Evaluation of the combined effect of Arthrospira platensis biomass phycyanin concentrate and soy protein on male Wistar rats fed a high-fat diet with added cholesterol

• Nadezhda A. Birulina
• Yuliya S. Sidorova
• Sergey N. Zorin
• Nikita A. Petrov
• Galina V. Guseva
• Vladimir K. Mazo
• Alla A. Kochetkova

Abstract

One of the approaches to the prevention and dietary correction of carbohydrate and lipid metabolism disorders is the development of new functional foods with the ingredients containing bioactive compounds with hypolipidemic and hypoglycemic properties. Soybean protein and biomass of Arthrospira platensis cyanobacteria containing phycobiliproteins (C-phycocyanin and allophycocyanin) are the sources of such bioactive compounds.

The aim of the research was to evaluate the combined effect of phycocyanin concentrate (in two dosages of 30 and 300 mg/kg body weight) and soy protein (50% of the protein in the diet) on disorders, induced in Wistar male rats by consumption of high-fat diet with 2% cholesterol.

Material and methods. A 108-day study was performed on 60 growing male Wistar rats. Animals of the control group K1 received a standard semi-synthetic diet. Disturbances in rats of the experimental group G2 were caused by increasing the proportion of the fat component in the diet (up to 29%), adding 2% cholesterol and replacing 20% of cornstarch with sucrose. In experimental groups G3, G4, and G5, 50% of casein in the high-fat diet was replaced with soy protein isolate. Additionally, phycocyanin concentrate was added to the diets of rats in groups G4 and G5 in quantities of 30 and 300 mg/kg of body weight (in terms of phycocyanin), respectively. In all animals, insulin resistance test was conducted, body composition was measured using magnetic resonance relaxometry, blood serum biochemical parameters of protein, lipid, purine metabolism and liver function, and the triglyceride and cholesterol liver levels were determined by spectrophotometric methods using a biochemical analyzer; leptin, ghrelin, C-peptide, insulin, malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase and hydroperoxides were determined in blood serum using enzyme immunoassay.

Results. The inclusion of only soy protein isolate into the high-fat diet with cholesterol had a hypoglycemic effect, preventing the development of insulin resistance, and led to a reliable decrease in blood level of lipid peroxides (p=0.011) compared to G2 group. The combined introduction of phycocyanin concentrate at a dose of 300 mg/kg body weight and soy protein into the diet significantly reduced blood levels of cholesterol (p=0.022), lipid peroxides (p=0.001) and ALT activity (p=0.032) compared to G2. At the same time, animals of both these groups retained disorders in hormonal status (increased leptin and ghrelin level), antioxidant status (elevated level of MDA and SOD) at the same level as for animals consuming high-fat diet with 2% cholesterol. Phycocyanin concentrate at a dosage of 30 mg/kg body weight together with soy protein in the diet prevented the development of insulin resistance (p=0.049) and reduced serum glucose level (p=0.025); exerted an antioxidant effect, normalizing the level of lipid peroxides (p=0.047), MDA (p=0.015) and SOD (p=0.038), significantly reduced the level of leptin (p=0.037) and ghrelin (p=0.028) compared to animals consuming a high-fat diet with 2% cholesterol.

Conclusion. The results characterizing the absence of a beneficial effect of phycocyanins at a dose of 300 mg/kg body weight indicate their possible prooxidant effect, what requires further experimental research. The data on the beneficial effects of a low dose (30 mg/kg body weight) of phycocyanins in combination with soy protein on lipid and carbohydrate metabolism may be of interest for the development of functional food ingredients with hypoglycemic and hypolipidemic properties.

Keywords: obesity; lipid metabolism; cholesterol; antioxidant; phycocyanin; Arthrospira platensis; soy protein

Нарушения углеводного и жирового обмена оказывают негативное влияние на показатели состояния здоровья, ведут к развитию ряда алиментарно-зависимых заболеваний, в первую очередь таких социально значимых, как сахарный диабет 2 типа, метаболический синдром, ожирение. Причина смертности людей от ожирения связана с развитием сопутствующих хронических заболеваний, таких как сердечно-сосудистые патологии, сахарный диабет 2 типа и его осложнения. Одним из способов борьбы с ожирением является увеличение физической активности, адекватное питание и включение в рационы специализированных пищевых продуктов [1-3]. Очевидна актуальность технологических разработок новых функциональных пищевых ингредиентов и их доклиническая оценка эффективности для создания специализированной пищевой продукции, целевым назначением которой является снижение риска развития и/или коррекция нарушений липидного обмена. Перспективным является использование в качестве функциональных пищевых ингредиентов, обладающих антиоксидантными свойствами, концентратов фикобилипротеинов (С-фикоцианина и аллофикоцианина), экстрагируемых из биомассы пищевой цианобактерии Arthrospira platensis. В исследованиях in vivo показано, что потребление микроводорослей Arthrospira maxima и A. platensis способствовало снижению адипогенеза и липогенеза в белой и бурой жировой ткани [4]. Биомасса A. platensis, а также экстракты фикоцианинов, полученные из нее, проявляли гипогликемические и гиполипидемические свойства на фоне введения аллоксана и стрептозотоцина как мышам, так и крысам [5-8].

