Влияние раздельного и совместного поступления рутина и гесперидина на активность и экспрессию генов изоформ цитохрома Р450 1А и 3А в печени крыс

Трусов Никита Вячеславович; Тутельян Виктор Александрович

Резюме

К основным молекулярным механизмам защитного действия минорных биологически активных веществ пищи, включая рутин и гесперидин, наряду с антирадикальной и антиоксидантной активностью, относят их взаимодействие с транскрипционными факторами, модулирующими функциональное состояние защитных систем организма, одной из которых является система ферментов метаболизма ксенобиотиков. Однако данные об их совместном действии носят ограниченный характер.

Цель работы - изучение влияния рутина и гесперидина на активность и экспрессию генов изоформ цитохрома Р450 1А и 3А (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A) в печени крыс при их раздельном и совместном поступлении.

Материал и методы. Исследование проводили с использованием 4 групп по 6 крыс-самцов Вистар с исходной массой тела 225±5 г. В течение 14 дней крысы контрольной группы получали стандартный полусинтетический рацион, в рацион животных опытных групп вводили рутин и гесперидин раздельно или совместно в расчетной суточной дозе 400 мг/на 1 кг массы тела. В микросомальной фракции печени определяли активность CYP1A1 и CYP1A2 спектрофлюориметрически, активность CYP3A - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ экспрессии генов проводили методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Результаты. Потребление с рационом флавоноидов рутина и гесперидина не изменяло значимо активность изученных ферментов метаболизма ксенобиотиков, оказывало индуцирующее влияние на гены СYP1A1 и СYP1A2, экспрессия которых статистически значимо повышалась как при раздельном, так и при сочетанном поступлении, а экспрессия гена СYP3A1 не отличалась от контрольных значений при поступлении только рутина, но значительно и достоверно снижалась при наличии гесперидина в рационе. Было отмечено усиление экспрессии гена транскрипционного фактора AhR, причем экспрессия в группе, получавшей совместно рутин и гесперидин, была достоверно снижена по отношению к группе, получавшей только рутин.

Заключение. Сочетанное поступление флавоноидов рутина и гесперидина оказывает модулирующее действие на ферменты метаболизма ксенобиотиков на уровне экспрессии их генов.

Ключевые слова: крысы; рутин; гесперидин; цитохром Р450; экспрессия генов

Гесперидин (3,5,7-тригидроксифлаванон 7-рамноглюкозид, также известный как гесперетин 7-рутинозид) - это гликозид гесперетина, который в больших количествах присутствует в сладких апельсинах, лимонах, лаймах и мандаринах; он составляет 90% флаванонов в апельсиновом соке [1]. Рутин, название которого (зелено-желтый, игольчатый кристалл) происходит от Ruta graveolens L. - растения, богатого рутином, также обозначают рутозидом, витамином P, кверцетин-3-O-рутинозидом - это гликозид кверцетина, природными источниками рутина являются фрукты, лекарственные травы и растения [2]. Оба флавоноида, обладая схожей химической структурой, имеют одни и те же пути метаболизма в организме млекопитающих. После расщепления в просвете толстой кишки бактериальными ферментами до агликонов и рутинозы подвергаются в энтероцитах дальнейшим превращениям ферментами - UDP-глюкуронозилтрансферазами и сульфотрансферазами [3, 4]. Гесперидин и его агликон гесперетин демонстрируют различные биологические активности. Например, гесперидин обладает витамин P-подобной активностью и может снижать проницаемость капилляров, их герметичность и хрупкость. Он также проявляет антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные и противоаллергические свойства [5]. Рутин и его агликон кверцетин проявляют антирадикальную активность, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами [6].

Имеются данные, полученные в основном in vitro, о том, что рутин и гесперидин, как и их агликоны - кверцетин и гесперетин, могут оказывать влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4) [7]. В то же время количество исследований, выполненных in vivo, ограничено.

