Experimental and scientific formulation development of a specialized (sport) product, enriched with probiotic microorganisms

• Gavrilova N.B.
• Mikhail P. Schetinin
• Chernopolskaya N.L.

AbstractThe aim of the work is to scientifically justify the formulation of a probiotic food product for sports nutrition using a functional food ingredient. As a functional food ingredient, the association of probiotics (Lactobacillus and bifidobacteria) immobilized in a gel of biopolymers was studied. The main raw material used was cow's fat-free milk; as components that regulated the protein-carbohydrate composition of a multicomponent product, the whey protein isolate, natural honey and maltodextrin were chosen. A complex containing defibrated blood and an extract of reindeer antlers was used as an adaptogen of animal origin. In order to complement the qualitative and quantitative composition of vitamins and minerals, a premix containing 7 vitamins, calcium and iron was used. The process of obtaining a functional ingredient for fermenting a normalized mixture and enriching the product with viable probiotic cells is outlined. To protect them in the aggressive conditions of the technological process, as well as in the stomach and intestine, the process of immobilization by incorporating the association of probiotics into the gel of biopolymers was studied. The effectiveness of the delivery of the association of probiotic microorganisms immobilized in the gel of biopolymers was proved by carrying out studies in simulated conditions of the stomach and intestine. The functional food ingredient obtained experimentally was used for fermentation of a normalized mixture of components in the technology of a fermented (sour-milk) product for sport's nutrition.

Keywords:functional food product, sport nutrition, fortified foods, probiotics, immobilization, functional food ingredient

Питание является важнейшим фактором, интегри­рующим здоровье человека с момента зачатия и в течение всей жизни", - подчеркнул академик РАН В.А. Тутельян, формируя основные составляющие при­нципы продовольственной безопасности страны [1].

О значимости здорового питания свидетельствуют приоритетные задачи государственной политики РФ по увеличению объема и расширению ассортимента важных категорий пищевых продуктов, обогащенных функциональными ингредиентами, специализирован­ных и функциональных пищевых продуктов [2]. Разра­ботаны и действуют законодательные и нормативные правовые документы, регламентирующие производство обогащенных, специализированных и функциональных пищевых продуктов в рамках организации здорового питания населения страны [3-5].

Одной из важнейших категорий специализирован­ных пищевых продуктов являются продукты для лиц, систематически занимающихся физической культурой, фитнесом, любительским и профессиональным спор­том. Современный спорт связан со значительными физическими и психологическими нагрузками. Устой­чивость организма спортсмена к стрессовым ситуациям существенно повышается при рациональном питании, обеспечивающем адекватное поступление энергии и биологически активных веществ. В настоящее время все большую популярность приобретает точка зрения, что пищевой статус и структура питания спортсменов служат одним из главных факторов, определяющих уровень спортивных достижений. Адекватное питание одна из составляющих достижения высоких спортив­ных результатов, тогда как неадекватное поступление нутриентов в организм спортсмена в условиях ин­тенсивных физических и нервно-психических нагрузок чревато весьма неблагоприятными последствиями не только для спортивной формы, но и для его здоро­вья. Для решения проблемы оптимального сбалансиро­ванного питания спортсменов необходимы разработка и внедрение в производство отечественных специа­лизированных продуктов заданного состава (высоко­белковые, высокоуглеводные, углеводно-минеральные и др.), которые должны способствовать увеличению работоспособности, выносливости, быстрейшему вос­становлению организма спортсмена после физической нагрузки и, в конечном итоге, улучшению спортивных достижений [6, 7].

Продукты, предназначенные для питания спортсме­нов, должны не только снабжать организм необходи­мыми нутриентами, но и легко усваиваться, способствуя быстрому восстановлению энергии, затраченной во время тренировок и соревнований. В ассортименте таких продуктов одно из ведущих мест занимают фер­ментированные кисломолочные продукты, которые получают путем использования лакто- и бифидобактерий [8, 9].