E.M. El-Sayed и соавт. [9] показали, что кормление животных в течение 30 сут фикоцианином (50 мг на 1 кг массы тела) и фикоцианобилином (в дозе 982 мкг на 1 кг массы тела) приводило к более значимому снижению уровня атерогенных липидов и повышению уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови крыс со стрептозотоциновым диабетом по сравнению с изменениями при использовании суспензии биомассы A. platensis (50 мг/мл на 1 кг массы тела).

В работе [10] у крыс с диабетическими нарушениями, получавших биомассу A. platensis (10 и 20 мг на 1 кг массы тела), наблюдалось снижение уровня малонового диальдегида (МДА) в тканях печени по сравнению с показателями контрольной группы, увеличение дозировки спирулины коррелировало с повышением активности антиоксидантных ферментов в печени. Внутрижелудочное введение раствора сухой биомассы A. platensis в дозе 650 мг на 1 кг массы тела крысам-самцам линии Вистар на фоне высокожирового рациона в течение 10 нед приводило к достоверному снижению уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), общего холестерина и активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови животных по сравнению с контролем [11].

Выявленные в экспериментах in vivo гипогликемические, гиполипидемические и антиоксидантные свойства биомассы A. platensis и экстрактов фикоцианинов могут быть связаны c тем, что в качестве простетической тетрапиррольной группы у фикоцианинов выступает фикоцианобилин - структурный аналог биливердина и билирубина. Эти эндогенные тетрапиррольные соединения участвуют в окислительно-восстановительном цикле, катализируемом гемоксигеназой 1 типа и биливердинредуктазой; являются эндогенными антиоксидантами с противовоспалительными свойствами, способны влиять на течение атеросклеротических заболеваний, снижать ишемическое повреждение тканей [12]. В малых концентрациях эти билины способны предотвращать окисление жирных кислот, транспортируемых альбумином, а также самого белка, что сопоставимо с активностью известных природных антиоксидантов [13]. Логично предположить, что антиоксидантные свойства биомассы A. platensis и экстрактов фикоцианина, продемонстрированные в доклинических исследованиях, могут быть следствием структурного сходства с билинами.

Исследования, направленные на оценку влияния растительных белков, в частности соевого белка, на метаболические нарушения, характерные для ожирения, дислипидемии, гипергликемии и неалкогольной жировой болезни печени, широко ведутся как на лабораторных животных, так и в клинике [14]. Например, в работах [15, 16] потребление соевого белка (как единственного источника белка) крысами-самцами линии Цукер в течение 16-18 нед приводило к достоверному снижению относительной массы печени и степени стеатоза за счет улучшения метаболизма жиров и транспорта липидов из печени. В исследовании [17] длительное потребление в течение 16 нед мышами-самцами линии C57BL/6 с индуцированным ожирением рациона с высоким содержанием соевого белка (38,9% от рациона, единственный источник белка) способствовало снижению прироста массы тела, накопления жировой массы и аккумуляции жира в печени.

Цель данного исследования - сравнительная оценка сочетанного влияния введения в рацион животных концентрата фикоцианинов в 2 дозировках (30 и 300 мг на 1 кг массы тела) и белка сои (50% от белка в рационе) на нарушения, индуцированные потреблением крысами-самцами линии Вистар высокожирового рациона с добавлением 2% холестерина.

Материал и методы

Исследование продолжительностью 108 сут выполнено на 60 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 50±5 г. Животные получены из питомника лабораторных животных Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследования выполнены в соответствии с требованиями ГОСТ 33647-2015 "Принципы надлежащей лабораторной практики" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами" и одобрены этическим комитетом ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (выписка из протокола заседания № 11 от 15.12.2021). Животных содержали по 2 крысы в клетке в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20-26 °C, относительная влажность 30-60%, 12-часовой цикл освещения).

Дизайн эксперимента. За 3 сут до начала эксперимента у находящихся в карантине животных были определены показатели поведения в тесте "Открытое поле" (ОП), на следующий день крыс взвешивали и определяли уровень глюкозы в крови. Животных рандомизированно по этим 3 показателям разделили на 5 групп (табл. 1).

Животные контрольной группы К1 на протяжении всего эксперимента получали стандартный полусинтетический рацион [20% белка (казеин), 10% жира, 53% углеводов; энергетическая ценность рациона 382 ккал/100 г]. Животные группы Г2 получали изоазотистый высокожировой (ВЖ) рацион с добавлением 2% холестерина: 20% белка (казеин), 29% жира, 2% холестерина, 18% углеводов в виде крахмала, 20% сахарозы (ВЖ + 2% холестерина рацион; энергетическая ценность 511 ккал/100 г). Животные групп Г3, Г4 и Г5 получали модифицированный изоазотистый ВЖ-рацион с добавлением 2% холестерина, где 50% белка казеина заменяли на изолят соевого белка (10% белка казеина, 10% белка сои, 29% жира, 2% холестерина, 18% углеводов, 20% сахарозы; энергетическая ценность рациона 511 ккал/100 г). В рацион животных групп Г4 и Г5 на протяжении эксперимента добавляли концентрат фикоцианинов, полученный по схеме [18], в количестве 30 и 300 мг на 1 кг массы тела крысы в пересчете на фикоцианин соответственно. Концентрат фикоцианинов вмешивали в соевый белок непосредственно перед приготовлением корма.