Семейство ферментов цитохрома P450 (CYP) играет ключевую роль в метаболизме как эндогенных субстратов, включая арахидоновую кислоту, простагландины, стероидные гормоны, жирные кислоты, так и ксенобиотиков, к числу которых относятся и биологически активные вещества пищи [8]. По разным данным, CYP также метаболизируют от 30 до 60% широко распространенных лекарств [9]. Активация транскрипции описывается как основной процесс индукции генов CYP и уровней их белков [10]. Участвующие в метаболизме ксенобиотиков CYP (семейства CYP1-4) кодируются высокоиндуцибельными генами [11], активация которых осуществляется по рецептор-зависимым механизмам [12]. Индукция CYP опосредована несколькими рецепторами: арил-гидрокарбоновым (AhR) - CYP1А1, 1А2; ядерным прегнановым Х-рецептором (PXR) - CYP3A, 2A6, 2B, 2C; конститутивным андростановым рецептором (CAR) - CYP1A, 3A4, 2A6, 2B, 2C8, 2C9 [9]. Однако транскрипционный путь активации не единственный, существуют и другие механизмы активации/ингибирования CYP ксенобиотиками. Так, описано исследование, выполненное с использованием рекомбинантного человеческого CYP1A1, в котором авторы сообщают об ингибирующих свойствах флавоноидов посредством структурного взаимодействия с белками CYP, при этом аминокислотный остаток Phe224 и другие ароматические остатки в активном сайте CYP1A1 человека играют важную роль во взаимодействии флавоноидов и CYP [8].

Несмотря на продолжающиеся по всему миру исследования свойств и молекулярных механизмов действия флавоноидов, в том числе рутина и гесперидина, данные по влиянию этих биологически активных веществ на ферменты метаболизма ксенобиотиков при совместном поступлении в организм крайне ограничены, а проведение подобных исследований in vivo остается актуальной задачей.

Цель настоящей работы - изучение влияния рутина и гесперидина на активность и экспрессию генов изоформ цитохрома Р450 1А и 3А в печени крыс при их раздельном и совместном поступлении.

Материал и методы

В эксперименте использовали 4 группы по 6 крыс-самцов Вистар, полученных из питомника Филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, с исходной массой тела 225±5 г. Работу выполняли в соответствии с международными рекомендациями (директива 2010/63/EU по защите животных, используемых для научных целей). Крысы контрольной группы (1-я группа) получали стандартный полусинтетический рацион (ПСР). Крысы 2-й и 3-й групп потребляли ПСР с добавлением рутина или гесперидина (Sigma-Aldrich, США), соответственно, в расчетной суточной дозе 400 мг на 1 кг массы тела. Животных 4-й группы кормили ПСР, содержащим рутин и гесперидин совместно в той же дозе. Ежедневно определяли количество потребленного корма и общее состояние животных (подвижность, состояние шерстного покрова, стул), массу тела определяли каждые 2 дня с точностью ±1 г на электронных весах. Экспериментальный период составил 14 дней.

В микросомальной фракции печени определяли активности CYP1A1 и CYP1A2 спектрофлюориметрически, активность CYP3A - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [13-15]. Для анализа экспрессии генов выделяли из печени тотальную РНК, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с обратной транскрипцией, как описано в [16]. Обратную транскрипцию и ПЦР выполняли на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Последовательности праймеров представлены в табл. 1. ПЦР проводили по стандартной схеме в 3 стадии (денатурация, отжиг праймеров, элонгация). Температура отжига праймеров варьировала в зависимости от гена: 54 °С для CYP1A2 и 3А1, 56 °С для Actb, 60 °С для CYP1A1 и AhR. После прохождения циклов ПЦР проводили анализ кривой плавления. Каждую амплификацию проводили в 3 повторах. Нормализованную относительно гена домашнего хозяйства Actb экспрессию целевых генов рассчитывали по значению порогового цикла [17].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM, США). Данные представляли в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для выявления различий применяли однофакторный дисперсионный анализ с использованием в качестве апостериорного критерия LSD-теста.

Результаты и обсуждение

Раздельное, как и совместное, 2-недельное включение в рацион рутина и гесперидина не оказывало влияния на общее состояние животных, массу тела и относительную массу печени.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, включение флавоноидов в рацион крыс приводило в целом к повышению активности изученных ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени, которое, однако, не достигало уровня статистической значимости.

При изучении содержания мРНК генов ферментов метаболизма ксенобиотиков было установлено индуцирующее влияние флавоноидов на гены СYP1A1 и СYP1A2. Экспрессия гена СYP1A1 повышалась во 2-й и 4-й группах в 1,6 раза; в 3-й группе в 2,1 раза, а гена СYP1A2 в 1,8 раза во 2-й и 3-й группах; 1,6 раза в 1-й группе по сравнению с контролем. Экспрессия гена СYP3A1 не отличалась от контрольных значений при раздельном поступлении Р (2-я группа), но значительно снижалась при наличии гесперидина в рационе, составив 40% (в 3-й группе) и 13% (в 4-й группе) от уровня в контроле. При этом было отмечено усиление экспрессии гена транскрипционного фактора AhR: в 2,9 раза у крыс 2-й группы; в 2,3 раза 3-й группы и в 2,0 раза 4-й группы, причем экспрессия в 4-й группе (рутин + гесперидин) была достоверно снижена по отношению ко 2-й группе (рутин) (см. рисунок).

