Модификация метода определения бактерий рода Cronobacter в сухих продуктах для питания детей раннего возраста

Полянина Анна Сергеевна; Маркова Юлия Михайловна; Ефимочкина Наталья Рамазановна; Шевелева Светлана Анатольевна

Резюме

В последнее время все большую озабоченность вызывает загрязненность сухих пищевых продуктов для питания детей раннего возраста бактериями рода Cronobacter (ранее Enterobacter sakazakii), так как попадание этих микроорганизмов в организм детей во время кормления может приводить к серьезным проблемам со здоровьем, в том числе к инвалидизации у определенных категорий этой возрастной группы. Разработка методов обнаружения Cronobacter spp., обладающих высокой чувствительностью и разрешающей способностью, является актуальной задачей в связи с растущей потребностью в пищевых продуктах для искусственного вскармливания детей раннего возраста.

Цель исследования - сравнить методические подходы к обнаружению Cronobacter spp. в сухих продуктах для питания детей первого года жизни и предложить оптимизированную схему выделения и идентификации возбудителя.

Материал и методы. Проведен сравнительный анализ литературы и действующих методик (международных и региональных) обнаружения Cronobacter spp. (в частности, Cr. sakazakii) в сухих пищевых продуктах для питания детей раннего возраста. Поиск осуществлялся по базам данных РИНЦ, PubMed, ScienceDirect, Google Scholar, информационной системой "Техэксперт", а также на сайтах агентств International Organization for Standardization (ISO), U.S. Food and Drug Administration (FDA), European Food Safety Authority (EFSA) с использованием ключевых слов Cronobacter spp., Enterobacter sakazakii.

Результаты. Обоснованы методические подходы, позволяющие c большей степенью эффективности и достоверности проводить исследования сухих продуктов для питания детей раннего возраста на наличие бактерий рода Cronobacter spp.: увеличение на 33% длительности этапа неселективного обогащения посевов; применение 2 агаризованных дифференциально-диагностических сред для выделения культур и 2 температурных режимов культивирования.

Заключение. Высказано предположение, что применение только одной питательной среды на этапах селективного культивирования и выделения и инкубация при повышенных температурах может приводить к потерям при выделении целевых патогенов, находящихся в продукте в низких концентрациях. Предложена оптимизированная схема микробиологического исследования сухих пищевых продуктов для питания детей раннего возраста на наличие бактерий рода Cronobacter, основанная на комбинации культуральных методов и/или метода полимеразной цепной реакции.

Ключевые слова: Cronobacter spp.; Enterobacter sakazakii; продукты для питания детей раннего возраста; обнаружение

Cronobacter spp. - род эмерджентных бактерий семейства Enterobacteriaceae. Повсеместно распространены в окружающей среде, обнаруживаются на объектах производства пищевых продуктов [1-3]. Бактерии рода Cronobacter при попадании в организм с пищей могут вызывать энтероколиты, септицемию и менингит. Наиболее опасна инфекция для детей младше 6 мес, особенно недоношенных или имеющих иммунодефицитные состояния. Смертность среди этой категории инфицированных может достигать 80%. Последствия инфекции могут приводить к инвалидизации, включая задержку психического развития и другие неврологические заболевания [4, 5].

Чаще всего источником инфицирования являются сухие молочные смеси для питания детей раннего возраста [6-8]. Причем инфекция может возникать даже при очень малых дозах возбудителя, когда его количество не превышает или ниже допустимого уровня колиформных бактерий, установленного нормативными документами Комиссии Кодекс Алиментариус [9, 10]. Точное определение инфицирующей дозы затруднено в связи с невозможностью в большинстве случаев установления источника инфекции.

С целью гармонизации применяемых в Евразийском экономическом союзе (ЕАЭС) методик с международными стандартами в 2024 г. нами был подготовлен межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 22964-2024 "Микробиология пищевой цепи. Горизонтальный метод обнаружения Cronobacter spp.", который является идентичным международному стандарту ISO 22962:2017 "Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection of Cronobacter spp."¹. Данная разработка проведена в рамках обновления методической базы контроля безопасности специализированной пищевой продукции. Стандарт введен в действие 01.11.2025 приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 декабря 2024 г. № 2008-ст с правом досрочного применения. Предполагается, что стандарт позволит контролировать пищевые продукты для питания детей раннего возраста методами, гармонизированными с международными стандартами.

¹ ISO 22964:2017(en) Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.

ГОСТ ISO 22964-2024 устанавливает горизонтальный метод обнаружения Cronobacter spp. в пищевых продуктах и в ингредиентах, предназначенных для потребления человеком и кормления животных, а также в образцах окружающей среды из зоны производства и переработки пищевых продуктов. Метод включает предварительное обогащение в неселективной среде - в забуференной пептонной воде (ЗПВ) с дальнейшим пересевом в селективную жидкую среду - селективный бульон Cronobacter (CSB), после культивирования которой проводится высев на Кронобактер-хромогенный агар (Chromogenic Cronobacter Isolation, CCI) с последующим биохимическим подтверждением принадлежности выросших колоний роду Cronobacter. Таким образом, в данном стандарте будет использована только одна среда для селективного накопления и один агар для дифференциации выявленных изолятов.