Все животные на протяжении эксперимента получали корм и питьевую воду ad libitum. 3 раза в неделю контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали.

Тест на инсулинорезистентность выполняли на 89-е сутки исследования, крысам вводили инсулин внутрибрюшинно в дозе 0,75 Ед/кг. Измеряли уровень глюкозы крови до введения раствора инсулина (0 точка) и через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости уровня глюкозы от времени после введения инсулина, определяли значение площади под кривой (ППК, ммоль/л×180 мин). Кровь отбирали из хвостовой вены, содержание глюкозы определяли с использованием глюкометра (OneTouchSelect, США).

Состав тела определяли методом магнитно-резонансной релаксометрии на 102-е сутки эксперимента с использованием анализатора EchoMRI-1100 (EchoMRI LLC, США).

На 109-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким наркозом. Кровь отбирали для определения содержания гликированного гемоглобина с использованием коммерческого набора "Гликогемотест" (ЭЛТА, Россия); получали сыворотку крови для проведения общего биохимического анализа крови на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 20i (Thermo Scientific, Финляндия). В сыворотке крови определяли также концентрацию лептина, грелина, инсулина, С-пептида, МДА, супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы и гидроперекисей липидов с помощью коммерческих наборов (Elabscience, Китай и FineTest, Китай) методом иммуноферментного анализа. После извлечения печени ее взвешивали и лиофилизовали. Жир экстрагировали из печени по методу Фолча [19]. Содержание триглицеридов и холестерина в жире определяли фотометрически на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 20i (Thermo Scientific, Финляндия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics 20 (IBM, США). Выборку подвергали проверке на нормальность с использованием критерия Смирнова-Колмогорова при уровне значимости 0,05. В случае нормального распределения данных использовали параметрический критерий Тьюки. Вычисляли среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m), данные представлены как M±m. В случае если выборка не соответствовала нормальному распределению, применяли непараметрический критерий согласия Краскела-Уоллиса. Определяли медиану (Me), 25% и 75% процентиль (Q1 и Q3). Данные представлены как Me [Q1; Q3]. Различия принимали за достоверные при вероятности принятия нуль‑гипотезы p<0,05.

Результаты

У животных группы Г2, получавших ВЖ-рацион с добавлением 2% холестерина, шерсть была жирная и взъерошенная по сравнению как с контрольными животными, так и с крысами, получавшими пищевые ингредиенты.

Крысы опытных групп Г2-Г5 потребляли достоверно меньше корма (16±2 г/сут на крысу) по сравнению с животными контрольной группы К1 (21±1 г/сут на крысу), что обусловлено более высокой калорийностью их рационов. При этом потребление энергии животными групп Г2, Г3 и Г4 (84±2 ккал/сут на крысу) было статистически значимо выше по сравнению с таковым у крыс контрольной группы К1 (79±1 ккал/сут на крысу). Различия в потреблении энергии между крысами групп К1 и Г5 (82±1 ккал/сут на крысу) были статистически незначимы.

Данные мониторинга прироста массы тела животных представлены на рис. 1.

На протяжении всего эксперимента достоверных различий между приростом массы тела крыс группы Г2 и животных контрольной группы К1 не выявлено. Прирост массы тела животных группы Г5 уже с 3-й недели кормления был достоверно выше по сравнению с таковым у крыс группы Г2 и с 7-й недели достоверно выше по сравнению с животными группы К1, оставаясь таким до окончания эксперимента. Прирост массы тела животных групп Г3 и Г4 начиная с 6-й недели кормления был достоверно выше по сравнению с показателем крыс группы Г2 и только с 14-й недели стал достоверно выше по сравнению с приростом животных группы К1.

В табл. 2 представлены данные по массе и составу тела животных на 102-е сутки эксперимента.

Средняя масса тела на дату проведения тестирования у животных группы Г2 и группы К1 не различалась и была достоверно ниже по сравнению с показателем животных групп Г3, Г4 и Г5. При этом процентное содержание жировой массы тела у крыс всех 4 опытных групп было выше по сравнению с животными группы К1. Процентное содержание жировой массы у крыс группы Г5 было достоверно и значительно выше по сравнению с показателем животных групп Г3 и Г4, а процентное содержание мышечной массы и общей воды у животных группы Г5 было статистически значимо ниже по сравнению с показателями крыс других групп.

На рис. 2 представлены кривые зависимости уровня глюкозы в крови животных от времени, прошедшего после внутрибрюшинного введения им инсулина, а также значения показателя ППК.

