах на крысах-самцах линии Вистар, получавших с рационом в рамках 1-го эксперимента кислотный гидролизат, 2-го - ферментативный гидролизат. Животных соответствующих контрольных групп содержали на полусинтетическом казеиновом рационе. Замену ингредиентов рациона опытных групп проводили с учетом содержания белка, жиров, углеводов и пищевых волокон во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности и идентичности химического состава. Аллергенный потенциал гидролизатов исследовали, используя расширенный пул показателей: тяжесть активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии); цитокиновый профиль (содержание про- и противовоспалительных цитокинов, а также регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), концентрация специфических к овальбумину куриного яйца иммуноглобулинов класса IgG до введения разрешающей дозы овальбумина куриного яйца.

Результаты. В эксперименте на сенсибилизированных крысах показано, что включение в рацион белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий вызывает повышение аллергической реактивности. Тяжесть системной анафилаксии у крыс 1-й опытной группы, получавших с рационом кислотный гидролизат, была на 20% (p˂0,05) выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й опытной группы - на 33% (p˂0,05) ниже соответствующей контрольной. Оценка интенсивности гуморального иммунного ответа демонстрирует статистически незначимое повышение суммы антител IgG1 + IgG4 у крыс 1-й опытной группы по сравнению с соответствующей контрольной группой на 11% (p>0,05), величина данного показателя у крыс 2-й опытной группы была на 81% (p˂0,05) выше, чем у животных 2-й контрольной группы. Изучение цитокиновых профилей сыворотки крови выявило повышение их концентрации у крыс обеих опытных групп по сравнению с соответствующими контролями: у крыс 1-й опытной группы 8 из 12 показателей превышали контрольные значения на 4-69% (p>0,05), у крыс 2-й опытной группы 7 из 12 показателей превышали контрольные значения на 5-19% (p>0,05), а 2 из 12 - на 88-191% (p˂0,05). Обработка этих данных методом непараметрического рангового двухфакторного дисперсионного анализа подтвердила влияние технологии гидролиза белка метанокисляющих бактерий на аллергенность гидролизатов, а также влияние источника белка в рационе.

Заключение. Результаты исследования аллергенного потенциала белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus на модели системной анафилаксии у крыс свидетельствуют о перспективности использования ферментативного гидролиза, однако для создания продукта с низкой остаточной антигенностью и иммуногенностью необходима дальнейшая оптимизация технологии. На основании анализа полученных данных были сформированы подходы к оценке аллергенного потенциала инновационной пищевой продукции, полученной с использованием микробного синтеза, включающие выполнение целого ряда исследований in vitro и in vivo.

Ключевые слова: пищевая продукция нового вида; аллергенный потенциал; Methylococcus capsulatus; ферментативный гидролиз; кислотный гидролиз

Динамическое развитие технологий пищевых производств, обусловленное достижениями современной науки в области глубокой переработки, выделения и очистки отдельных ингредиентов, в том числе из нетрадиционного сырья, не только расширяет сырьевую базу соответствующих отраслей промышленности, но и накладывает дополнительные обязательства в части обеспечения безопасности такой продукции [1]. Пищевая продукция нового вида, не имеющая истории безопасного применения в пищу, в большинстве юрисдикций рассматривается как источник потенциальных рисков для здоровья человека, поэтому важнейшим условием возможности использования такой продукции является доказательство ее безопасности, полученное в рамках комплексных исследований. Согласно практике, сложившейся в Российской Федерации, изучение аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида представляет собой один из важнейших этапов оценки безопасности, требующий непрерывного научного обеспечения в части совершенствования методологии этих исследований [2].

Доказано, что аллергенный профиль пищевой продукции изменяется в зависимости от способа ее технологической обработки. Одним из эффективных инструментов снижения аллергенности посредством разрушения конформационных или линейных эпитопов, пептидных связей, образования низкомолекулярных (короткоцепочечных) пептидов и аминокислот, модификации структуры аллергенов (в том числе снижения способности IgE-связывания) служит технология ферментативного гидролиза [3, 4]. Короткоцепочечные пептиды и свободные аминокислоты теряют способность взаимодействовать с антиген-презентирующими Т-клетками и индуцировать реакцию дегрануляции клеток-мишеней. По разным оценкам, молекулярная масса пептидов, ниже которой аллергенность гидролизата становится минимальной, составляет ~3,5-10 кДа [5-7]. Однако на практике ферментативный гидролиз может и не оказать влияния на IgE-эпитопы аллергена или привести к образованию новых эпитопов вместо существующих. Также сохранность антигенных свойств ферментативного гидролизата обусловлена наличием низкомолекулярных пептидов, которые образуют иммуногенные комплексы с высокомолекулярными ингредиентами в составе пищевых продуктов [8, 9].

