Effect of separate and combined intake of rutin and hesperidin on the activity and gene expression of cytochrome P450 isoforms 1A and 3A in rat liver

• Nikita V. Trusov
• Viktor A. Tutelyan

Abstract

The main molecular mechanisms of the protective effect of minor bioactive compounds (BAC) of food, including rutin and hesperidin, along with antiradical and antioxidant activity, include their interaction with transcription factors modulating the functional state of the organism defense systems, one of which is the system of xenobiotic metabolizing enzymes. However, the data on their combined action are limited.

The aim of the research was to study the effect of rutin and hesperidin on the activity and gene expression of cytochrome P450 isoforms 1A and 3A (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A) in rat liver at their separate and combined intake.

Material and methods. The study was carried out using 4 groups of 6 male Wistar rats with initial body weight 225±5 g. For 14 days the rats of the control group received a standard semi-synthetic diet. Rutin and hesperidin were administered separately or together at a calculated daily dose of 400 mg per 1 kg body weight. CYP1A1 and CYP1A2 activities were determined spectrofluorimetrically in liver microsomal fraction, CYP3A activity – by high-performance liquid chromatography. Gene expression was analyzed by real-time reverse transcription polymerase chain reaction.

Results. Dietary intake of rutin and hesperidin did not significantly alter the activity of the studied enzymes of xenobiotic metabolism, but had an inducing effect on CYP1A1 and CYP1A2 genes, expression of which statistically significant increased both at separate and combined intake. The expression of CYP3A1 gene did not differ from control values at intake of rutin alone, but considerably and statistically significant decreased in the presence of hesperidin in the diet. An increase in transcription factor AhR gene expression was noted, moreover the expression in the group receiving rutin + hesperidin was significantly reduced in relation to the group receiving rutin alone.

Conclusion. Combined intake of flavonoids (rutin and hesperidin) has a modulating effect on enzymes of xenobiotic metabolism at the level of their gene expression.

Keywords: rats; rutin; hesperidin; cytochrome P450; gene expression

Гесперидин (3,5,7-тригидроксифлаванон 7-рамноглюкозид, также известный как гесперетин 7-рутинозид) - это гликозид гесперетина, который в больших количествах присутствует в сладких апельсинах, лимонах, лаймах и мандаринах; он составляет 90% флаванонов в апельсиновом соке [1]. Рутин, название которого (зелено-желтый, игольчатый кристалл) происходит от Ruta graveolens L. - растения, богатого рутином, также обозначают рутозидом, витамином P, кверцетин-3-O-рутинозидом - это гликозид кверцетина, природными источниками рутина являются фрукты, лекарственные травы и растения [2]. Оба флавоноида, обладая схожей химической структурой, имеют одни и те же пути метаболизма в организме млекопитающих. После расщепления в просвете толстой кишки бактериальными ферментами до агликонов и рутинозы подвергаются в энтероцитах дальнейшим превращениям ферментами - UDP-глюкуронозилтрансферазами и сульфотрансферазами [3, 4]. Гесперидин и его агликон гесперетин демонстрируют различные биологические активности. Например, гесперидин обладает витамин P-подобной активностью и может снижать проницаемость капилляров, их герметичность и хрупкость. Он также проявляет антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные и противоаллергические свойства [5]. Рутин и его агликон кверцетин проявляют антирадикальную активность, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами [6].

Имеются данные, полученные в основном in vitro, о том, что рутин и гесперидин, как и их агликоны - кверцетин и гесперетин, могут оказывать влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4) [7]. В то же время количество исследований, выполненных in vivo, ограничено.