У животных групп Г2 и Г5 развилась инсулинорезистентность, о чем свидетельствует достоверно более высокий уровень глюкозы после введения инсулина на протяжении 180 мин в сравнении с животными контрольной группы. После введения инсулина в течение 180 мин концентрация глюкозы в крови животных групп Г3, Г4 и К1 не различалась (см. рис. 2А). Полученные значения показателя ППК (см. рис. 2Б) наглядно подтверждают развитие состояния инсулинорезистентности у крыс групп Г2 и Г5 и сохранении чувствительности тканей к действию экзогенного инсулина у крыс групп Г3 и Г4, как и у животных контрольной группы К1. Для животных опытной группы Г4, получавших соевый белок и 30 мг на 1 кг концентрата фикоцианинов, различия достоверны относительно животных группы Г2.

В табл. 3-5 представлены результаты определения ряда показателей углеводного и липидного обмена в крови и печени животных всех групп после их выведения из эксперимента.

В сыворотке крови животных группы Г2 достоверно увеличился уровень общего холестерина при статистически значимом снижении концентрации триглицеридов. У животных групп Г4 и Г5 концентрация ЛПВП в сыворотке крови была достоверно ниже по сравнению с этим показателем для животных контрольной группы. Содержание ЛПВП в крови животных группы Г3 достоверно не отличалось в сравнении с контролем. У животных групп Г3 и Г4 выявлено достоверное снижение концентрации триглицеридов в сравнении с животными контрольной группы. Уровень общего билирубина крови является перспективным биомаркером оценки ввиду его влияния на процессы ингибирования окисления ЛПНП [20, 21]. Потребление ВЖ-рациона с добавлением 2% холестерина, независимо от потребления соевого белка и концентрата фикоцианинов, приводило к достоверному снижению уровня общего билирубина. Полученный результат свидетельствует о влиянии ВЖ-рациона и холестерина на метаболизм билирубина, при этом введение в рацион концентрата фикоцианинов, несмотря на гомологичность структуры с билирубином, не оказывало влияния на нормализацию значения данного показателя, а в высокой концентрации способствовало еще большему его снижению.

У животных опытных групп выявлено достоверное увеличение активности АЛТ в сыворотке крови, которое при отсутствии изменения активности АСТ, соответственно, приводило к снижению коэффициента де Ритиса. Активность АЛТ отображает уровень анаболизма, активность АСТ, наоборот, интенсивность катаболизма, при этом в здоровом организме катаболизм преобладает над анаболизмом. Полученное в нашем исследовании понижение величины коэффициента де Ритиса указывает на усиление процессов анаболизма [22] на фоне потребления ВЖ-рациона и холестерина независимо от добавления в рацион концентратов фикоцианинов и 50% замены казеина белком сои. При этом добавление в рацион соевого белка и концентрата фикоцианинов в дозе 300 мг на 1 кг массы тела приводило к достоверному снижению активности АЛТ по сравнению с показателем животных группы Г2.

Уровень общего белка в сыворотке крови был достоверно выше у животных групп Г2, Г3 и Г4 по сравнению с контролем. Полученный результат может также являться следствием потребления ВЖ-рациона и холестерина животными и свидетельствовать о различных патофизиологических процессах, таких как воспаление, нарушения работы печени или почек. При этом добавление в рацион соевого белка и фикоцианинов в дозе 300 мг на 1 кг массы тела приводило к нормализации общего белка до уровня контрольных животных.

Уровень глюкозы в крови животных группы Г4 был достоверно ниже по сравнению с показателем животных контрольной группы К1 и опытной группы Г2, а у животных группы Г5 концентрация глюкозы была достоверно выше по сравнению с уровнем у крыс групп Г3 и Г4.

У животных групп Г2, Г3 и Г5 выявлено накопление в сыворотке крови лептина, который регулирует массу тела, снижая аппетит и увеличивая расход энергии, тем самым модулируя термогенез [23]. Ожирение тесно связано с повышением уровня лептина и с последующим развитием резистентности, которая в первую очередь связана с дефектами транспорта лептина и сигнального пути рецептора лептина (клеточная резистентность к лептину) [24]. Лептин увеличивает чувствительность периферических тканей к инсулину и снижает его секрецию b-клетками поджелудочной железы, в связи с этим при наличии резистентности к лептину часто развивается и инсулинорезистентность [25]. Добавление в рацион животных группы Г4 соевого белка и концентрата фикоцианинов в дозировке 30 мг на 1 кг массы тела сдерживало рост лептина на уровне, статистически значимо не отличающемся от контроля.

У животных групп Г2, Г3 и Г5 концентрация грелина в сыворотке крови также была достоверно выше по сравнению с показателем животных контрольной группы, при этом у крыс, получавших концентрат фикоцианинов в дозе 30 мг на 1 кг массы тела и соевый белок, такого роста не произошло. Гиперсекреция грелина приводит к снижению утилизации жира и способствует развитию ожирения (стимулирует липогенез и тормозит липолиз), а также активирует синтез липидов печенью [26].

