Physiological and biochemical studies as a necessary component of the algorithm for assessing the effectiveness of food minor biologically active substances

• Vladimir K. Mazo
• Yuliya S. Sidorova
• Nikita A. Petrov
• Lyudmila S. Vasilevskaya

Abstract

Preclinicalphysiological and biochemical studies of the effectiveness of the tested biologically active substances in the conditions of simulated pathology in laboratory animals are an important stage preceding the assessment of the clinical effectiveness of the created specialized foods for therapeutic or preventive nutrition.

The aim of this work is a brief review of the developed algorithm for preclinical assessment of the effectiveness of specialized foods, which includes a set of sequential stages of testing the safety, stability, bioavailability and effectiveness of biologically active substances in experiments on laboratory animals.

Results. The paper presents a brief review of methodological approaches for in vivo preclinical assessment of the effectiveness of minor plant biologically active substances -polyphenols from bilberry fruits and leaves and phytoecdysteroids extracted from spinach. A beneficial effect of bilberry leaves’ polyphenols on carbohydrate and lipid metabolism of male Zucker and Wistar rats was shown, which determined the necessity to increase the effectiveness of the developed polyphenolic ingredient by sorption on a food carrier. When evaluating the in vivo effects of polyphenols from blueberries and leaves sorbed on buckwheat flour, a pronounced hypoglycemic effect was found. The experiments aimed to the assessment of the adaptogenic effects of phytoecdysteroids from spinach leaves showed a significant decrease in the content of the main biomarkers of the stress system, which indicates a «smoothing» of the response of the animal organism to a strong stress impact.

Conclusion. The inclusion of minor biologically active substances into the composition of foods for preventive and therapeutic nutrition is the necessary condition to improve their effectiveness. The scientific and practical significance of the preclinical evaluation to a decisive extent depends on the presence of a correctly selected biomodel. Thus, the adequacy of the assessment of the effects of minor biologically active substances as functional food ingredients in the composition of the specialized food products depends on the reproducibility of pathological processes (clinical, biochemical and morphological disorders) characteristic for the studied disease on the selected in vivo model.

Keywords:biologically active substances, polyphenols, phytoecdysteroids, biologic models, specialized foods

Развитие производства специализированных продуктов детского питания, функциональных, диетических лечебных и профилактических пищевых продуктов с целью сохранения и укрепления здоровья населения, профилактики алиментарно-зависимых заболеваний составляет приоритет государственной политики РФ в области здорового питания населения. Социально значимым результатом увеличения спектра специализированных пищевых продуктов (СПП), отвечающих требованиям высокой пищевой ценности, с установленной с позиций доказательной медицины эффективностью должно стать снижение расходов на оказание медицинской помощи, обусловленных необходимостью лечения и профилактики алиментарно-зависимых заболеваний населения, а также вклад в решение проблемы импортозамещения соответствующей пищевой продукции и задачи рационального природопользования уникальных растительных ресурсов России.

Доктрина продовольственной безопасности и Стратегия повышения качества пищевой продукции в Российской Федерации отражают необходимость увеличения производства новой вышеперечисленной пищевой продукции и соответствующего развития фундаментальных и прикладных научных исследований по оценке качества и эффективности разрабатываемых СПП и функциональных пищевых ингредиентов. Теоретический фундамент таких исследований заложен в работах ряда выдающихся отечественных ученых, разработавших начиная с 1930-х гг. концепции рационального (М.Н. Шатерников) [1], сбалансированного (А.А. Покровский) [2], адекватного (А.М. Уголев) [3] и оптимального питания (М.Н. Волгарев) [4]. Достижения в области фундаментальных физиолого-биохимических и эпидемиологических исследований и развитие новых научных дисциплин: нутригеномики, протеомики и метаболомики, - позволили ввести понятие "нутриом", представляющее и конкретизирующее формулу оптимального питания [5]. Важнейшей научно-практической аппликацией этого понятия является расширение списка минорных биологически активных веществ (БАВ) пищи (для которых получены убедительные свидетельства их участия в метаболизме) и изучение перспектив их использования в качестве функциональных пищевых ингредиентов в составе СПП. Для развития целенаправленных исследований по оценке безопасности и фармакологического действия различных минорных компонентов пищи в плане их возможного использования в составе СПП особенно велико значение монографии А.А. Покровского "Метаболические аспекты фармакологии и токсикологии пищи" [6]. Фундаментальные научные исследования ГК. Шлыгина и его сотрудников в области физиологии пищеварения, посвященные роли пищеварительной системы в межорганном обмене нутриентов, подчеркивают необходимость пристального внимания и учета этого процесса для корректной оценки клинических эффектов, проявляемых различными, в том числе минорными, БАВ пищи [7].