Семейство ферментов цитохрома P450 (CYP) играет ключевую роль в метаболизме как эндогенных субстратов, включая арахидоновую кислоту, простагландины, стероидные гормоны, жирные кислоты, так и ксенобиотиков, к числу которых относятся и биологически активные вещества пищи [8]. По разным данным, CYP также метаболизируют от 30 до 60% широко распространенных лекарств [9]. Активация транскрипции описывается как основной процесс индукции генов CYP и уровней их белков [10]. Участвующие в метаболизме ксенобиотиков CYP (семейства CYP1-4) кодируются высокоиндуцибельными генами [11], активация которых осуществляется по рецептор-зависимым механизмам [12]. Индукция CYP опосредована несколькими рецепторами: арил-гидрокарбоновым (AhR) - CYP1А1, 1А2; ядерным прегнановым Х-рецептором (PXR) - CYP3A, 2A6, 2B, 2C; конститутивным андростановым рецептором (CAR) - CYP1A, 3A4, 2A6, 2B, 2C8, 2C9 [9]. Однако транскрипционный путь активации не единственный, существуют и другие механизмы активации/ингибирования CYP ксенобиотиками. Так, описано исследование, выполненное с использованием рекомбинантного человеческого CYP1A1, в котором авторы сообщают об ингибирующих свойствах флавоноидов посредством структурного взаимодействия с белками CYP, при этом аминокислотный остаток Phe224 и другие ароматические остатки в активном сайте CYP1A1 человека играют важную роль во взаимодействии флавоноидов и CYP [8].

Несмотря на продолжающиеся по всему миру исследования свойств и молекулярных механизмов действия флавоноидов, в том числе рутина и гесперидина, данные по влиянию этих биологически активных веществ на ферменты метаболизма ксенобиотиков при совместном поступлении в организм крайне ограничены, а проведение подобных исследований in vivo остается актуальной задачей.

Цель настоящей работы - изучение влияния рутина и гесперидина на активность и экспрессию генов изоформ цитохрома Р450 1А и 3А в печени крыс при их раздельном и совместном поступлении.

Материал и методы

В эксперименте использовали 4 группы по 6 крыс-самцов Вистар, полученных из питомника Филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, с исходной массой тела 225±5 г. Работу выполняли в соответствии с международными рекомендациями (директива 2010/63/EU по защите животных, используемых для научных целей). Крысы контрольной группы (1-я группа) получали стандартный полусинтетический рацион (ПСР). Крысы 2-й и 3-й групп потребляли ПСР с добавлением рутина или гесперидина (Sigma-Aldrich, США), соответственно, в расчетной суточной дозе 400 мг на 1 кг массы тела. Животных 4-й группы кормили ПСР, содержащим рутин и гесперидин совместно в той же дозе. Ежедневно определяли количество потребленного корма и общее состояние животных (подвижность, состояние шерстного покрова, стул), массу тела определяли каждые 2 дня с точностью ±1 г на электронных весах. Экспериментальный период составил 14 дней.

В микросомальной фракции печени определяли активности CYP1A1 и CYP1A2 спектрофлюориметрически, активность CYP3A - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [13-15]. Для анализа экспрессии генов выделяли из печени тотальную РНК, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с обратной транскрипцией, как описано в [16]. Обратную транскрипцию и ПЦР выполняли на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Последовательности праймеров представлены в табл. 1. ПЦР проводили по стандартной схеме в 3 стадии (денатурация, отжиг праймеров, элонгация). Температура отжига праймеров варьировала в зависимости от гена: 54 °С для CYP1A2 и 3А1, 56 °С для Actb, 60 °С для CYP1A1 и AhR. После прохождения циклов ПЦР проводили анализ кривой плавления. Каждую амплификацию проводили в 3 повторах. Нормализованную относительно гена домашнего хозяйства Actb экспрессию целевых генов рассчитывали по значению порогового цикла [17].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM, США). Данные представляли в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для выявления различий применяли однофакторный дисперсионный анализ с использованием в качестве апостериорного критерия LSD-теста.

Результаты и обсуждение

Раздельное, как и совместное, 2-недельное включение в рацион рутина и гесперидина не оказывало влияния на общее состояние животных, массу тела и относительную массу печени.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, включение флавоноидов в рацион крыс приводило в целом к повышению активности изученных ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени, которое, однако, не достигало уровня статистической значимости.

При изучении содержания мРНК генов ферментов метаболизма ксенобиотиков было установлено индуцирующее влияние флавоноидов на гены СYP1A1 и СYP1A2. Экспрессия гена СYP1A1 повышалась во 2-й и 4-й группах в 1,6 раза; в 3-й группе в 2,1 раза, а гена СYP1A2 в 1,8 раза во 2-й и 3-й группах; 1,6 раза в 1-й группе по сравнению с контролем. Экспрессия гена СYP3A1 не отличалась от контрольных значений при раздельном поступлении Р (2-я группа), но значительно снижалась при наличии гесперидина в рационе, составив 40% (в 3-й группе) и 13% (в 4-й группе) от уровня в контроле. При этом было отмечено усиление экспрессии гена транскрипционного фактора AhR: в 2,9 раза у крыс 2-й группы; в 2,3 раза 3-й группы и в 2,0 раза 4-й группы, причем экспрессия в 4-й группе (рутин + гесперидин) была достоверно снижена по отношению ко 2-й группе (рутин) (см. рисунок).