В нашем исследовании показано достоверное накопление гидроперекисей липидов в сыворотке крови всех животных, получавших ВЖ-рацион с добавкой холестерина, и МДА в сыворотке крови животных групп Г2, Г3 и Г5 по сравнению с контролем. Активные формы кислорода атакуют полиненасыщенные жирные кислоты и инициируют перекисное окисление липидов внутри клетки, что приводит к образованию побочных продуктов альдегидов, таких как МДА и гидроперекиси липидов [27]. В норме этот процесс физиологически сбалансирован за счет активности эндогенных антиоксидантных систем, которые способны увеличивать активность в ответ на возрастание прооксидантных воздействий, о чем свидетельствует повышение у животных групп Г2, Г3 и Г5 уровня СОД, антиоксидантного фермента, который обеспечивает естественную защиту клеток от воздействия свободных радикалов. Совместное введение в рацион животных концентрата фикоцианинов в дозе 30 мг на 1 кг массы тела и белка сои снижало содержание МДА в сыворотке крови до уровня контрольных животных. Также у этих животных не выявлено накопления в сыворотке крови фермента СОД, что свидетельствует о нормализующем действии низкой дозы фикоцианинов в сочетании с соевым белком на систему антиоксидантной защиты организма.

У животных всех опытных групп показано достоверное увеличение относительной массы печени, накопление жира (более чем в 3,5 раза), холестерина (более чем в 9 раз) и триглицеридов (более чем в 12 раз) в органе по сравнению с животными контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о развитии у животных неалкогольной жировой болезни печени, которая прогрессирует и начинается с отложения жира в печени (стеатоза) [28]. Добавление в рацион животных соевого белка и концентрата фикоцианинов в обеих дозировках не оказало благоприятных эффектов на показатели, характеризующие состояние печени лабораторных животных.

Обсуждение

В соответствии с Едиными санитарно-эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), адекватный и верхний допустимый уровни потребления фикоцианинов в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище составляют соответственно 50 и 150 мг/сут. При экстраполяции дозировок, использованных в нашем исследовании на животных, с учетом так называемого коэффициента подобия [29], доза концентрата фикоцианинов 30 мг на 1 кг массы тела крысы превышает в 2 раза верхний допустимый уровень потребления фикоцианинов для человека, а доза 300 мг на 1 кг массы тела крысы, соответственно, в 20 раз.

Согласно данным литературы внутрижелудочное введение животными высоких доз в основном коммерческих экстрактов биомассы A. platensis, содержащих в своем составе фикоцианины и фикобилипротеины, и нативной биомассы A. platensis оказывало положительные эффекты на организм животного при нарушениях углеводного и жирового обмена.

Например, введение экстракта A. platensis в дозе 150 мг на 1 кг половозрелым крысам-самцам, получавшим ВЖ высокосахарозный рацион в течение 8 нед, приводило к достоверному снижению уровня глюкозы в крови [30], что согласуется с полученными в нашем исследовании данными для группы животных, получавших низкую дозу фикоцианинов в сочетании с белком сои. Введение экстракта фикобилипротеинов в дозах 125 и 500 мг на 1 кг массы тела ежедневно в течение 6 нед половозрелым крысам-самцам линии Спрег-Доули, получавшим ВЖ-рацион, способствовало снижению набора массы тела, накопления липидных капель в тканях печени, уменьшению уровня в ней триглицеридов, общего холестерина и ЛПНП [31]. Тогда как в нашем исследовании фикоцианины в сочетании с соевым белком не оказывали влияния на данные показатели, что, вероятно, связано с тем, что фикобилипротеины, являющиеся простетической группой фикоцианинов, могут проявлять большую эффективность.

При введении в течение 60 дней высокой дозы нативной биомассы A. platensis (500 мг на 1 кг массы тела) половозрелым крысам-самцам альбиносам с нефропатией и диабетом, индуцированным стрептозотоцином (45 мг на 1 кг массы тела), показано снижение уровня глюкозы, гликированного гемоглобина, МДА и повышение уровня инсулина и активности антиоксидантных ферментов в сыворотке крови [32]. В работе [33] потребление крысами-самцами линии Спрег-Доули на фоне высокохолестеринового рациона A. platensis в количестве 3% от рациона способствовало достоверному снижению уровня грелина в сыворотке крови, а также ингибировало экспрессию рецепторов грелина. Аналогично этому сочетанное введение в рацион животных соевого белка и концентрата фикоцианинов в дозе 30 мг на 1 кг массы тела способствовало снижению уровня грелина, а также глюкозы и МДА в сыворотке крови, не оказывая влияния на концентрацию гликированного гемоглобина и инсулина.

Содержание фикоцианинов в нативной биомассе A. platensis составляет 6-20% от общего белка в зависимости от типа биомассы [34], помимо фикоцианинов биомасса богата другими антиоксидантными веществами, в том числе хлорофиллами и каротиноидами [35]. В нашем исследовании мы использовали экстракт c высокой степенью чистоты и содержанием фикоцианинов, более чем в 3,5 раза превышающим таковое в исходном сырье, при этом содержание других антиоксидантных веществ существенно снизилось, что может обусловливать отсутствие выявляемых для биомассы эффектов. В подавляющем большинстве исследований экстракты и нативную A. platensis вводили животным с использованием зонда непосредственно в желудок, в нашем исследовании экстракт добавляли в рацион животных, что также могло повлиять на проявляемую эффективность.