Разработанный специалистами ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" алгоритм оценки эффективности СПП диетического лечебного и диетического профилактического питания (см. рисунок) [8] включает комплекс последовательных этапов тестирования безопасности используемых в составе создаваемого продукта БАВ, их сохранности, биодоступности и эффективности в опытах на лабораторных животных. Доклинические физиолого-биохимические исследования эффективности тестируемых БАВ в условиях моделируемой патологии на лабораторных животных являются важным этапом, предшествующим оценке клинической эффективности создаваемого СПП. На протяжении последних лет разработана система биологического моделирования и освоены современные высокоинформативные физиологические методы исследования, позволившие провести комплексные физиологобиохимические исследования минорных растительных БАВ пищи: полифенолов, выделяемых из экстрактов плодов и листьев черники, и фитоэкдистероидов, экстрагируемых из шпината, планируемых для включения в состав СПП.

Алгоритм оценки эффективности биологически активных веществ как потенциальных компонентов специализированных пищевых продуктов диетического лечебного и диетического профилактического питания

Algorithm for assessing the effectiveness of biologically active substances as potential components of the products for therapeutic and preventive nutrition

МД - механизм действия; ПЭ - положительный эффект.

Обоснование выбора объектов исследования

Широкое распространение у населения нарушений углеводного и/или липидного обмена, метаболического синдрома и сахарного диабета 2 типа, а также сопутствующих им осложнений требует разработки и внедрения в промышленное производство новых СПП гипогликемического действия, отвечающих современным требованиям безопасности и эффективности [9].

Плоды и листья черники, содержащие многочисленные полифенольные соединения, широко используются в народной медицине для профилактики нарушений углеводного обмена [10]. Однако, к сожалению, их эффективность в клинических исследованиях часто недостаточно высока вследствие низкой биодоступности этих соединений [11]. Задача повышения эффективности использования в профилактическом питании растительных полифенолов определила поиск новых технологических подходов, связанных с получением их концентратов для последующего включения в качестве функциональных пищевых ингредиентов в состав соответствующих СПП. Современное магистральное направление в повышении профилактической эффективности растительных полифенолов предполагает использование различных технологических приемов, направленных на усиление транспорта БАВ в организме: разработки микросфер и микрокапсул; твердых дисперсий; сочетанного введения полифенолов с "усилителями" их всасывания; комплексирования с фосфолипидами и белками, сорбции на полимерных матрицах [11]. В качестве подхода, характеризуемого относительной простотой технологического решения и одновременно позволяющего целенаправленно извлекать и концентрировать БАВ из растительного сырья, может быть применена сорбция полифенолов на полимерных носителях растительной природы [12, 13].

В меньшей степени исследованы растительные фито-экдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами глюкокортикоидов, также известные в научной литературе как эффективные адаптогены [14]. Более других изучен 20-гидрокси-экдизон (20Е), участвующий в активации серин-треониновой протеинкиназы В - сигнальной макромолекулы, ключевой в регуляции клеточной активности [15].

Суммарное содержание фитоэкдистероидов в таких лекарственных растениях, как рапонтикум сафлоровидный (Rhaponticum carthamoides) и серпуха венценосная (Serratula coronata) составляет около 1% (в пересчете на сухую массу), а в наиболее "богатых" фитоэкдистероидами пищевых растениях - шпинате (Spinacia oleracea) и киноа (Chenopodium quinoa) - их содержание на порядок ниже. Высокотехнологичные методы препаративного выделения и концентрирования фитоэкди-стероидов из листьев шпината и киноа позволяют повышать содержание мажорного фитоэкдистероида 20Е почти на три порядка по сравнению с исходным сырьем [14, 16].

