Modification of the method for detection of bacteria of the genus Cronobacter in dry products for infant nutrition

• Anna S. Polyanina
• Yulia M. Markova
• Natalya R. Efimochkina
• Svetlana A. Sheveleva

Abstract

Recently, there has been growing concern about contamination of dry foods for infants with the bacteria of the Cronobacter genus (formerly Enterobacter sakazakii), since its ingestion during feeding can lead to severe health problems, including disability in certain categories of this age group. The development of methods for Cronobacter spp. detection with high sensitivity and resolution is an urgent task due to the growing need for foods for infant artificial feeding.

The aim of the study was to compare methodological approaches to the detection of Cronobacter spp. in dry foods for the nutrition of infants and to propose an optimized scheme for the isolation and identification of the pathogen.

Material and methods. A comparative analysis of the literature and current methods (international and regional) for the detection of Cronobacter spp. (and in particular C. sakazakii) in dry foods for infants was carried out. The search was performed using the following databases: Russian Science Citation Index, PubMed, ScienceDirect, Google Scholar, the “TekhExpert” Russian information system, as well as on the websites of the International Organization for Standardization (ISO), U.S. Food and Drug Administration (FDA), and European Food Safety Authority (EFSA) using the keywords: Cronobacter spp., Enterobacter sakazakii.

Results. Methodological approaches have been substantiated that make it possible to conduct studies of dry foods for infant nutrition (including formulas) with a greater degree of efficiency and reliability for the presence of Cronobacter spp.: an increase in cultivation time at the stage of non-selective enrichment by 33%; the use of two differential diagnostic media and two temperature cultivation modes at the stage of culture isolation.

Conclusion. It is suggested that the use of the only one nutrient medium at the stages of selective cultivation and isolation, and incubation at elevated temperatures can lead to the loss of isolation of fastidious microorganisms that are present in the product in low concentrations. An optimized scheme for the microbiological testing of dry foods for infant nutrition for the presence of the Cronobacter genus bacteria based on a combination of cultural and/or PCR techniques has been proposed.

Keywords: Cronobacter spp.; Enterobacter sakazakii; infant dry foods; detection

В методике FDA (BAM, Chapter 29: Cronobacter) этап селективного обогащения отсутствует, и после неселективного обогащения пересев проводится на 2 (или 3–4) хромогенных агара. Дальнейшие этапы методики предусматривают выявление бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности хромогенного агара, с последующим выделением чистой культуры. Методика предусматривает возможность использования ПЦР-анализа в реальном времени на этапе идентификации выделенных штаммов или их дифференциацию по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к роду Cronobacter. Однако ПЦР-анализ является методом скрининга и его положительные результаты должны быть подтверждены с помощью культурального метода.

Нижний предел температурного диапазона на этапе предварительного обогащения по ISO 22964:2017 и FDA BAM Chapter 29 равен 34 °С, в то время как у остальных методик он равен 36 °С. Верхний предел по всем методикам достигает 38 °С. Длительность культивирования по методикам ISO и МУК 4.2.3144-13 составляет всего 16–20 ч (18–24 ч по МУК 4.2.2872-11 и 20–26 ч по FDA BAM Chapter 29). Температурный диапазон инкубирования на этапе селективного обогащения и роста на дифференциально-диагностическом агаре в последней редакции ISO 22964 снижен до 40,5–42,5 °С (против 43,5–45,5 °С ISO 22964:2006 и МУК 4.2.3144-13) при одинаковом времени культивирования 22–26 ч. В свою очередь, согласно методике FDA, культивирование на основных агарах (DFI и R&F) проводится при 34–38 °С и том же времени.

Стоит отметить, что на этапе селективного обогащения используется только 1 бульон (а в методике FDA этот этап вообще отсутствует). Также и на этапе выделения используется 1 селективный агар (исключение – FDA BAM Chapter 29).