Выявленное в нашем исследовании снижение эффективности фикоцианинов в составе экстракта A. platensis при повышении дозировки до 300 мг на 1 кг массы тела животных может быть следствием проявления ими прооксидантных свойств. Как известно, по крайней мере 3 фактора могут влиять на функцию антиоксиданта, превращая его в прооксидант: концентрация антиоксиданта, его окислительно-восстановительный потенциал и наличие ионов металлов в среде. Например, витамин С и α-токоферол в зависимости от дозировки могут действовать и как антиоксиданты, и как прооксиданты. Прооксидантный эффект витамина С также проявляется, когда он соединяется с железом, восстанавливая Fe³⁺ до Fe²⁺, или с медью, восстанавливая ее с Cu²⁺ до Cu³⁺ [36]. Известно, что флавоноиды действуют как прооксиданты в системах, содержащих переходные металлы, так, кверцетин и кемпферол вызывают повреждение ДНК и перекисное окисление липидов в присутствии переходного металла [37]. Соответственно, для подтверждения прооксидантных эффектов фикоцианинов в высокой дозе требуется проведение дополнительных экспериментальных исследований. Они требуются в том числе для оценки перспектив применения фикоцианинов в сочетании с другими антиоксидантами.

Заключение

Замена 50% казеина в составе высокожирового рациона белком сои оказала определенное антиоксидантное и гипогликемическое действие, достоверно снизив в сыворотке крови крыс группы Г3 содержание гидроперекисей липидов и сохранив чувствительность тканей к действию экзогенного инсулина.

Сочетание концентрата фикоцианинов в дозировке 300 мг на 1 кг массы тела с 50% заменой казеина белком сои в составе ВЖ-рациона оказалось также недостаточно эффективным, снижая только активность АЛТ и концентрацию гидроперекисей липидов в сыворотке крови животных группы Г5 по сравнению с животными группы Г2. При этом статистически значимо были повышены жировая масса тела, уровень глюкозы и снижены мышечная масса тела и концентрация билирубина по сравнению с показателями животных групп Г3 и Г4. При этом сохранялись нарушения гормонального (повышенный уровень лептина и грелина) и антиоксидантного статуса (возросшая концентрация МДА и СОД) и развилась инсулинорезистентность, что может быть обусловлено возможным прооксидантным действием высокой дозировки фикоцианина. Однако подтверждение этого предположения требует дополнительного экспериментального исследования.

Добавление в рацион животных как соевого белка, так и в сочетании с концентратом фикоцианинов в обеих дозировках не оказывало благоприятного эффекта на показатели, характеризующие состояние печени и состав тела (увеличение процентного содержания жира с одновременным снижением мышечной массы тела).

Совместное влияние фикоцианинов в дозе 30 мг на 1 кг массы тела и 50-процентной замены казеина белком сои оказалось значительно более эффективным: достоверно снизило накопление гидроперекисей липидов, МДА и СОД, препятствовало развитию инсулинорезистентности, а также снижало уровни лептина и грелина до уровня контроля, что свидетельствует о проявлении антиоксидантной активности фикоцианинов при использовании в невысокой дозировке в сочетании с соевым белком.

Данные о благоприятном влиянии на липидный и углеводный обмен малой дозы (30 мг на 1 кг массы тела) фикоцианинов в сочетании с белком сои могут представить интерес для разработки функциональных пищевых ингредиентов, обладающих гипогликемическими и гиполипидемическими свойствами. Принимая во внимание предположение, что фикоцианины могут быть как антиоксидантами, так и прооксидантами и их введение в рацион при определенных условиях может представлять риски развития окислительного стресса, для достижения ожидаемых эффектов необходимо использовать дозировки, которые не превышают верхний допустимый уровень, а также оценить перспективы применения фикоцианинов в сочетании с другими антиоксидантами.

References

1. Chew N.W.S., Ng C.H., Tan D.J.H., Kong G., Lin C., Chin Y.H., et al. The global burden of metabolic disease: data from 2000 to 2019. Cell Metab. 2023; 35 (3): 414–28.e3. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.02.003

2. Quek J., Chan K.E., Wong Z.Y., Tan C., Tan B., Lim W.H., et al. Global prevalence of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in the overweight and obese population: a systematic review and meta-analysis. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2023; 8 (1): 20–30. DOI: https://doi.org/10.1016/S2468-1253(22)00317-X

3. Welsh A., Hammad M., Piña I.L., Kulinski J. Obesity and cardiovascular health. Eur J Prev Cardiol. 2024; 31 (8): 1026–35. DOI: https://doi.org/10.1093/eurjpc/zwae025