Методологические подходы для экспериментальной доклинической оценки

Для наиболее полной оценки эффективности тестируемых минорных БАВ при профилактике и/или диетотерапии заболевания и его осложнений определяющим фактором является выбор модели, воспроизводящей клинические, биохимические и морфологические нарушения в организме, характерные для этого заболевания.

Моделирование сахарного диабета 2 типа на лабораторных грызунах

В современных научных исследованиях экспериментальной медицины и биологии широко используют трансгенных и нокаутных животных, у которых искусственно изменен генотип путем замены гена или его удаления [17-19]. Моделирование сахарного диабета на лабораторных животных определенных генетических линий более корректно и оправданно по сравнению с моделями этого заболевания, вызванного химическими соединениями [18, 20]. Введение стрептозотоцина в организм животного - наиболее распространенный химический метод моделирования диабета 2 типа и его осложнений [21, 22].

Ожирение, являющееся фактором высокого риска развития диабетических проявлений, и метаболический синдром эффективно индуцируются кормлением животных высокожировым и высокоуглеводным рационом [23, 24].

Анализ представленного в научных публикациях обширного опыта экспериментального моделирования сахарного диабета 2 типа с использованием лабораторных грызунов (крыс и мышей) позволил нам использовать для оценки эффективности экстрактов листьев и ягод черники несколько моделей.

Крысам-самцам генетической линии Zucker ZUC-Lepr^fa (возраст 11 нед) ежедневно вводили экстракт листьев черники в дозе 2 г на 1 кг массы тела внутрижелудочно в течение 28 сут. У животных, получавших экстракт листьев черники, уровень глюкозы в крови в течение всего исследования значимо не повышался и на 28-е сутки был статистически значимо ниже, чем у животных контрольной группы этой же линии. При проведении глюкозотолерантного теста и при тестировании инсулинорезистентности после 4-недельного введения экстракта листьев черники выявлено снижение чувствительности к глюкозе и улучшение реакции инсулиночувствительных тканей на экзогенное введение глюкозы и инсулина. Совокупность полученных результатов свидетельствует, что тестируемый экстракт листьев черники безопасен при употреблении крысами линии Zucker ZUC-Lepr^fa и не оказывает повреждающего действия на потенциальные органы-мишени. Внутрижелудочное введение экстракта листьев черники в течение 28 сут ингибировало развитие гипергликемии, непереносимости глюкозы, толерантности к инсулину, а также тормозило рост массы тела у ожиревших крыс-самцов линии Zucker [25].

В эксперименте на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 170±3 г животным опытной группы на протяжении первых 4 нед эксперимента вместо воды давали 10% раствор фруктозы ad libitum и затем однократно внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин в дозировке 50 мг на 1 кг массы тела животного. У животных, потреблявших питье в виде 2% водного раствора экстракта из листьев черники ad libitum, гипергликемия снизилась до нормальных значений у половины крыс. При этом снижение гликемии до нормального уровня (<11 ммоль/л) не наблюдалось ни у одного животного контрольной "диабетической" группы. Уровень триглицеридов в сыворотке крови был статистически значимо ниже у крыс, потреблявших экстракт листьев черники по сравнению с крысами контрольной "диабетической" группы [26].

Результаты проведенных исследований свидетельствовали о благоприятном воздействии экстракта листьев черники на углеводный и липидный обмен, что в свою очередь определило задачу, связанную с повышением эффективности разрабатываемого полифенольного ингредиента в составе СПП.

Для оценки in vivo влияния полифенолов экстракта листьев черники и полифенолов экстракта ягод черники, сорбированных на гречневой муке, использовали экспериментальную модель, при которой нарушения углеводного и липидного обмена индуцировали высокожировым рационом с высоким содержанием легкоусвояемых углеводов. По результатам тестирования in vivo установлено статистически значимое снижение уровня глюкозы и нормализация показателей толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину у животных, получавших полифенолы экстракта листьев черники. При оценке in vivo эффектов экстракта ягод черники, сорбированного на гречневой муке, установлено выраженное гипогликемическое действие [27].