Данные литературы по влиянию рутина и его агликона кверцетина на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков носят неоднозначный характер, что может быть связано с выбором разных моделей (in vitro и in vivo), форм флавонола (агликона или гликозида), различиями в условиях проведения эксперимента, в частности способах введения, составе рационов, выборе доз и т.д. [18-20]. В большинстве публикаций приведены данные, полученные, как правило, с использованием агликона рутина кверцетина в условиях in vitro. Количество работ in vivo, особенно для рутина, ограничено.

В обзоре [7] собраны данные in vitro, свидетельствующие о разнонаправленном воздействии кверцетина на микросомальные монооксигеназы: стимулирующем - на активность CYP1A1 (а также экспрессию мРНК), ингибирующем - на активность CYP1A2 и CYP3A4.

В препаратах микросом почек человека и микросомальной фракции из человеческой лимфобластоидной клеточной линии AHH-1, содержащей кДНК-экспрессированные CYP человека (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1), агликон гесперидина гесперетин ингибировал CYP1A1 (IC50 0,92 мМ) в большей степени, чем CYP1A2 (активность фермента CYP1A2 статистически значимо не отличалась от контроля), гесперетин селективно ингибировал CYP1B1 при концентрациях ниже 0,04 мМ. Неспособность микросом печени человека, а также микросом, содержащих экспрессированные человеческие CYP1A2 и CYP3A4, метаболизировать гесперетин является весьма значительной. Отсутствие такой активности в отношении гесперетина указывает на высокую селективность этого соединения для CYP1A1 и CYP1B1 человека [21]. В работе [22], где в качестве источника фермента использовались рекомбинантные бакулосомы с гиперэкспрессированными цитохромами P450 (1A2, 2A6, 2C8 и 2D6), гесперетин показал менее выраженное ингибирование CYP1A2 по сравнению с другими соединениями флавоноидной природы.

При проведении исследования с помощью метода Ah-I, представляющего собой анализ связывания рецептора с использованием цитозоля, содержащего выделенный из клеток печени млекопитающих AhR, и иммунологического измерения уровня диоксина, Y. Amakura и соавт. пришли к выводу, что среди флаванонов гесперетин и нарингенин ингибировали TCDD-индуцированную активацию AhR, а гликозиды флаванона (гесперидин, нарингин) не проявляли ингибирующей активности, что было характерно также для гликозидов флавонолов (рутин) [23].

Результаты работ по изучению влияния рутина и его агликона кверцетина in vivo часто противоречивы. В некоторых исследованиях потребление агликона рутина кверцетина приводило к ингибированию активности CYP3A (у крыс [24]) и CYP1A2 (у здоровых добровольцев [25]). В работе [26] кверцетин в количестве 17,3 мг на 1 кг массы тела в течение 14 дней не оказывал значимого влияния на активность CYP1A1, CYP1A2, CYP3A1, CYP2В1 в печени крыс. Интрагастральное введение рутина (60 мг на 1 кг массы тела) в течение 5 сут сопровождалось повышением активности метоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A2) и этоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A1) в печени крыс [27]. В настоящем исследовании наблюдалось повышение активности CYP1A2, которое, однако, не было статистически значимым. Пероральное введение самцам крыс Sprague-Dawley возрастом 7-8 нед и массой тела 270-300 г гесперидина в дозе 1, 5 или 15 мг на 1 кг массы тела приводило к эффективному ингибированию как CYP3A-опосредованного метаболизма в тонкой кишке и печени, так и транспортера Pgp в тонкой кишке [28]. В эксперименте по моделированию 1,2-диметилгидразин-индуцированного рака толстой кишки, проведенном S. Aranganathan с соавт., самцы крыс Вистар с исходной массой тела 150 г в течение 32 нед получали внутрижелудочно гесперетин ежедневно в виде суспензии (1 мл) в дозе 20 мг на 1 кг массы тела. Введение гесперетина в течение всего экспериментального периода значительно снижало активность цитохрома P450 в печени и толстой кишке, цитохрома b5, цитохрома P4502E1, NADPH-цитохром b5 редуктазы и NADH-цитохром P450 редуктазы по сравнению с крысами, получавшими только 1,2-диметилгидразин [29].