4. Gómez-Zorita S., Trepiana J., González-Arceo M., Aguirre L., Milton-Laskibar I., González M. et al. Anti-obesity effects of microalgae. Int J Mol Sci. 2019; 21 (1): 41. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21010041

5. Aissaoui O., Amiali M., Bouzid N., Belkacemi K., Bitam A. Effect of Spirulina platensis ingestion on the abnormal biochemical and oxidative stress parameters in the pancreas and liver of alloxan-induced diabetic rats. Pharm Biol. 2017; 55 (1): 1304–12. DOI: https://doi.org/10.1080/13880209.2017.1300820

6. Sadek K.M., Lebda M.A., Nasr S.M., Shoukry M. Spirulina platensis prevents hyperglycemia in rats by modulating gluconeogenesis and apoptosis via modification of oxidative stress and MAPK-pathways. Biomed Pharmacother. 2017; 92: 1085–94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2017.06.023

7. Pankaj P.P. Cell suspension of Spirulina platensis partially attenuates alloxan induced alterations in carbohydrate and lipid metabolism in diabetic mice. Int J Pharm Sci Res. 2016; 7: 2805–12. DOI: https://doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.7(7).2805-2812

8. Ou Y., Lin L., Pan Q., Yang X., Cheng X. Preventive effect of phycocyanin from Spirulina platensis on alloxan-injured mice. Environ Toxicol Pharmacol. 2012; 34 (3): 721–6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.etap.2012.09.016

9. El-Sayed E.M., Hikal M.S., Khair B.E., El-Ghobashy R.E., El-Assar A.M. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of Spirulina platensis, phycocyanin, phycocyanopeptide and phycocyanobilin on male diabetic rats. Arab Univ J Agric Sci. 2018; 26 (2A): 775–861. DOI: https://doi.org/10.21608/ajs.2018.28365

10. Nasirian F., Dadkhah M., Moradi-Kor N., Obeidavi Z. Effects of Spirulina platensis microalgae on antioxidant and anti-inflammatory factors in diabetic rats. Diabetes Metab Syndr Obes. 2018; 11: 375–80. DOI: https://doi.org/10.2147/DMSO.S172104

11. Cacciola N.A., De Cicco P., Milanović M., Milovanović I., Mišan A., Kojić D., et al. Role of Arthrospira platensis in preventing and treating high-fat diet-induced hypercholesterolemia in adult rats. Nutrients. 2024; 16 (12): 1827. DOI: https://doi.org/10.3390/nu16121827

12. Drapkina O.M., Kravchenko A.Ya., Budnevsky A.V., Kontsevaya A.V., Ryaskina M.S., Chernik T.A. Bilirubin and cardiovascular risk. Rossiyskiy kardiologicheskiy zhurnal [Russian Journal of Cardiology]. 2021; 26 (9): 116–21. DOI: https://doi.org/10.15829/1560-4071-2021-4511 (in Russian)

13. Kim S.Y., Park S.C. Physiological antioxidative network of the bilirubin system in aging and age-related diseases. Front Pharmacol. 2012; 3: 45. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2012.00045

14. Xiao C.W., Hendry A. Hypolipidemic effects of soy protein and isoflavones in the prevention of non-alcoholic fatty liver disease – a review. Plant Foods Hum Nutr. 2022; 77 (3): 319–28. DOI: https://doi.org/10.1007/s11130-022-00984-1

15. Hakkak R., Korourian S., Li W., Spray B., Twaddle N.C., Randolph C.E., et al. Dietary soy protein reverses obesity-induced liver steatosis and alters fecal microbial composition independent of isoflavone level. Front Nutr. 2024; 11: 1487859. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2024.1487859

16. Kozaczek M., Bottje W., Kong B., Dridi S., Albataineh D., Lassiter K., et al. Long-term soy protein isolate consumption reduces liver steatosis through changes in global transcriptomics in obese Zucker rats. Front Nutr. 2020; 7: 607970. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2020.607970

17. Jiang S., Ji S., Tang X., Wang T., Wang H., Meng X. A comparison study on the therapeutic effect of high protein diets based on pork protein versus soybean protein on obese mice. Foods. 2022; 11 (9): 1227. DOI: https://doi.org/10.3390/foods11091227

18. Biryulina N.A., Zorin S.N., Mazo V.K. Phycocyanin concentrates from Arthrospira platensis biomass: technology and composition characterization. Aktual’naya biotekhnologiya [Actual Biotechnology]. 2022; (1): 187–9. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=50113924 EDN: XPGCUC. (in Russian)

19. Minniti M.E., Ahmed O., Pedrelli M. Enzymatic quantification of liver lipids after Folch extraction. Methods Mol Biol. 2020; 2164: 101–8. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0704-6_11

20. Oda E. A decrease in total bilirubin predicted hyper-LDL cholesterolemia in a health screening population. Atherosclerosis. 2014; 235 (2): 334–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2014.05.927

21. Su Q., Chen H., Du S., Dai Y., Chen C., He T., et al. Association between serum bilirubin, lipid levels, and prevalence of femoral and carotid atherosclerosis: a population-based cross-sectional study. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023; 43 (1): 136–45. DOI: https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.122.318086