Данные литературы по влиянию рутина и его агликона кверцетина на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков носят неоднозначный характер, что может быть связано с выбором разных моделей (in vitro и in vivo), форм флавонола (агликона или гликозида), различиями в условиях проведения эксперимента, в частности способах введения, составе рационов, выборе доз и т.д. [18-20]. В большинстве публикаций приведены данные, полученные, как правило, с использованием агликона рутина кверцетина в условиях in vitro. Количество работ in vivo, особенно для рутина, ограничено.

В обзоре [7] собраны данные in vitro, свидетельствующие о разнонаправленном воздействии кверцетина на микросомальные монооксигеназы: стимулирующем - на активность CYP1A1 (а также экспрессию мРНК), ингибирующем - на активность CYP1A2 и CYP3A4.

В препаратах микросом почек человека и микросомальной фракции из человеческой лимфобластоидной клеточной линии AHH-1, содержащей кДНК-экспрессированные CYP человека (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1), агликон гесперидина гесперетин ингибировал CYP1A1 (IC50 0,92 мМ) в большей степени, чем CYP1A2 (активность фермента CYP1A2 статистически значимо не отличалась от контроля), гесперетин селективно ингибировал CYP1B1 при концентрациях ниже 0,04 мМ. Неспособность микросом печени человека, а также микросом, содержащих экспрессированные человеческие CYP1A2 и CYP3A4, метаболизировать гесперетин является весьма значительной. Отсутствие такой активности в отношении гесперетина указывает на высокую селективность этого соединения для CYP1A1 и CYP1B1 человека [21]. В работе [22], где в качестве источника фермента использовались рекомбинантные бакулосомы с гиперэкспрессированными цитохромами P450 (1A2, 2A6, 2C8 и 2D6), гесперетин показал менее выраженное ингибирование CYP1A2 по сравнению с другими соединениями флавоноидной природы.

При проведении исследования с помощью метода Ah-I, представляющего собой анализ связывания рецептора с использованием цитозоля, содержащего выделенный из клеток печени млекопитающих AhR, и иммунологического измерения уровня диоксина, Y. Amakura и соавт. пришли к выводу, что среди флаванонов гесперетин и нарингенин ингибировали TCDD-индуцированную активацию AhR, а гликозиды флаванона (гесперидин, нарингин) не проявляли ингибирующей активности, что было характерно также для гликозидов флавонолов (рутин) [23].

Результаты работ по изучению влияния рутина и его агликона кверцетина in vivo часто противоречивы. В некоторых исследованиях потребление агликона рутина кверцетина приводило к ингибированию активности CYP3A (у крыс [24]) и CYP1A2 (у здоровых добровольцев [25]). В работе [26] кверцетин в количестве 17,3 мг на 1 кг массы тела в течение 14 дней не оказывал значимого влияния на активность CYP1A1, CYP1A2, CYP3A1, CYP2В1 в печени крыс. Интрагастральное введение рутина (60 мг на 1 кг массы тела) в течение 5 сут сопровождалось повышением активности метоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A2) и этоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A1) в печени крыс [27]. В настоящем исследовании наблюдалось повышение активности CYP1A2, которое, однако, не было статистически значимым. Пероральное введение самцам крыс Sprague-Dawley возрастом 7-8 нед и массой тела 270-300 г гесперидина в дозе 1, 5 или 15 мг на 1 кг массы тела приводило к эффективному ингибированию как CYP3A-опосредованного метаболизма в тонкой кишке и печени, так и транспортера Pgp в тонкой кишке [28]. В эксперименте по моделированию 1,2-диметилгидразин-индуцированного рака толстой кишки, проведенном S. Aranganathan с соавт., самцы крыс Вистар с исходной массой тела 150 г в течение 32 нед получали внутрижелудочно гесперетин ежедневно в виде суспензии (1 мл) в дозе 20 мг на 1 кг массы тела. Введение гесперетина в течение всего экспериментального периода значительно снижало активность цитохрома P450 в печени и толстой кишке, цитохрома b5, цитохрома P4502E1, NADPH-цитохром b5 редуктазы и NADH-цитохром P450 редуктазы по сравнению с крысами, получавшими только 1,2-диметилгидразин [29].