В настоящей работе включение флавоноидов рутина и гесперидина в рацион крыс приводило к усилению экспрессии генов цитохромов Р450 1А1, 1А2 (CYP1A1, CYP1A2) и транскрипционного фактора AhR (AhR) в печени крыс. При этом экспрессия гена СYP3A1 достоверно снижалась при наличии гесперидина в рационе.

Таким образом, сочетанное поступление в организм крыс флавоноидов рутина и гесперидина оказывает модулирующее действие на ферменты метаболизма ксенобиотиков на уровне экспрессии их генов.

References

1. Miles E.A, Calder P.C. Effects of citrus fruit juices and their bioactive components on inflammation and immunity: a narrative review. Front Immunol. 2021; 12: 712608. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.712608

2. Pandey P., Khan F., Qari H.A., Oves M. Rutin (bioflavonoid) as cell signaling pathway modulator: prospects in treatment and chemoprevention. Pharmaceuticals (Basel). 2021; 14 (11): 1069. DOI: https://doi.org/10.3390/ph14111069

3. Tutelyan V.A., Lashneva N.V. Biological active substances of plant origin. Flavanones: dietary sources, biovailability, the influence on xenobiotic metabolizing enzymes. Voprosy pitaniia. [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (5): 4–23. (in Russian)

4. Amaretti A., Raimondi S., Leonardi A., Quartieri A., Rossi M. Hydrolysis of the rutinose-conjugates flavonoids rutin and hesperidin by the gut microbiota and bifidobacterial. Nutrients. 2015; 7 (4): 2788–800. DOI: https://doi.org/10.3390/nu7042788

5. Roohbakhsh A., Parhiz H., Soltani F., Rezaee R., Iranshahi M. Neuropharmacological properties and pharmacokinetics of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin – a mini-review. Life Sci. 2014; 113 (1–2): 1–6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2014.07.029

6. Parhiz H., Roohbakhsh A., Soltani F., Rezaee R., Iranshahi M. Antioxidant and anti-inflammatory properties of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin: an updated review of their molecular mechanisms and experimental models. Phytother Res. 2015; 29 (3): 323–31. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.5256

7. Moon Y.J., Wang X., Morris M.E. Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicol In Vitro. 2006; 20 (2): 187–210. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tiv.2005.06.048

8. Santes-Palacios R., Marroquín-Pérez A.L., Hernández-Ojeda S.L., Camacho-Carranza R., Govezensky T., Espinosa-Aguirre J.J. Human CYP1A1 inhibition by flavonoids. Toxicol In Vitro. 2020; 62: 104681. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tiv.2019.104681

9. Manikandan P., Nagini S. Cytochrome P450 structure, function and clinical significance: a review. Curr Drug Targets. 2018; 19 (1): 38–54. DOI: https://doi.org/10.2174/1389450118666170125144557

10. Tompkins L.M., Wallace A.D. Mechanisms of cytochrome P450 induction. J Biochem Mol Toxicol. 2007; 21 (4): 176–81. DOI: https://doi.org/10.1002/jbt.20180

11. Esteves F., Rueff J., Kranendonk M. The central role of cytochrome P450 in xenobiotic metabolism-a brief review on a fascinating enzyme family. J Xenobiot. 2021; 11 (3): 94–114. DOI: https://doi.org/10.3390/jox11030007

12. Guengerich F.P. Human cytochrome P450 enzymes. In: P.R. Ortiz de Montellano (ed.). Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Cham, Switzerland: Springer International Publishing, 2015: 523–785.

13. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S., Shimada N., Yamazaki H., Yokoi T. Azelastine N-demethylation by cytochrome P-450 (CYP)3A4, CYP2D6, and CYP1A2 in human liver microsomes: evaluation of approach to predict the contribution of multiple CYPs. Drug Metab Dispos. 1999; 27 (12): 1381–91.