Бактерии в процессе ферментации синтезируют не­большие количества витаминов (в частности, В₁₂, фолиевую кислоту, биотин), аминокислот и биологически активных пептидов. Бифидо- и лактобактерии имеют выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, спо­собствуют поддержанию оптимального количественного и качественного состава кишечной микрофлоры, по­этому важно, чтобы они достигали кишечника в актив­ном жизнеспособном состоянии.

Цель работы - научно обосновать рецептуру специа­лизированного пробиотического пищевого продукта для питания спортсменов с использованием функциональ­ного пищевого ингредиента - ассоциации пробиотиков (лакто- и бифидобактерий), иммобилизованных в гель биополимеров.

Материал и методы

В качестве основного сырья использовалось молоко коровье сырое; в качестве компонентов, регулирую­щих белково-углеводный состав многокомпонентного продукта, были выбраны изолят сывороточных белков, мед натуральный пчелиный), мальтодекстрин, а также использовались биологически активная добавка к пище "Пантогематоген Северный" (ЗАО "Фермент", РФ) с содержанием железа 275-325 мг/кг и витаминно-минеральный премикс "Валетек 7" (ЗАО "Валетек Продимпэкс", РФ).

Для исследования функционального пищевого ингре­диента составлена ассоциативная закваска на основе культур Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, Streptococcus salivarius subsp. thermophillus. Для иммо­билизации в качестве носителя использовали биопо­лимеры желатин пищевой, частично амидированный низкоэтерифицированный пектин (Гену® пектин LM-106 AS-YA) и крахмал в соотношении 5:1:1. Процесс микрокапсулирования проводили в микробиологическом боксе с системой очистки (TENCAN, Китай) на пилотной установке.

Деградация капсул была исследована в ходе ими­тации модели переваривания в желудочно-кишечном тракте. Модель желудочного сока: 2% водный раствор NaCl, pH 2,0 (1 М HCl), пепсин 3600 Ед/мл, темпера­тура 37 °С. Образцы инкубировали в водяной бане при постоянном встряхивании в течение 120 мин. Мо­дель кишечного сока: 0,68% KH₂PO₄; 0,1% солей жел­чных кислот; 0,4% панкреатина, pH 7,5 (0,5 M NaOH), температура 37 °С [10].

Изучение морфологии микроорганизмов проводили методом микроскопирования фиксированных и окрашен­ных фуксином препаратов на микроскопе "Axioskop 40" (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 10x63.

Повторность опытов 3-5-кратная. Статистическую обработку полученных данных проводили с использова­нием программы Statistica 6.1.

Результаты и обсуждение

Перспективным направлением в производстве спе­циализированных продуктов для питания спортсменов является повышение пищевой и биологической цен­ности продуктов путем направленного регулирования их химического состава. В свете этого разработка новых групп молочных продуктов, предназначенных для индивидуализации питания спортсменов в различ­ные периоды тренировочных макроциклов, является актуальной [7].

В соответствии с классификацией продуктов для пи­тания спортсменов [6], кисломолочный (ферментирован­ный) продукт следует отнести к продуктам категории А, определяемых как богатые углеводами энергетические пищевые продукты (гейнеры). Компонентный состав такого продукта должен быть представлен, прежде всего, углеводами и белками. Целесообразно введе­ние витаминов Е, С, группы В, минеральных веществ, таких как натрий, калий, фосфор, кальций и железо, а также функциональных ингредиентов: адаптогенов и пробиотиков.

На первом этапе, при проектировании рецептуры про­дукта белковый состав регулировали добавлением бел­ков сыворотки молока. Для исследования был выбран изолят - высокоочищенная форма (90,0±0,5% белка), которая практически не содержит жира, холестерина и углеводов (лактоза). Изолят сывороточного белка имеет высокую концентрацию аминокислот с разветв­ленными боковыми цепочками (ВСАА), которые преоб­ладают в метаболизме мышечной ткани. Они исполь­зуются организмом в качестве источника энергии для сокращения мышц, а также строительного субстрата для построения мышечных волокон.