Наш опыт микробиологических исследований отечественных и импортных сухих продуктов для питания детей раннего возраста и компонентов для их производства при использовании стандартизованных методов контроля в период 2005-2023 гг. свидетельствует о невысоком проценте обнаружения Cronobacter в этих продуктах - 0,9% (4 образца из 429 исследованных) [11].

Такие результаты могут быть обусловлены методическими подходами, в которых не регламентируется принцип двойного обогащения и использования различных по составу дифференциальных сред для выделения различных представителей рода Cronobacter.

Для сравнения при выявлении в продуктах массового потребления индикаторных патогенов - бактерий рода Salmonella - реализуется принцип двойного обогащения и использования параметров выращивания, благоприятных для выделения максимально большего числа видов сальмонелл с отличающимися оптимумами температур и потребностями в питательных веществах на этапах селективного накопления и дифференциации². Указанные условия повышают чувствительность и разрешающую способность метода.

² ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002). Метод выявления бактерий рода Salmonella [Текст]. Введ. 2013-07-01. Москва : Стандартинформ, 2014. 20 с.

Изложенное выше обусловливает необходимость совершенствования методов обнаружения Cronobacter spp., обладающих большей чувствительностью и разрешающей способностью.

Цель исследования - сравнить методические подходы к обнаружению Cronobacter spp. в сухих продуктах для питания детей первого года жизни и предложить оптимизированную схему выделения и идентификации возбудителя.

Материал и методы

В рамках разработки методов был проведен сравнительный анализ научных публикаций и действующих методик (международных и региональных) обнаружения Cronobacter spp. (в частности, Cr. sakazakii) в сухих пищевых продуктах для питания детей раннего возраста. Поиск осуществляли по базам данных РИНЦ, PubMed, ScienceDirect, Google Scholar, информационной системой "Техэксперт", а также на сайтах агентств International Organization for Standardization (ISO), U.S. Food and Drug Administration (FDA), European Food Safety Authority (EFSA) с использованием ключевых слов Cronobacter spp., Enterobacter sakazakii.

Результаты и обсуждение

Для оптимизации схемы микробиологического посева нами были проанализированы методики обнаружения Cronobacter spp. в пищевых продуктах, применяемые на территории РФ, ЕАЭС, Европейского союза и США (см. таблицу).

В последней редакции международного стандарта ISO 22964 от 2017 г. расширена область применения метода: документ распространяется не только на сухое молоко и сухие молочные смеси для питания детей раннего возраста, но и на любые пищевые продукты для питания людей, ингредиенты для их изготовления и корма для животных, а также пробы окружающей среды, включая объекты производственной среды предприятий по изготовлению сухих детских смесей. Кроме того, используемый в предыдущей версии стандарта 2013 г. (ISO/TS 22964:2006) модифицированный лаурилсульфатно-триптозный бульон (mLST) заменен на селективный бульон Cronobacter (CSB); Enterobacter sakazakii селективный агар (ESIA™) заменен на Кронобактер хромогенный агар (CCI).

Селективный бульон Cronobacter в качестве источника аминокислот и микроэлементов содержит ферментативный гидролизат животных тканей и мясной экстракт. Для создания осмотического равновесия используется хлористый натрий в количестве 5%. В качестве источника углерода бульон содержит лактозу, ферментация которой определяется по изменению цвета индикатора бромкрезолового пурпурного, входящего в состав среды. Для подавления роста грамположительной микрофлоры в CSB-бульон включен ванкомицин.

Кронобактер хромогенный агар по сравнению с ESIA™ содержит почти в 2 раза меньше дезоксихолата натрия - ингибитора грамположительной микрофлоры - и не содержит кристаллического фиолетового, также обладающего антибактериальным действием. Для дифференциации Cronobacter от продуцирующих сероводород бактерий семейства Enterobacteriaceae в состав среды включены тиосульфат натрия и цитрат аммонийного железа (III). Дифференциация Cronobacter от представителей других семейств основана на утилизации хромогенного субстрата (5-бром-4-хлор-3-индолил-α-D-глюкопиранозида).

В качестве источника аминокислот и микроэлементов mLST-бульон (по ГОСТ ISO/TS 22964-2013) содержит ферментативный гидролизат тканей животных и растений, источником углерода является лактоза. Для создания осмотического баланса добавлены буферные соли. Сочетание ванкомицина и лаурилсульфата натрия подавляет рост грамположительных микроорганизмов.

В соответствии с МУК 4.2.2872-11 и ГОСТ Р 57989-2017 для селективного накопления используют одну из жидких питательных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae: среду Кесслер с глюкозой, глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью или бульон Мак-Конки с глюкозой. Дифференциация выросших колоний проводится на агаре Эндо или VRBG-агаре (фиолетово-красном желчном агаре с глюкозой) только по изменению цвета индикатора в результате ферментации углеводов.