Цель исследования - на модели системной анафилаксии у крыс изучить аллергенный потенциал белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий и сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида.

Материал и методы

Исследования являются частью комплексного изучения пищевой ценности [10-12] и безопасности белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus. Материалом для экспериментов в рамках данной публикации послужили белковые гидролизаты метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus: кислотный гидролизат (1-й эксперимент), полученный методом гидролиза соляной кислотой в мягких условиях, и ферментативный гидролизат (2-й эксперимент), полученный при помощи комплекса ферментных препаратов - амилазы, липазы и протеазы. Дизайны обоих экспериментов были идентичны. Исследования длительностью 30 дней каждый воспроизведены на модели системной анафилаксии индуцированного анафилактического шока на крысах-самцах линии Вистар поколения F1, выведенных от животных, получавших экспериментальные рационы на протяжении всего периода онтогенеза. Животные были разделены на группы: в рамках 1-го эксперимента - на 1-ю контрольную (n=30) и 1-ю опытную (n=30), в рамках 2-го эксперимента - на 2-ю контрольную (n=30) и 2-ю опытную (n=30). Исходный возраст крыс в 1-м эксперименте составлял ~41 день, во 2-м эксперименте - ~36 дней. Крысы 1-й и 2-й контрольных групп получали полусинтетический казеиновый рацион [13], 1-й опытной - рацион с добавлением кислотного гидролизата (12 г/100 г рациона), 2-й опытной - с добавлением ферментативного гидролизата (28 г/100 г рациона). Замену ингредиентов рациона опытных групп производили с учетом содержания белка, жиров, углеводов и пищевых волокон во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности и идентичности химического состава.

Аллергенный потенциал белковых гидролизатов изучен на модели системной анафилаксии у крыс, воспроизведенной в соответствии с МУ 2.3.2.3388-16 "Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками", с незначительными модификациями [2]. На 1, 3, 5-е сутки эксперимента крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали овальбумином куриного яйца (ОВА). На 21-й день после первой сенсибилизации однократно вводили ОВА для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-е сутки внутривенно вводили разрешающую дозу ОВА. В течение 1-х суток после этого оценивали тяжесть реакции анафилаксии, выраженной в баллах. Интенсивность гуморального иммунного ответа определяли по концентрации циркулирующих специфических IgG к ОВА, выполняющих у животных данной линии функцию аллергических антител.

Изучение цитокинового профиля сыворотки крови крыс [гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерферон γ, интерлейкин (ИЛ)10, ИЛ-12(p70), ИЛ-13, ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, фактор некроза опухоли α] проводили методом мультиплексного анализа (панель Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 12-Plex, Bio-Rad, США) на проточном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США).

Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой (по 2 особи в клетке), в отапливаемом (при температуре от 20 до 24 °С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. На протяжении эксперимента вели ежедневные наблюдения за внешним видом, поведением, поедаемостью корма и общим состоянием животных, массу тела крыс измеряли еженедельно. Работу с животными проводили в соответствии с ГОСТ 33215- 2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами".

Статистическую обработку данных осуществляли при помощи программы SPSS Statistics 23 (IBM, США), с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, точного теста Фишера, многомерного критерия χ², рангового двухфакторного дисперсионного анализа. Проверку нормальности распределения полученных данных осуществляли методом Колмогорова-Смирнова, однородности дисперсии - с помощью теста Левена. Во всех случаях различия признавали достоверными на уровне значимости р≤0,05. Результаты исследований представлены в виде М±m, где М - среднее значение показателей, m - стандартная ошибка.

Результаты и обсуждение

Общее состояние животных в течение каждого эксперимента было удовлетворительным, гибели крыс не отмечено. Крысы 1-й опытной группы, получавшие кислотный гидролизат, в отличие от 3 других групп, демонстрировали сниженную двигательную активность, а также повышенный уровень тревожности и низкий прирост массы тела. В конце эксперимента масса тела крыс 1-й опытной группы составляла 282±3 г и была на 18% (p˂0,05) ниже, чем у крыс 1-й контрольной группы (343±4 г); во 2-й опытной группе масса тела крыс значимо не отличалась от таковой у крыс 2-й контрольной группы, составив 349±5 против 339±5 г (p>0,05).

Тяжесть системной анафилаксии у крыс 1-й опытной группы, получавших с рационом кислотный гидролизат, была на 20% (p˂0,05) выше, чем у животных 1-й контрольной группы, у крыс 2-й опытной группы - на 33% (p˂0,05) ниже, чем у соответствующей контрольной группы (табл. 1). Оценка интенсивности гуморального иммунного ответа показала незначительное статистически недостоверное повышение суммы антител IgG1 + IgG4 у крыс 1-й опытной группы по сравнению с соответствующей контрольной группой - на 11% (p>0,05), величина данного показателя у крыс 2-й опытной группы была статистически значимо - на 81% (p˂0,05) выше, чем у крыс 2-й контрольной группы.