Углеводный состав продукта представлен сочетанием меда, содержащего легкоусвояемые сахара в сочетании с пыльцой и маточным молочком [11], и мальтодекстрина, также имеющего высокий гликемический индекс (от 105 до 136) и широко использующегося в продуктах спор­тивного питания [12].

В качестве адаптогена животного происхождения, способствующего восстановлению организма спортс­менов после усиленных нагрузок во время тренировок и соревнований [13], использовали дефибрированную кровь и экстракт пантов северного оленя. Для допол­нения качественного и количественного состава вита­минов и минеральных веществ, которые содержатся в молочной основе и других компонентах рецептуры [14], был использован витаминно-минеральный премикс [15], содержащий 7 витаминов, кальций и железо.

На втором этапе исследовали получение пищевого функционального ингредиента для ферментации нор­мализованной смеси и обогащения продукта жизнеспо­собными клетками пробиотиков. В качестве их защиты в условиях технологического процесса производства, а также в желудке и кишечнике был изучен процесс иммобилизации путем включения микробных клеток в гель биополимеров.

Методы иммобилизации клеток можно разделить на 3 группы: связывание на твердом носителе; включение в пространственную структуру носителя и иммоби­лизация с использованием мембранной технологии. К методам мембранной технологии также относится микрокапсулирование. Внешняя оболочка микросфер, в которую заключена биомасса, представляет собой тонкую, непроницаемую для клеток, но проницаемую для растворенных веществ искусственную мембрану. Результаты исследований иммобилизации отдельных штаммов микроорганизмов, включая пробиотические культуры, представлены в литературе [16-20].

В данной работе изучался процесс иммобилиза­ции ассоциации пробиотических культур Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis и термофильной куль­туры Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, харак­теристика которых представлена в табл. 1.

Для подготовки пищевого функционального ингреди­ента процесс иммобилизации микрокапсулированием проводили на пилотной установке в асептических ус­ловиях. Манипуляции проводили через специальные отверстия в следующей последовательности:

- активизация биомассы клеток пробиотических куль­тур на стерилизованном и охлажденном до темпера­туры 38±1 °С обезжиренном молоке;

- подготовка смеси биополимеров в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя;

- соединение суспензии активизированных пробиотических микроорганизмов в реакторе с раствором биополимеров при температуре 38±1 °С;

- формирование микрокапсул и их фасование в сте­рильные флаконы.

Изучены микробиологические показатели ассоциации пробиотических микроорганизмов в активизированной форме: L. Acidophilus : B. lactis : S. thermophilus в соот­ношении 1:1:1 до иммобилизации (контроль) и после иммобилизации (опыт) (рис. 1).

Эффективность системы доставки пробиотических микроорганизмов, иммобилизованных методом микрокапсулирования, в желудочно-кишечный тракт исследо­вали в условиях, имитирующих процесс пищеварения в полости желудка и кишечника.

Значимым параметром, характеризующим микрокап­сулы, является их способность к постепенному раство­рению, которая характеризуется временем распада и (или) скоростью растворения in vitro. Для твердых капсул под распадом понимается полное растворение в среде испытания (искусственном желудочном соке) при данной температуре (36,5±0,5 °С). Этот процесс распада должен завершаться за 30 мин согласно требованиям Европейской фармакопеи. Фактическая скорость рас­творения зависит от многих факторов - температуры, рН, смачиваемости, плотности частиц и др.

Поскольку была поставлена задача доставки в кишеч­ник жизнеспособных клеток пробиотических микроор­ганизмов, изучено изменение морфологии микрокапсул в условиях желудка (от 30 до 45 мин) и кишечника (60 мин). Для того чтобы оценить, насколько жизнеспо­собные клетки пробиотиков будут выпущены в желу­дочно-кишечной среде с различными условиями рН, ионной силы и ферментативной активности, определяли количество жизнеспособных клеток пробиотиков при различном времени деградации микрокапсул.

Установлено, что 20-25% жизнеспособных клеток пробиотиков было высвобождено из капсул в фазе "искусственный желудок", 75-80% - в фазе "искусст­венный кишечник".