Модели для оценки адаптогенного действия минорных биологически активных веществ пищи

В литературе высказывается предположение о том, что проявление адаптогенности БАВ может быть связано с его структурой, соответствующей в определенной степени структуре медиатора стресса [28]. Согласно этой гипотезе адаптационное воздействие 20Е на клеточном уровне может иметь определенное сходство с действием глюкокортикостероидов, которые имеют аналогичную структуру. Научные публикации свидетельствуют о перспективах применения фитоэкдистероидов для снятия синдрома хронической усталости, снижения нервной и мышечной утомляемости, улучшения процессов памяти и внимания [28-30]. Соответственно, в наших исследованиях был использован и модифицирован комплекс физиологических моделей, позволяющих оценивать физическую выносливость, стрессоустойчивость, исследовательскую активность и когнитивные функции лабораторных грызунов [31-33].

Для оценки уровня тревожности и двигательной активности грызунов (мышей, крыс и т.д.) применяют тест "Приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ), определяя такие показатели, как время, проведенное в открытых рукавах, закрытых рукавах, пройденная дистанция, число переходов между рукавами, груминг, вытягивания, свешивания, стойки на задних лапах. Выбор исследуемых показателей зависит от поставленных цели и задач исследования. В наших исследованиях перемещение животных по лабиринту регистрируют при помощи специализированного программного обеспечения Smart 3.0.04 (Panlab Harvard Apparatus, Испания). Тестирование проводят в начале эксперимента и через длительный период времени для оценки изменения поведенческих показателей.

В тесте "Условный рефлекс пассивного избегания" (УРПИ), направленном на оценку обучаемости и памяти животных, определяют такие показатели, как латентный период входа в темный отсек камеры, время, проведенное в темном отсеке, количество переходов между отсеками камеры. Тестирование осуществляется в несколько последовательных этапов: обучение, проверка краткосрочной памяти на следующие сутки и проверка долгосрочной памяти через длительный период времени.

Беговая дорожка используется для принудительных упражнений и точной оценки развития усталости у грызунов. Мотивирующим фактором, принуждающим крысу к движению, является разряд тока от электрода, расположенного в хвосте дорожки (ток может устанавливаться от 0 до 2 мА). При истощающей нагрузке животные находятся на беговой дорожке до полного физического истощения. Для определения физической выносливости используют пройденное животным расстояние, количество ударов током и общее время, проведенное в контакте с шоковой зоной. В нашем эксперименте животных опытных и контрольной групп подвергали истощающей физической нагрузке на беговой дорожке на 24-е сутки потребления экспериментальных рационов.

Ограничение двигательной активности (гипокинезия, или иммобилизация) - мощный стрессорный фактор, который вызывает разнообразные патологические процессы в организме животного. В условиях недостатка движения нарушается деятельность целого ряда систем организма: иммунной, нервной, эндокринной и, конечно же, сердечно-сосудистой. В нашей работе животные в течение эксперимента (25 сут) подвергались ежедневной иммобилизации длительностью 40 мин в прозрачных домиках-фиксаторах (AE1001-R1, ООО "Открытая наука", РФ). На 24-е сутки кормления экспериментальными рационами животные подвергались истощающей иммобилизации в течение 3 ч.

Использованные в наших экспериментах модели позволили протестировать адаптогенные свойства концентрата 20Е, выделенного из листьев шпината. Так, в эксперименте in vivo в условиях иммобилизационного стресса крысы-самцы линии Вистар получали в составе рациона концентрат 20Е в течение 25 сут в дозе 2 мг на 1 кг массы тела. Потребление 20Е нивелировало отрицательное воздействие стресса на аппетит и прирост массы тела животных. Потребление этого фитоэкдистероида не оказывало влияния на обучаемость и память животных в тесте УРПИ на 15-е сутки эксперимента. Показан выраженный анксиолитический эффект концентрата 20Е на модели ПКЛ. Принудительная иммобилизация приводила к достоверному снижению содержания в суточной моче животных дофамина, норадреналина и адреналина, свидетельствуя о том, что поступление фитоэкдистероидов в организм животного, по-видимому, может влиять на баланс изучаемых активаторов стресса, сглаживая реакции организма животного в ответ на сильное стрессорное воздействие.