В настоящей работе включение флавоноидов рутина и гесперидина в рацион крыс приводило к усилению экспрессии генов цитохромов Р450 1А1, 1А2 (CYP1A1, CYP1A2) и транскрипционного фактора AhR (AhR) в печени крыс. При этом экспрессия гена СYP3A1 достоверно снижалась при наличии гесперидина в рационе.

Таким образом, сочетанное поступление в организм крыс флавоноидов рутина и гесперидина оказывает модулирующее действие на ферменты метаболизма ксенобиотиков на уровне экспрессии их генов.

Литература

1. Miles E.A, Calder P.C. Effects of citrus fruit juices and their bioactive components on inflammation and immunity: a narrative review // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. Article ID 712608. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.712608

2. Pandey P., Khan F., Qari H.A., Oves M. Rutin (bioflavonoid) as cell signaling pathway modulator: prospects in treatment and chemoprevention // Pharmaceuticals (Basel). 2021. Vol. 14, N 11. P. 1069. DOI: https://doi.org/10.3390/ph14111069

3. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. Флаваноны: пищевые источники, биодоступность, влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 4-23.

4. Amaretti A., Raimondi S., Leonardi A., Quartieri A., Rossi M. Hydrolysis of the rutinose-conjugates flavonoids rutin and hesperidin by the gut microbiota and bifidobacteria // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 4. P. 2788-2800. DOI: https://doi.org/10.3390/nu7042788

5. Roohbakhsh A., Parhiz H., Soltani F., Rezaee R., Iranshahi M. Neuropharmacological properties and pharmacokinetics of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin - a mini-review // Life Sci. 2014. Vol. 113, N 1-2. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lfs.2014.07.029

6. Parhiz H., Roohbakhsh A., Soltani F., Rezaee R., Iranshahi M. Antioxidant and anti-inflammatory properties of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin: an updated review of their molecular mechanisms and experimental models // Phytother. Res. 2015. Vol. 29, N 3. P. 323-331. DOI: https://doi.org/10.1002/ptr.5256

7. Moon Y.J., Wang X., Morris M.E. Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism // Toxicol. In Vitro. 2006. Vol. 20, N 2. Р. 187-210. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tiv.2005.06.048

8. Santes-Palacios R., Marroquín-Pérez A.L., Hernández-Ojeda S.L., Camacho-Carranza R., Govezensky T., Espinosa-Aguirre J.J. Human CYP1A1 inhibition by flavonoids // Toxicol. In Vitro. 2020. Vol. 62. Article ID 104681. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tiv.2019.104681

9. Manikandan P., Nagini S. Cytochrome P450 structure, function and clinical significance: a review // Curr. Drug Targets. 2018. Vol. 19, N 1. P. 38-54. DOI: https://doi.org/10.2174/1389450118666170125144557

10. Tompkins L.M., Wallace A.D. Mechanisms of cytochrome P450 induction // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2007. Vol. 21, N 4. P. 176-181. DOI: https://doi.org/10.1002/jbt.20180

11. Esteves F., Rueff J., Kranendonk M. The central role of cytochrome P450 in xenobiotic metabolism-a brief review on a fascinating enzyme family // J. Xenobiot. 2021. Vol. 11, N 3. P. 94-114. DOI: https://doi.org/10.3390/jox11030007

12. Guengerich F.P. Human cytochrome P450 enzymes // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry / ed. P.R. Ortiz de Montellano. Cham, Switzerland : Springer International Publishing, 2015. P. 523-785.

13. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S., Shimada N., Yamazaki H., Yokoi T. Azelastine N-demethylation by cytochrome P-450 (CYP)3A4, CYP2D6, and CYP1A2 in human liver microsomes: evaluation of approach to predict the contribution of multiple CYPs // Drug Metab. Dispos. 1999. Vol. 27, N 12. Р. 1381-1391.