Подтверждено, что использование геля на основе биополимеров: желатина пищевого, частично амидированного низкоэтерифицированного пектина и крахмала в качестве носителя (подложки) может служить для ин­капсуляции жизнеспособных клеток пробиотиков. Кап­сулы имели наибольшую концентрацию биологически активных веществ, что говорит об их лучшей роли в ка­честве защитного компонента жизнеспособных клеток пробиотиков, а также их контролируемой доставки.

Опытно-экспериментальным путем установлено ра­циональное соотношение всех компонентов рецептуры нормализованной смеси (на 1000 кг продукта): молоко обезжиренное 849,6 кг; ферментный препарат 0,4 кг; изолят сывороточных белков 50 кг; адаптоген 30 кг; мед натуральный 50 кг; мальтодекстрин 15 кг; витаминно-минеральный премикс 5 кг.

Такой состав кисломолочного продукта обеспечивает соотношение белки / углеводы в нем 1,0:1,2, содержание витаминов (мг%): А - 1,23; Е - 0,3; В₁- 0,29; В₂ - 0,27; В₃ - 0,4; В₆ - 0,41; РР - 3,3; С - 44 и минеральных веществ (мг%): К - 152; Са - 170; Na - 52; Р - 97; Mg -17; Fe - 2,6.

Результаты изучения морфологии микроорганизмов ме­тодом микроскопирования представлены на рис. 2 и 3.

Анализ данных, представленных на рис. 2 и 3, сви­детельствует о том, что при включении клеток микро­организмов в гель они располагаются равномерно, от­сутствуют крупные скопления клеток. Это способствует сохранению высокой активности и стабильности клеток микроорганизмов в процессе ферментации.

Не менее важным критерием пробиотических свойств культур является способность микроорганизмов выжи­вать в желудочно-кишечном тракте человека. В связи с этим были проведены исследования по изучению устойчивости иммобилизованных клеток микроорга­низмов к желчи, NaCl и щелочной реакции среды, т.е. к модельным условиям желудка и кишечника. Ре­зультаты исследований представлены в табл. 2.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов про­явили устойчивость к исследуемым концентрациям тест-веществ, что может рассматриваться как косвенный показатель способности иммобилизованных клеток микроорганизмов приживаться в желудочно-кишечном тракте человека. Предположительно, такая закономер­ность прослеживается за счет наибольшего количест­ва ассоциированных компонентов (белки, полисаха­риды) клеточных стенок микроорганизмов, содержащих пектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпители­альных клеток. Именно пектины, соединения белковой или гликопротеиновой природы, проявляющие специ­фическую и обратимую углеводосвязывающую актив­ность, являются медиаторами адгезии, обеспечивая поддержание жизнеспособности пробиотических клеток микроорганизмов в микрокапсулированном виде.

Полученный экспериментальным путем функциональ­ный пищевой ингредиент использовали для фермен­тации нормализованной смеси компонентов. Готовый кисломолочный продукт содержал не менее 1х10⁸ КОЕ/г пробиотических микроорганизмов в соответствии с тре­бованиями ГОСТ Р55577-2013 [4].

Новизна разработки функционального пищевого инг­редиента отражена в патенте РФ № 2588465 [21], техно­логия ферментированного (кисломолочного) продукта для специализированного (спортивного) питания защи­щена патентом РФ № 2538151 [22].

Таким образом, в результате проведенных исследова­ний дано научное обоснование компонентного состава ферментированного (кисломолочного) продукта, пред­назначенного для специализированного (спортивного) питания.

Литература

1. Гордеев А.В. и др. Продовольственная независимость России : в 2 т. Т. 1. М. : Технология ЦД, 2016. 560 с.

2. Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года. Утверждены распоряжением правительства РФ от 25 октября 2010 г. № 1873-р.

3. Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) с приложениями. Принят 9.12.2011 г. № 880.

4. ГОСТ Р 55577-2013 Продукты пищевые функциональные. Информация об отличительных признаках и эффективности.

5. Технический регламент Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" (ТР ТС 033/2013) с приложени­ями. Принят 9.10.2013 г. № 67.