14. Burke M.D., Mayer R.T. Differential effects of phenobarbitone and 3-methylcholanthrene induction on the hepatic microsomal metabolism and cytochrome P-450-binding of phenoxazone and a homologous series of its n-alkyl ethers (alkoxyresorufins). Chem Biol Interact. 1983; 45 (2): 243–58. DOI: https://doi.org/10.1016/0009-2797(83)90072-8

15. Umegaki K., Saito K., Kubota Y., Sanada H., Yamada K., Shinozuka K. Ginkgo biloba extract markedly induces pentoxyresorufin O-dealkylase activity in rats. Jpn J Pharmacol. 2002; 90 (4): 345–51. DOI: https://doi.org/10.1254/jjp.90.345

16. Balakina A.S., Trusov N.V., Avreneva L.I., Guseva G.V., Aksenov I.V., Kravchenko L.V., et al. Effect of rutin and hesperidin on the expression of Nrf2 gene and the activity of hemoxygenase-1 and NAD(P)H-quinone oxidoreductase at their separate and combined action. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (3): 18–26. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2016-00031 (in Russian)

17. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2002; 30 (9): e36. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/30.9.e36

18. Dihal A.A., de Boer V.C., van der Woude H., Tilburgs C., Bruijntjes J.P., Alink G.M., et al. Quercetin, but not its glycosidated conjugate rutin, inhibits azoxymethane-induced colorectal carcinogenesis in F344 rats. J Nutr. 2006; 136 (11): 2862–7. DOI: https://doi.org/10.1093/jn/136.11.2862

19. Harwood M., Danielewska-Nikiel B., Borzelleca J.F., Flamm G.W., Williams G.M., Lines T.C. A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties. Food Chem Toxicol. 2007; 45 (11): 2179–205. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2007.05.015

20. Kawai Y., Saito S., Nishikawa T., Ishisaka A., Murota K., Terao J. Different profiles of quercetin metabolites in rat plasma: comparison of two administration methods. Biosci Biotechnol Biochem. 2009; 73 (3): 517–23. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.80516

21. Doostdar H., Burke M.D., Mayer R.T. Bioflavonoids selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1A and CYP1B1. Toxicology. 2000; 144 (1–3): 31–8. DOI: https://doi.org/10.1016/s0300-483x(99)00215-2

22. Bojić M., Kondža M., Rimac H., Benković G., Maleš Ž. The effect of flavonoid aglycones on the CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8 and CYP2D6 enzymes activity. Molecules. 2019; 24 (17): 3174. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24173174

23. Amakura Y., Tsutsumi T., Sasaki K., Yoshida T., Maitani T. Screening of the inhibitory effect of vegetable constituents on the aryl hydrocarbon receptor-mediated activity induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Biol Pharm Bull. 2003; 26 (12): 1754–60. DOI: https://doi.org/10.1248/bpb.26.1754

24. Umathe S.N., Dixit P.V., Kumar V., Bansod K.U., Wanjari M.M. Quercetin pretreatment increases the bioavailability of pioglitazone in rats: involvement of CYP3A inhibition. Biochem Pharmacol. 2008; 75 (8): 1670–6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2008.01.010

25. Chen Y., Xiao P., Ou-Yang D.S., Fan L., Guo D., Wang Y.N., et al. Simultaneous action of the flavonoid quercetin on cytochrome P450 (CYP) 1A2, CYP2A6, N-acetyltransferase and xanthine oxidase activity in healthy volunteers. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2009; 36 (8): 828–33. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2009.05158.x

26. Kravchenko L.V., Trusov N.V., Aksenov I.V., et al. Effects of green tea extract and its components on antioxidant status and activities of xenobiotic metabolizing enzymes of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (2): 9–15. (in Russian)

27. Křížková J., Burdová K., Stiborová M., Křen V., Hodek P. The effects of selected flavonoids on cytochromes P450 in rat liver and small intestine. Interdiscip Toxicol. 2009; 2 (3): 201–4. DOI: https://doi.org/10.2478/v10102-009-0018-y

28. Cho Y.A., Choi D.H., Choi J.S. Effect of hesperidin on the oral pharmacokinetics of diltiazem and its main metabolite, desacetyldiltiazem, in rats. Arch Pharm Res. 2009; 31 (4): 518–22. DOI: https://doi.org/10.1211/jpp.61.06.0017

29. Aranganathan S., Selvam J.P, Sangeetha N., Nalini N. Modulatory efficacy of hesperetin (citrus flavanone) on xenobiotic-metabolizing enzymes during 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis. Chem Biol Interact. 2009; 180 (2): 254–61. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cbi.2009.03.005

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.