14. Burke M.D., Mayer R.T. Differential effects of phenobarbitone and 3-methylcholanthrene induction on the hepatic microsomal metabolism and cytochrome P-450-binding of phenoxazone and a homologous series of its n-alkyl ethers (alkoxyresorufins) // Chem. Biol. Interact. 1983. Vol. 45, N 2. Р. 243-258. DOI: https://doi.org/10.1016/0009-2797(83)90072-8

15. Umegaki K., Saito K., Kubota Y., Sanada H., Yamada K., Shinozuka K. Ginkgo biloba extract markedly induces pentoxyresorufin O-dealkylase activity in rats // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90, N 4. Р. 345-351. DOI: https://doi.org/10.1254/jjp.90.345

16. Балакина А.С., Трусов Н.В., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Аксенов И.В., Кравченко Л.В. и др. Влияние рутина и гесперидина на экспрессию гена Nrf2 и активность гемоксигеназы-1 и NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы при их раздельном и совместном действии // Вопросы питания. 2016. Т. 85, № 3. С. 18-26. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2016-00031

17. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, N 9. P. e36. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/30.9.e36

18. Dihal A.A., de Boer V.C., van der Woude H., Tilburgs C., Bruijntjes J.P., Alink G.M. et al. Quercetin, but not its glycosidated conjugate rutin, inhibits azoxymethane-induced colorectal carcinogenesis in F344 rats // J. Nutr. 2006. Vol. 136, N 11. P. 2862-2867. DOI: https://doi.org/10.1093/jn/136.11.2862

19. Harwood M., Danielewska-Nikiel B., Borzelleca J.F., Flamm G.W., Williams G.M., Lines T.C. A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties // Food Chem. Toxicol. 2007. Vol. 45, N 11. P. 2179-2205. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2007.05.015

20. Kawai Y., Saito S., Nishikawa T., Ishisaka A., Murota K., Terao J. Different profiles of quercetin metabolites in rat plasma: comparison of two administration methods // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009. Vol. 73, N 3. P. 517-523. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.80516

21. Doostdar H., Burke M.D., Mayer R.T. Bioflavonoids selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1A and CYP1B1 // Toxicology. 2000. Vol. 144, N 1-3. P. 31-38. DOI: https://doi.org/10.1016/s0300-483x(99)00215-2

22. Bojić M., Kondža M., Rimac H., Benković G., Maleš Ž. The effect of flavonoid aglycones on the CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8 and CYP2D6 enzymes activity // Molecules. 2019. Vol. 24, N 17. P. 3174. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24173174

23. Amakura Y., Tsutsumi T., Sasaki K., Yoshida T., Maitani T. Screening of the inhibitory effect of vegetable constituents on the aryl hydrocarbon receptor-mediated activity induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin // Biol. Pharm. Bull. 2003. Vol. 26, N 12. P. 1754-1760. DOI: https://doi.org/10.1248/bpb.26.1754

24. Umathe S.N., Dixit P.V., Kumar V., Bansod K.U., Wanjari M.M. Quercetin pretreatment increases the bioavailability of pioglitazone in rats: involvement of CYP3A inhibition // Biochem. Pharmacol. 2008. Vol. 75, N 8. Р. 1670-1676. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bcp.2008.01.010

25. Chen Y., Xiao P., Ou-Yang D.S., Fan L., Guo D., Wang Y.N. et al. Simultaneous action of the flavonoid quercetin on cytochrome P450 (CYP) 1A2, CYP2A6, N-acetyltransferase and xanthine oxidase activity in healthy volunteers // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2009. Vol. 36, N 8. P. 828-833. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2009.05158.x

26. Кравченко Л.В., Трусов Н.В., Аксенов И.В., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Лашнева Н.В. и др. Влияние экстракта зеленого чая и его компонентов на антиоксидантный статус и активность ферментов метаболизма ксенобиотиков у крыс // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 2. С. 9-15.

27. Křížková J., Burdová K., Stiborová M., Křen V., Hodek P. The effects of selected flavonoids on cytochromes P450 in rat liver and small intestine // Interdiscip. Toxicol. 2009. Vol. 2, N 3. P. 201-204. DOI: https://doi.org/10.2478/v10102-009-0018-y

28. Cho Y.A., Choi D.H., Choi J.S. Effect of hesperidin on the oral pharmacokinetics of diltiazem and its main metabolite, desacetyldiltiazem, in rats // Arch. Pharm. Res. 2009. Vol. 31, N 4. P. 518-522. DOI: https://doi.org/10.1211/jpp.61.06.0017

29. Aranganathan S., Selvam J.P, Sangeetha N., Nalini N. Modulatory efficacy of hesperetin (citrus flavanone) on xenobiotic-metabolizing enzymes during 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis // Chem. Biol. Interact. 2009. Vol. 180, N 2. P. 254-261. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cbi.2009.03.005

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.