Заключение

Включение в состав СПП для диетического профилактического или лечебного питания минорных БАВ пищи является необходимым условием повышения их эффективности. Научно-практическая значимость доклинической оценки исследования в решающей степени зависит от подобранной биомодели. Таким образом, корректность оценки эффектов минорных БАВ пищи в качестве функциональных пищевых ингредиентов в составе СПП зависит от воспроизводимости патологических процессов (клинических, биохимических и морфологических нарушений), характерных для изучаемого заболевания, на выбранной модели in vivo.

References

1. Skurikhin I.M., Shaternikov V.A. How to eat right. 2nd ed., rev. and suppl. Moscow: Agropromizdat, 1987: 256 p. (in Russian)

2. Pokrovskiy A.A. Talking about nutrition. 2nd ed., suppl. Moscow: Ekonomika, 1968: 355 p. (in Russian)

3. Ugolev A.M. The theory of adequate nutrition and trophology. Leningrad: Nauka, 1991: 272 p. (in Russian)

4. Volgarev M.N., Tutelyan V.A., Knyazhev V.A., Rogov I.A. The concept of healthy nutrition. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskih nauk [Bulletin of Russian Academy of Medical Sciences]. 1999; (9): 17–9. (in Russian)

5. Nechaev A.P., Bagryantseva O.V., Tutelyan V.A. Food ingredients in the production of modern foods. Moscow: DeLi plyus, 2013: 520 p. (in Russian)

6. Pokrovskiy A.A. Metabolic aspects of food pharmacology and toxicology. Moscow: Meditsina, 1979: 184 p. (in Russian)

7. Shlygin G.K. The role of digestive system in metabolism. Moscow: Sinergiya, 2001:232 p. (in Russian)

8. Glazkova I.V., Sarkisyan V.A., Sidorova Yu.S., Mazo V.K., Kochetkova A.A. Main stages for the evaluation of specialized food products. Pishchevaya promyshlennost’ [Food Industry]. 2017; (12): 8–11. (in Russian)

9. Dedov I.I., Shestakova M.V., Mayorov A.Yu. (eds). Clinical recommendations «Algorithms for specialized medical care for patients with diabetes». Issue 8. Moscow: UP PRINT, 2017: 112 p. (in Russian)

10. Stote K., Corkum A., Sweeney M., Shakerley N., Kean T., Gottschall-Pass K. Postprandial effects of blueberry (Vaccinium angustifolium) consumption on glucose metabolism, gastrointestinal hormone response, and perceived appetite in healthy adults: a randomized, placebo-controlled crossover trial. Nutrients. 2019; 11 (1): 202. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11010202

11. Lewandowska U., Szewczyk K., Hrabec E., Janecka A., Gorlach S. Overview of metabolism and bioavailability enhancement of polyphenols. J Agric Food Chem. 2013; 61 (50): 12 183–99. DOI: https://doi.org/10.1021/jf404439b

12. Petrov N.A., Sidorova Y.S., Sarkisyan V.A., et al. Complex of polyphenols sorbed on buckwheat flour as a functional food ingredient. Food Raw Mater. 2018; 6 (2): 334–41. DOI: https://doi.org/10.21603/2308-4057-2018-2-334-341

13. Petrov N.A., Sidorova Yu.S., Perova I.B., Kochetkova A.A., Mazo V.K. A complex of bilberry polyphenols sorbed on buckwheat flour as a functional food ingredient. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (6): 68–72. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2019-10066 (in Russian)

14. Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Shipelin V.A., Mazo V.K. Spinach and quinoa as prospective food sources of biologically active substances. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition] 2020; 89 (2): 100–6. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10020 (in Russian)

15. Issaadi H.M., Csábi J., Hsieh T.J., Gáti T., Tóth G., Hunyadi A. Side-chain cleaved phytoecdysteroid metabolites as activators of protein kinase B. Bioorg Chem. 2019; 82: 405–13. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2018.10.049

16. Roberts J.L., Moreau R. Functional properties of spinach (Spinacia oleracea L.) phytochemicals and bioactives. Food Funct. 2016; 7 (8): 3337–53. DOI: https://doi.org/10.1039/c6fo00051g

17. Brito-Casillas Y., Melián C., Wägner A.M. Study of the pathogenesis and treatment of diabetes mellitus through animal models. Endocrinol. Nutr. 2016; 63 (7): 345–53. DOI: https://doi.org/10.1016/j.endonu.2016.03.011