22. Rosly I.M., Vodolazhskaya M.G. Rules to interpret the biochemical analysis: Guide for physician. 2nd ed. Moscow: Meditsinskoe informatsionnoe agenstvo, 2014: 100 p. (in Russian)

23. Obradovic M., Sudar-Milovanovic E., Soskic S., Essack M., Arya S., Stewart A.J., et al. Leptin and obesity: role and clinical implication. Front Endocrinol (Lausanne). 2021; 12: 585887. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2021.585887

24. Li X., Wu Z., Chen Y., Cai R., Wang Z. Effect of acupuncture on simple obesity and serum levels of prostaglandin E and leptin in Sprague-Dawley rats. Comput Math Methods Med. 2021; 2021: 6730274. DOI: https://doi.org/10.1155/2021/6730274

25. Cochrane V., Shyng S.L. Leptin-induced trafficking of KATP channels: a mechanism to regulate pancreatic β-cell excitability and insulin secretion. Int J Mol Sci. 2019; 20 (11): 2660. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20112660

26. Gruzdeva O.V., Borodkina D.A., Belik E.V., Akbasheva O.E., Palicheva E.I., Barbarash O.L. Ghrelin physiology and pathophysiology: focus on the cardiovascular system. Kardiologiya [Cardiology]. 2019; 59 (3): 60–7. DOI: https://doi.org/10.18087/cardio.2019.3.10220 (in Russian)

27. Su L.J., Zhang J.H., Gomez H., Murugan R., Hong X., Xu D., et al. Reactive oxygen species-induced lipid peroxidation in apoptosis, autophagy, and ferroptosis. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 5080843. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/5080843

28. Pouwels S., Sakran N., Graham Y., Leal A., Pintar T., Yang W., et al. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): a review of pathophysiology, clinical management and effects of weight loss. BMC Endocr Disord. 2022; 22 (1): 63. DOI: https://doi.org/10.1186/s12902-022-00980-1

29. Bacil G.P., Romualdo G.R., Rodrigues J., Barbisan L.F. Indole-3-carbinol and chlorogenic acid combination modulates gut microbiome and attenuates nonalcoholic steatohepatitis in a murine model. Food Res Int. 2023; 174 (pt 1): 113513. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodres.2023.113513

30. Wan X.Z., Li T.T., Zhong R.T., Chen H.B., Xia X., Gao L.Y., et al. Anti-diabetic activity of PUFAs-rich extracts of Chlorella pyrenoidosa and Spirulina platensis in rats. Food Chem Toxicol. 2019; 128: 233–9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.04.017

31. Liu J., Wu H., Zhang Y., Hu C., Zhen D., Fu P., et al. Phycobiliprotein peptide extracts from Arthrospira platensis ameliorate nonalcoholic fatty liver disease by modulating hepatic lipid profile and strengthening fat mobilization. Nutrients. 2023; 15 (21): 4573. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15214573

32. Sadek K.M., Lebda M.A., Nasr S.M., Shoukry M. Spirulina platensis prevents hyperglycemia in rats by modulating gluconeogenesis and apoptosis via modification of oxidative stress and MAPK-pathways. Biomed Pharmacother. 2017; 92: 1085–94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2017.06.023

33. Esener O.B.B., Gurel-Gurevin E., Isbilen-Basok B., Yigit F., Bilal T., Altiner A., et al. Spirulina platensis affects factors involved in spermatogenesis and increases ghrelin receptors in testis tissue of rats fed a high-fat diet. Pol J Vet Sci. 2017; 20 (3): 467–75. DOI: https://doi.org/10.1515/pjvs-2017-0056

34. Shang M.H., Sun J.F., Bi Y., Xu X.T., Zang X.N. Fluorescence and antioxidant activity of heterologous expression of phycocyanin and allophycocyanin from Arthrospira platensis. Front Nutr. 2023; 10: 1127422. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2023.1127422

35. Jung F., Braune S., Jung C.H.G., Krüger-Genge A., Waldeck P., Petrick I., et al. Lipophilic and hydrophilic compounds from Arthrospira platensis and its effects on tissue and blood cells – an overview. Life (Basel). 2022; 12 (10): 1497. DOI: https://doi.org/10.3390/life12101497

36. Sotler R., Poljšak B., Dahmane R., Jukić T., Pavan Jukić D., Rotim C., et al. Prooxidant activities of antioxidants and their impact on health. Acta Clin Croat. 2019; 58 (4): 726–36. DOI: https://doi.org/10.20471/acc.2019.58.04.20

37. Yordi E.G., Pérez E.M., Matos M.J. Villares E.U. Antioxidant and pro-oxidant effects of polyphenolic compounds and structure-activity relationship evidence. In: J. Bouayed, T. Bohn (eds). Nutrition, Well-Being and Health. London: IntechOpen, 2012: 236 p. ISBN: 978-953-51-0125- 3. DOI: https://doi.org/10.5772/1864

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.