Изучение цитокиновых профилей сыворотки крови выявило повышение их концентрации у крыс обеих опытных групп по сравнению с соответствующими контролями: у крыс 1-й опытной группы 8 из 12 показателей превышали контрольные значения на 4-69% (p>0,05), у крыс 2-й опытной группы 7 из 12 показателей превышали контрольные значения на 5-19% (p>0,05), а 2 из 12 - на 88-191% (p˂0,05) (табл. 2). Полученные данные были обработаны с помощью непараметрического рангового двухфакторного дисперсионного анализа, в рамках которого подтверждено влияние технологии гидролиза белка метанокисляющих бактерий (кислотный/ферментативный), а также влияние источника белка рациона (казеин/гидролизат метанокисляющих бактерий) (см. табл. 2).

Проведенные исследования показали, что в обеих группах сенсибилизированных крыс, получавших рационы с добавлением кислотного и ферментативного гидролизатов белка M. capsulatus, наблюдался рост аллергической реактивности, выраженный в повышении содержания иммуноглобулинов и цитокинов. Увеличение летальности и частоты шоковых реакций, отмеченное у получавших кислотный гидролизат крыс 1-й опытной группы, может быть опосредованно связано с неполной реализацией потенциала физического развития этих животных, о чем свидетельствует низкая масса тела в конце эксперимента, которая явилась причиной их низкой устойчивости при воздействии индуцированного анафилактического шока [14, 15].

Уменьшение прироста массы тела у крыс 1-й опытной группы при одинаковом содержании белка в рационах опытных и контрольных групп может быть обусловлено плохой поедаемостью из-за неудовлетворительных органолептических свойств исследуемого гидролизата (горький вкус) и его низкой биологической ценностью (дефицит триптофана) [16].

Вероятной причиной горького вкуса гидролизата является повышение содержания образовавшихся в процессе кислотного гидролиза свободных аминокислот и пептидов (с молекулярной массой <1 кДа), а также пептидов, содержащих концевые гидрофобные аминокислоты. Кроме того, кислотный гидролиз приводит к разрушению незаменимых аминокислот (триптофана, метионина, цистеина и др.), снижая биологическую ценность белковых концентратов [6, 17]. Повышение аллергической реактивности у крыс этой группы также может быть связано с присутствием в кислотных гидролизатах продуктов рацемизации аминокислот (D-аминокислот) [18, 19].

Потребление сенсибилизированными крысами 2-й опытной группы рациона с добавлением ферментативного гидролизата не увеличивало тяжесть реакции системной анафилаксии по сравнению с контрольными животными, получавшими стандартный рацион, однако вызывало повышение уровней иммуноглобулинов и цитокинов. Следовательно, с определенной долей уверенности можно предположить, что изучаемый продукт демонстрировал остаточную антигенность, обусловленную в том числе наличием иммуногенных комплексов, образовавшихся в результате связывания низкомолекулярных пептидов с макромолекулами [8, 20, 21].

Несмотря на очевидные преимущества технологии ферментативного гидролиза, не всегда достигается требуемая степень расщепления белка и разрушение областей антигенных детерминант. Имеются основания полагать, что дальнейшая корректировка технологии гидролиза, с учетом специфичности ферментов (сайтов гидролиза), а также данных эпитопного картирования аллергенов, позволит получить продукт с оптимальным молекулярно-массовым распределением и низкой остаточной антигенностью.

Таким образом, анализ полученных данных позволил сформировать подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида. Во-первых, in vitro блок исследований гидролизата должен включать определение степени гидролиза, молекулярно-массового распределения пептидных фракций и остаточной антигенности продукта; во-вторых, in vivo блок исследований на модели системной анафилаксии у крыс (индуцированного анафилактического шока) должен включать изучение расширенного пула показателей тяжести активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии, анафилактический индекс); цитокинового профиля сыворотки крови (содержание про- и противовоспалительных цитокинов, регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), а также иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 и патоморфологическую характеристику лимфоидной ткани иммунокомпетентных органов.

Заключение

Результаты исследования аллергенного потенциала белковых гидролизатов метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus на модели системной анафилаксии у крыс свидетельствуют о перспективности использования ферментативного гидролиза, однако для создания продукта с низкой остаточной антигенностью и иммуногенностью необходима дальнейшая оптимизация технологии.

На основании анализа полученных данных были сформированы подходы к оценке безопасности пищевой продукции нового вида, включающие выполнение исследований in vitro и in vivo.