Использование только одной среды на этапах селективного обогащения и выделения в совокупности с высокой температурой инкубации (по верхнему пределу оптимального диапазона для Cronobacter) может приводить к потерям при выделении целевых микроорганизмов, находящихся в продукте в очень низких концентрациях. Так, при исследованиях молочных и немолочных компонентов для производства продуктов детского питания Cronobacter spp. были выявлены на уровне от 0,01 до 10 КОЕ/г [11].

Исходя из вариабельности биологических свойств Cronobacter spp. [4], а также по аналогии с выявлением индикаторных микроорганизмов – сальмонелл, считаем необходимым предусмотреть большее варьирование параметров культивирования (температуры и длительности инкубирования) для повышения выявляемости Cronobacter. Предложена схема выделения бактерий рода Cronobacter (см. рисунок), принципиально аналогичная схеме анализа пищевых продуктов по выявлению патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл. Схема включает предварительное обогащение в ЗПВ с увеличением времени культивирования до 22–26 ч по сравнению с утвержденными методиками, дальнейший пересев на жидкую селективную питательную среду (CSB) и параллельно на 2 селективных хромогенных агара (CCI агар и ESIA™).

Культура из селективного CSB-бульона после инкубации также пересевается на 2 дифференциальных агара. От mLST-ванкомицинового бульона было решено отказаться с учетом факторов, препятствующих возможному росту Cronobacter: включение в состав сред двух селективных агентов (ванкомицин, лаурил сульфат), способных тормозить рост чувствительных штаммов; повышенная температура культивирования (44±0,5) °С, способная ингибировать рост термочувствительных штаммов.

Для повышения частоты выявляемости штаммов Cronobacter spp. с низкой термотолерантностью и большей чувствительностью к ингибирующим агентам инкубацию посевов на хромогенном агаре ESIА предлагается проводить при более низкой температуре – 37±1 °С. В связи с тем, что другие представители семейства Enterobacteriaceae по сравнению с Cronobacter spp. обладают меньшей устойчивостью к высушиванию в процессе изготовления сухих молочных смесей для питания детей раннего возраста, вероятность их сопутствующего роста достаточно мала.

Что касается возможного микробного загрязнения продукции при сухом смешивании компонентов: сопутствующая микрофлора будет идентифицирована при проведении исследований по регламентируемым показателям, а дифференциально-диагностические среды для выделения и идентификации Cronobacter spp. содержат селективные добавки, подавляющие рост энтеробактерий других родов, и хромогенный субстрат, утилизация которого характерна только для представителей рода Cronobacter.

В результате проведенного анализа обоснованы методические подходы, позволяющие c большей степенью эффективности и достоверности проводить исследования сухих продуктов для питания детей раннего возраста на наличие бактерий рода Cronobacter spp.: увеличение длительности культивирования посевов на этапе неселективного обогащения на 33%; применение на этапе выделения культур 2 агаризованных дифференциально-диагностических сред – Кронобактер хромогенного агара (CCI) и Enterobacter sakazakii селективного агара (ESIA™) со снижением температуры культивирования на ESIA™.

Заключение

Сравнительный анализ применяемых в ЕАЭС, в странах – членах Всемирной торговой организации и Европейского союза стандартизованных методов определения бактерий рода Cronobacter в пищевых продуктах для детского питания показал отсутствие принципиальных различий в международных и региональных стандартах при изоляции и идентификации данных патогенов (алгоритм выделения, продолжительность культивирования, состав питательных сред). Вместе с тем отмечены особенности, свидетельствующие о несходстве методического подхода, принятого при детекции индикаторных патогенных бактерий рода Salmonella в продуктах для массового потребления, который направлен на максимальное восстановление угнетенных технологическими стрессами физиологических свойств патогена данного рода, и зауженного подхода, используемого при выявлении опасных для уязвимого контингента детей раннего возраста патогенов рода Cronobacter, как правило, подвергающихся наиболее жестким стрессовым воздействиям (сушка продуктов при высоких температурах) и содержащихся в исследуемых продуктах в экстремально низких количествах.