Enterobacter Sakazakii Agar, BAM Media M201, DFI-агар - это разработанная C. Iversen и соавт. [12] формула, содержащая в качестве источника аминокислот и микроэлементов триптон и соевый пептон, хлористый натрий для создания осмотического равновесия, дезоксихолат натрия, хромогенный субстрат - 5-бром-4-хлор-3-индолил-α-D-глюкопиранозид, тиосульфат натрия и цитрат аммонийного железа (III).

Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium (М-0700, BAM Media M202), R&F^®-агар содержит в качестве источника аминокислот, микроэлементов и витаминов триптон, пептон, протеозопептон и дрожжевой экстракт. Среда также содержит дезоксихолат натрия - ингибитор грамположительной микрофлоры. Но в отличие от вышеперечисленных селективных агаров, R&F-агар содержит 2 хромогенных субстрата (Х-α-D-глюкопиранозид и Х-β-D-целлобиозид) для обнаружения α-глюкозидазы и β-целлобиозидазы, свойственных для всех Cronobacter, и 3 сахара (сорбит, D-арабитол, адонит), которые Cronobacter не способен ферментировать. Краситель феноловый красный обеспечивает фоновый цвет для агара и также является индикатором pH среды.

Методики по ISO 22964:2017, ГОСТ ISO/TS 22964-2013 и МУК 4.2.3144-13 включают следующие этапы анализа на наличие Cronobacter: неселективное обогащение, селективное обогащение, выделение и биохимическое подтверждение. МУК 4.2.3144-13 допускает применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) после этапа селективного обогащения без дальнейшего подтверждения на селективном агаре.

Методические указания МУК 4.2.2872-11 и ГОСТ Р 57989-2017 основаны на обнаружении строго специфических последовательностей (фрагментов) ДНК бактерий путем ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, проводимой только после этапов неселективного и селективного обогащения.

Литература

1. Cechin C.D.F., Carvalho G.G., Bastos C.P., Kabuki D.Y. Cronobacter spp. in foods of plant origin: occurrence, contamination routes, and pathogenic potential // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2023. Vol. 63, N 33. Р. 12 398-12 412. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2022.2101426

2. Cronobacter and Powdered Infant Formula Investigation (Updated May 24, 2022) [Electronic resource]. CDC. URL: https://www.cdc.gov/cronobacter/outbreaks/infant-formula.html (дата обращения: 13.11.2023).

3. Haston J.C., Miko S., Cope J.R., McKeel H., Walters C., Joseph L.A. et al. Cronobacter sakazakii infections in two infants linked to powdered infant formula and breast pump equipment - United States, 2021 and 2022 // MMWR Morb. Mortal. Weekly Rep. 2023. Vol. 72, N 9. Р. 223-226. DOI: https://doi.org/10.15585/mmwr.mm7209a2

4. Ling N., Forsythe S., Wu Q., Ding Y., Zhang J., Zeng H. Insights into Cronobacter sakazakii biofilm formation and control strategies in the food industry // Engineering. 2020. Vol. 6, N 4. P. 393-405. DOI: https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.007

5. Strysko J., Cope J.R., Martin H., Tarr C., Hise K., Collier S., Bowen A. Food safety and invasive Cronobacter infections during early infancy, 1961-2018 // Emerg. Infect. Dis. 2020. Vol. 26, N 5. Р. 857. DOI: https://doi.org/10.3201/eid2605.190858

6. Elkhawaga A.A., Hetta H.F., Osman N.S., Hosni A., El-Mokhtar M.A. Emergence of Cronobacter sakazakii in cases of neo-natal sepsis in upper Egypt: first report in North Africa // Front. Microbiol. 2020. Vol. 11. Р. 215. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00215

7. European Food Safety Authority (EFSA); European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). The European Union One Health 2022 Zoonoses report // EFSA J. 2023. Vol. 21, N 12. Article ID e8442. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8442

8. European Food Safety Authority (EFSA); European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). The European Union One Health 2023 Zoonoses report // EFSA J. 2024. Vol. 22, N 12. Article ID e9106. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2024.9106

9. Osaili T., Forsythe S. Desiccation resistance and persistence of Cronobacter species in infant formula // Int. J. Food Microbiol. 2009. Vol. 136, N 2. P. 214-220. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.08.006

10. Holý O., Forsythe S. Cronobacter spp. as emerging causes of healthcare-associated infection // J. Hospp. Infect. 2014. Vol. 86, N 3. P. 169-177. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhin.2013.09.011

11. Полянина А.С., Быкова И.Б., Симоненко Е.С., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обоснование путей снижения контаминации бактериями рода Cronobacter сухих специализированных продуктов для детского питания на этапе их производства // Анализ риска здоровью. 2024. № 1. С. 59-70. DOI: https://doi.org/10.21668/health.risk/2024.1.06

12. Iversen C., Druggan P., Schumacher S., Lehner A., Feer C., Gschwend K. et al. Development of a novel screening method for the isolation of "Cronobacter" spp. (Enterobacter sakazakii) // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74, N 8. Р. 2550-2553. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.02801-07

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.