18. Al-Awar A., Kupai K., Veszelka M., et al. Experimental diabetes mellitus in different animal models. J Diabetes Res. 2016; 2016: 9051426. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/9051426

19. Sultan A., Singh J., Howarth F.C. Mechanisms underlying electro-mechanical dysfunction in the Zucker diabetic fatty rat heart: a model of obesity and type 2 diabetes. Heart Fail Rev. 2020; 25 (5): 873–86. DOI: https://doi.org/10.1007/s10741-019-09872-4

20. Skovso S. Modeling type 2 diabetes in rats using high fat diet and streptozotocin. Diabetes Invest. 2014; 5 (4): 349–58.

21. Dzydzan O., Bila I., Kucharska A.Z., Brodyak I., Sybirna N. Antidiabetic effects of extracts of red and yellow fruits of cornelian cherries (Cornus mas L.) on rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Food Funct. 2019; 10 (10): 6459–72. DOI: https://doi.org/10.1039/c9fo00515c

22. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K. Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Comparative studies of antidiabetic activity of bilberry leaf extract in Wistar rats with STZ-induced diabetes and Zucker diabetic fatty rats. Int Food Res J. 2018; 25 (3): 1288–94.

23. Zhou J.Y., Poudel A., Welchko R., et al. Liraglutide improves insulin sensitivity in high fat diet induced diabetic mice through multiple pathways. Eur J Pharmacol. 2019; 861: 172594. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2019.172594

24. Avtanski D., Pavlov V.A., Tracey K.J., Poretsky L. Characterization of inflammation and insulin resistance in high-fat diet-induced male C57BL/6J mouse model of obesity. Anim Model Exp Med. 2019; 2 (4): 252–8. DOI: https://doi.org/10.1002/ame2.12084

25. Shipelin V.A., Sidorova Yu.S., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kiseleva T.L., et al. Protective potential and antidiabetic activity of bilberry leaves in Zucker rats. Curr Nutr Food Sci. 2020; 16: 228. DOI: https://doi.org/10.2174/1573401315666181206123717

26. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.A., Zorin S.N., et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vaccinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats. Nutrition. 2017; 41: 107–12. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nut.2017.04.010

27. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Frolova Yu.V., Kochetkova A.A., Mazo V.K. In vivo experimental evaluation of hypoglycemic properties of a functional food ingredient - a polyphenolic food matrix. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 5–13. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10036 (in Russian)

28. Panossian A., Wikman G. Effect of adaptogens on the central nervous system and the molecular mechanisms associated with their stress-protective activity. Pharmaceuticals (Basel). 2010; 3 (1): 188–224. DOI: https://doi.org/10.3390/ph3010188

29. Ray A., Gulati K., Anand R. Stress, adaptogens and their evaluation: an overview. J Pharmacol Rep. 2016; 1 (2): 1000110.

30. Isenmann E., Ambrosio G., Joseph J.F., et al. Ecdysteroids as non-conventional anabolic agent: performance enhancement by ecdysterone supplementation in humans. Arch Toxicol. 2019; 93: 1807–16. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31123801/

31. Castanheira L., Ferreira MF., Sebastião A.M., Telles-Correia D. Anxiety assessment in pre-clinical tests and in clinical trials: a critical review. Curr Top Med Chem. 2018; 18 (19): 1656–76. DOI: https://doi.org/10.2174/1568026618666181115102518

32. Haddadi H., Rajaei Z., Alaei H., Shahidani S. Chronic treatment with carvacrol improves passive avoidance memory in a rat model of Parkinson’s disease. Arq Neuropsiquiatr. 2018; 76 (2): 71–7. DOI: https://doi.org/10.1590/0004-282X20170193

33. Son H., Yang J.H., Kim H.J., Lee D.K. A chronic immobilization stress protocol for inducing depression-like behavior in mice. J Vis Exp. 2019; 147: e59546. DOI: https://doi.org/10.3791/59546

All articles in our journal are distributed under the CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© GEOTAR-Media Publishing Group. The use of textual and illustrative content from this publication for the training of any artificial intelligence systems - including machine learning models and neural networks - is strictly prohibited without the prior written consent of the copyright holder.