Высказано предположение, что применение лишь одной питательной среды, как на этапе селективного культивирования, так и для выделения колоний, а также инкубация посевов при максимально переносимых кронобактерами температурах, что в основном направлено на подавление сопутствующей микрофлоры, может приводить к потере чувствительных штаммов целевых микроорганизмов, находящихся в продукте в низких концентрациях.

Для повышения эффективности микробиологического определения Cronobacter spp. в сухих продуктах для детского питания предложена модифицированная схема микробиологического исследования на наличие бактерий рода Cronobacter, основанная на комбинации культуральных и/или ПЦР-этапов, предусматривающая двойное обогащение и селекцию на жидких и плотных средах при оптимальных и при максимально переносимых представителями рода температурах.

Учитывая большую значимость проблемы, представляется необходимым проведение дальнейших исследований для методического совершенствования алгоритмов выявления бактерий Cronobacter spp. и способов их идентификации, позволяющих снизить риск получения некорректных ложноположительных или ложноотрицательных результатов анализа.

References

1. Cechin C.D.F., Carvalho G.G., Bastos C.P., Kabuki D.Y. Cronobacter spp. in foods of plant origin: occurrence, contamination routes, and pathogenic potential. Crit Rev Food Sci Nutr. 2023; 63 (33): 12 398–412. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2022.2101426

2. Cronobacter and Powdered Infant Formula Investigation (Updated May 24, 2022) [Electronic resource]. CDC. URL: https://www.cdc.gov/cronobacter/outbreaks/infant-formula.html (date of access November 13, 2023).

3. Haston J.C., Miko S., Cope J.R., McKeel H., Walters C., Joseph L.A., et al. Cronobacter sakazakii infections in two infants linked to powdered infant formula and breast pump equipment – United States, 2021 and 2022. MMWR Morb Mortal Weekly Rep. 2023; 72 (9): 223–6. DOI: https://doi.org/10.15585/mmwr.mm7209a2

4. Ling N., Forsythe S., Wu Q., Ding Y., Zhang J., Zeng H. Insights into Cronobacter sakazakii biofilm formation and control strategies in the food industry. Engineering. 2020; 6 (4): 393–405. DOI: https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.007

5. Strysko J., Cope J.R., Martin H., Tarr C., Hise K., Collier S., Bowen A. Food safety and invasive Cronobacter infections during early infancy, 1961–2018. Emerg Infect Dis. 2020; 26 (5): 857. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2605.190858

6. Elkhawaga A.A., Hetta H.F., Osman N.S., Hosni A., El-Mokhtar M.A. Emergence of Cronobacter sakazakii in cases of neo-natal sepsis in upper Egypt: first report in North Africa. Front Microbiol. 2020; 11: 215. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00215

7. European Food Safety Authority (EFSA); European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). The European Union One Health 2022 Zoonoses report. EFSA J. 2023; 21 (12): e8442. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8442

8. European Food Safety Authority (EFSA); European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). The European Union One Health 2023 Zoonoses report. EFSA J. 2024; 22 (12): e9106. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2024.9106

9. Osaili T., Forsythe S. Desiccation resistance and persistence of Cronobacter species in infant formula. Int J Food Microbiol. 2009; 136 (2): 214–20. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.08.006

10. Holý O., Forsythe S. Cronobacter spp. as emerging causes of healthcare-associated infection. J Hosp Infect. 2014; 86 (3): 169–77. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhin.2013.09.011

11. Polyanina А.S., Bykova I.B., Simonenko Е.S., Efimochkina N.R., Sheveleva S.А. Substantiation of ways to reduce contamination by bacteria of the genus Cronobacter of dry specialized products for baby food during their production. Analiz riska zdorov’yu [Health Risks Analysis]. 2024; (1): 59–70. DOI: https://doi.org/10.21668/health.risk/2024.1.06 (in Russian)

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.