6. Гаврилова Н.Б., Щетинин М.П., Молибога Е.А.Современное состояние и перспективы развития производства специализи­рованных продуктов для питания спортсменов // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 2. С. 108-114.

7. Трофимов И.Е. Исследование и разработка технологии белково-углеводного кисломолочного продукта для специализирован­ного питания : дис. ... канд. техн. наук. Кемерово, 2016. 149 с.

8. Гаврилова Н.Б. Щетинин М.П.Технология молока и молочных продуктов: традиции и инновации. М. : КолосС, 2012. 544 с.

9. Гаврилова Н.Б. Биотехнология комбинированных молочных продуктов. Омск : Вариант-Сибирь, 2004. 224 с.

10. Фиалков Д.М., Артюхова С.И., Жидкова О.Н. Методы исследо­вания свойств сырья и молочных продуктов. Омск : ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2004.232 с.

11. Иванова И.К., Шиц Е.Ю., Корякина В.В. Определение аутентич­ности и термической преобразованности продуктов пчеловодс­тва методом ЯМР-спектроскопии // Вопр. питания. 2013. Т. 82, № 3. С. 72-76.

12. Бастриков И.А. Медико-биологические аспекты создания и применения специализированных белково-углеводных про­дуктов питания для спортсменов // Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 6. С. 49-57.

13. Первушин В.В., Бакуменко О.Е. Биологически активные вещес­тва, повышающие адаптацию к физической нагрузке // Пищ. пром-сть. 2011. № 10. С. 73-74.

14. Гаврилова Н.Б., Чернопольская Н.Л., Трофимов И.Е. Разра­ботка технологии ферментированного продукта для специ­ализированного питания // Материалы IX международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" 20-22 февраля. М. : Гостиный Двор, 2017. С. 302-304.

15. Шатнюк Л.Н., Михеева Г.А., Некрасова Т.Э., Коденцова В.М. Витаминно-минеральные премиксы в технологиях продуктов здорового питания // Пищ. пром-сть. 2014. № 6. С. 42-47.

16. Belma A. The effect of immobilization on some probiotic properties of Streptococcus thermophilus strains // Ann. Microbiol. 2009. Vol. 59, N 1. P. 127-132.

17. Chassy B.M. Gene transfer and advances in the molecular genetics of Lactobacilli // 6th Intern. Symp. Lactic Acid Bacteria and Human Health (1989, August 30). Seul : R & D Center, Korea Yakult Co. Ltd., 1998. P. 245-273.

18. Gregory K. Charlene M. MelloImmobilization of Escherichia coli cells by use of the antimicrobial peptide cecropin P1 // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 3. P. 1130-1134.

19. Recept A. Efficient immobilization and pattering of live bacterial cells // Author Manuscript: available in PMC. 1998. Vol. 15. P. 1-17.

20. Tommaso G. Varesche M. Morphological observation and microbial population dynamics in anaerobic polyurethane foam // Braz. J. Chem. Eng. 2004. Vol. 3. P. 87-92.

21. Пат. 2588465, Российская Федерация, МПК C12N 1/20(2006.01), C12N 11/04(2006.01), C12N 11/10(2006.01), A61K 35/744(2015.01), A61K 35/745(2015.01)A61K 35/747(2015.01) Способ приготов­ления препарата из живых штаммов микроорганизмов лакто-и бифидобактерий / Гаврилова Н.Б., Чернопольская Н.Л. : заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО "Омский госу­дарственный аграрный университет имени П.А. Столыпина". № 2014123874/10 ; заявл. 10.06.2014 ; опубл. 20.12.2015, Бюл. № 35.

22. Пат. 2538151, Российская Федерация, МПК A23C 9/13 (2006.01). Композиция для получения молочно-белкового биококтейля / Гаврилова Н.Б., Трофимов И.Е., Коновалов С.А., Чернопольская Н.Л. : заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО "Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столы­пина". № 2013111568/10 ; заявл. 14.03.2013 ; опубл. 10.01.2015, Бюл. № 1.

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.