Литература

1. Мезенова О.Я. Современная пищевая биотехнология: основные проблемы и вызовы // Вестник Международной академии холода. 2023. № 1. С. 35-46. DOI: https://doi.org/10.17586/1606-4313-2023-22-1-35-46

2. Требух М.Д., Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Никитин Н.С., Гмошинский И.В. Изучение влияния биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) на иммунный статус крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 41-51. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-41-51

3. Liang X., Wang Z., Yang H., Luo X., Sun J., Yang M. et al. Evaluation of allergenicity of cow milk treated with enzymatic hydrolysis through a mouse model of allergy // J. Dairy Sci. 2022. Vol. 105, N 2. Р. 1039-1050. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-20686

4. Woern C., Grossmann L. Microbial gas fermentation technology for sustainable food protein production // Biotechnol. Adv. 2023. Vol. 69. Article ID 108240 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2023.108240

5. Лукушкина Е.Ф., Баскакова Е.Ю., Афраймович М.Г., Гуренко С.П., Власова И.Н., Кузмичев Ю.Г. Роль смесей на основе высокогидролизованных белков молочной сыворотки в питании детей с различной патологией // Вопросы современной педиатрии. 2015. Т. 14, № 1. С. 48-54.

6. Макарова И.В., Коростовцев Д.С., Трусова О.В. Эффективность применения смеси на основе гидролизата сывороточных белков "Нутрилон Пепти ТСЦ" в диетотерапии детей с аллергией к белкам коровьего молока // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2006. Т. 85, № 3. С. 45-49.

7. Семенова Е.С., Симоненко Е.С., Симоненко С.В., Зорин С.Н., Петров Н.А., Мазо В.К. Исследование параметров процесса гидролиза белков молока с использованием ферментных препаратов отечественного производства // Пищевые системы. 2023. Т. 6, № 2. С. 224-232. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2023-6-2-224-232

8. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков для специализированных пищевых продуктов диетического (лечебного и профилактического) питания // Вопросы питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 23-31. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10026

9. Громов Д.А., Борисова А.В., Бахарев В.В. Пищевые аллергены и способы получения гипоаллергенных пищевых продуктов // Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51, № 2. С.232-247. DOI: https://doi.org/10.21603/2074- 9414-2021-2-232-247

10. Садыкова Э.О., Требух М.Д., Никитин Н.С., Шестакова С.И., Шумакова А.А., Макаренко М.А., Тышко Н.В. Альтернативные источники пищевого белка: концентрат из бактерий Methylococcus capsulatus, характеристика состава и биологическая ценность // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 3. С. 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44

11. Тышко Н.В., Шестакова С.И., Шумакова А.А. Биологическая ценность белкового концентрата на основе Methylococcus capsulatus ГСБ-15 // Международный конгресс биотехнология: состояние и перспективы развития : сборник. Москва, 2022. С. 199-201. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-199-201

12. Котова Д.С., Требух М.Д., Садыкова Э.О. Анализ аминокислотного состава белкового концентрата, полученного инновационными биотехнологическими методами микробного синтеза // Материалы XVIII Всероссийского конгресса с международным участием "Нутрициология и диетология для здоровьесбережения населения России" : сборник. Москва, 2023. С. 243. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-302

13. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Мустафина О.К. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

14. Daly J.M., Reynolds J., Sigal R.K., Shou J., Liberman M.D. Effect of dietary protein and amino acids on immune function // Crit. Care Med. 1990. Vol. 18, suppl. 2. Р. S86-S93. DOI: https://doi.org/10.1097/00003246-199002003-00002

15. Tourkochristou E., Triantos C., Mouzaki A. The influence of nutritional factors on immunological outcomes // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. Article ID 665968. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.665968

16. Садыкова Э.О., Требух М.Д., Никитин Н.С., Шестакова С.И., Шумакова А.А., Макаренко М.А. и др. Альтернативные источники пищевого белка: концентрат из бактерий Methylococcus capsulatus, характеристика состава и биологическая ценность // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 3. С. 36-44. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-3-36-44

17. Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Курбатова Е.И., Цурикова Н.В. Использование протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов пищевого назначения из вторичного сырья // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 1. С. 116-132. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-1-116-132

18. Gao R., Yu Q., Shen Y., Chu Q., Chen G., Fen S. et al. Production, bioactive properties, and potential applications of fish protein hydrolysates: developments and challenges // Trends Food Sci. Technol. 2021. Vol. 110. Р. 687-699. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.031

19. Yarnpakdee S., Benjakul S., Kristinsson H.G., Kishimura H. Antioxidant and sensory properties of protein hydrolysate derived from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) by one- and two-step hydrolysis // J. Food Sci. Technol. 2015. Vol. 52, N 6. Р. 336-349. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-014-1394-7

20. Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. Ферментативные гидролизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 1. С. 64-68. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10007

21. Симоненко Е.С., Симоненко С.В., Гмошинский И.В., Ригер Н.А., Шумакова А.А., Зорин С.Н. Влияние лактоферрина и ферментативных гидролизатов белков коровьего и кобыльего молока на анафилактическую чувствительность и цитокиновый профиль крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 31-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.