Совершенствование технологии получения пищевого ингредиента с пробиотическими свойствами с использованием нового комплексного протеолитического ферментного препарата

Куксова Елена Владимировна; Костылева Елена Викторовна; Середа Анна Сергеевна; Толокнова Анастасия Алексеевна; Фурсова Елизавета Андреевна; Волкова Галина Сергеевна

Резюме

Разработка технологий получения бакконцентратов и ферментных препаратов на основе отечественных штаммов является актуальной задачей. Использование ферментативных гидролизатов сывороточных белков в качестве компонентов питательных сред для культивирования молочнокислых и бифидобактерий дает возможность совершенствования существующих и разработки инновационных процессов получения бакконцентратов с функциональными свойствами для производства биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов. Во ВНИИПБТ - филиале ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" создан консорциум пробиотических микроорганизмов - молочнокислых и бифидобактерий - с целью использования в качестве заквасок для специализированной молочной продукции. На основе штамма Aspergillus oryzae 21-154 LAP был получен новый комплексный ферментный препарат с лабораторным названием Протооризин LAP, предназначенный для глубокого гидролиза белковых субстратов.

Цель исследования - оценить возможность использования нового отечественного протеолитического ферментного препарата Протооризин LAP при приготовлении питательных сред на основе молочной сыворотки для культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов для получения бакконцентратов.

Материал и методы. Объект исследований - симбиотический консорциум, включающий штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2, Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 и бифидобактерий Bifidobacterium longum Б-2. В качестве основы для приготовления питательной среды использовали неосветленную творожную молочную сыворотку, в которую вносили концентрат сывороточных белков. Среды обрабатывали препаратом β-галактозидазы для снижения содержания лактозы. Гидролиз белков в контрольном варианте проводили обработкой питательных сред коммерческими препаратами сериновой протеазы - Alcalase^® 2.4 L и лейцинаминопептидазы - Flavourzyme^® 1000 L. В опытном варианте действие 2 импортных препаратов заменяли лабораторным образцом препарата Протооризин LAP. В полученных питательных средах определяли содержание аминного азота, свободных аминокислот и растворимого белка, проводили электрофоретический анализ белков и пептидов. Контроль процесса роста консорциума на исследуемых питательных средах осуществляли по содержанию сухих веществ и редуцирующих сахаров, по активной и титруемой кислотности, а также микроскопированием. Количество жизнеспособных клеток молочнокислых и бифидобактерий по завершении ферментации определяли посевом на соответствующие селективные агаризованные среды, с использованием автоматического счетчика колоний.

Результаты. Эффективность Протооризина LAP при гидролизе белков молочной сыворотки существенно превосходила результат совместного действия Alcalase^® 2.4 L и Flavourzyme^® 1000 L как по снижению содержания нерасщепленного белка, в том числе иммуногенных фракций, так и по выходу растворимого белка, аминного азота и аминокислот. Полученные с применением протеаз питательные среды обеспечили хороший рост и развитие консорциума пробиотических штаммов, причем за счет высокого содержания свободных аминокислот на среде, полученной с применением Протооризина LAP, динамика сбраживания углеводов, титруемая кислотность, количество жизнеспособных клеток пробиотических штаммов были выше в опытном варианте, чем при использовании коммерческих препаратов. Применение Протооризина LAP при получении питательной среды также позволило повысить жизнеспособность клеток бактерий после лиофилизации.

Заключение. Разработанные технологические приемы с применением нового протеолитического препарата Протооризин LAP при приготовлении питательных сред на основе белков молочной сыворотки могут быть использованы в технологии производства бакконцентратов на стадии культивирования созданного консорциума на основе молочнокислых и бифидобактерий. Бакконцентрат может быть рекомендован в качестве рецептурного ингредиента при изготовлении содержащих пробиотики биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов.

Ключевые слова: белок молочной сыворотки; гидролиз; ферментные препараты; пробиотики; консорциум; бакконцентраты

В последнее время динамично развивается рынок специализированных пищевых продуктов, прежде всего молочной низколактозной и гипоаллергенной продукции, производство которой основано на использовании стартовых культур молочнокислых и бифидобактерий в виде бактериальных заквасок и бакконцентратов, обладающих пробиотическими свойствами [1]. При достаточной концентрации пробиотики оказывают противомикробное действие за счет усиления адгезии клеток молочнокислых и бифидобактерий к слизистой оболочке кишечника, конкурентной элиминации патогенных микроорганизмов, продукции антимикробных веществ и регуляции иммунной системы. В состав большинства пробиотиков входят бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium [2].

Для достижения максимального положительного эффекта пробиотики часто используют в виде синбиотиков, т.е. в комплексе с пребиотиками - веществами, способными селективно стимулировать рост полезной микрофлоры [3, 4]. Традиционно в качестве пребиотиков используют олигосахариды: лактулозу, галактоолигосахариды, олигофруктозу, мальтоолигосахариды. Однако олигосахариды в качестве побочного эффекта могут вызывать диарею и повышенное газообразование. Рядом исследователей был показан пребиотический эффект белковых гидролизатов. Легкодоступный для бактерий белок в виде коротких пептидов и свободных аминокислот способствует пролиферации бактерий, может действовать как промотор систем транспорта полипептидов, а также повышать жизнеспособность и кислотоустойчивость штаммов [2, 3]. Так, обработанный пепсином казеин оказывал антимикробное действие на E. coli в кислой среде, но повышал кислотоустойчивость L. rhamnosus. Гидролизаты сывороточного белка способствуют пролиферации пробиотических бактерий, причем наибольший эффект наблюдается при оптимальной степени гидролиза, обеспечивающей наличие в питательной среде пептидов и аминокислот, которые являются ростостимулирующими компонентами для молочнокислых и бифидобактерий. Сывороточные пептиды играют важную роль в образовании короткоцепочечных жирных кислот, которые могут предотвращать инвазию патогенных бактерий, регулируя барьерную функцию и иммунный статус кишечника хозяина и тем самым увеличивая содержание пробиотиков в микробиоте [2]. Криопротекторные свойства белковых гидролизатов играют важную роль при получении бактериальных концентратов, производство которых включает как этап концентрирования бактериальных клеток, так и их консервирование методами криозамораживания и вакуум-сублимационной (лиофильной) сушки [1, 3, 5, 6]. Гидролизаты белков молока широко используются в качестве основы для питательных сред для выращивания консорциумов пробиотических бактерий при получении бакконцентратов [7]. Гидролизаты белков молочной сыворотки защищают клетки во время сублимационной сушки и хранения, сохраняя целостность клеточной мембраны и снижая вредное воздействие окислительного стресса [5].

Важным фактором, влияющим на пребиотические свойства белковых гидролизатов, является молекулярно-массовое распределение в них пептидов [2]. В наибольшей степени рост пробиотических микроорганизмов стимулируют низкомолекулярные пептиды и свободные аминокислоты. Так, гидролизаты казеина, содержащие пептиды с молекулярной массой (ММ) ниже 1 кДа, существенно ускоряли рост Bifidobacterium infantis, B. breve и B. longum [3]. Сывороточные пептиды с ММ ниже 1 кДа оказывали пролиферативное действие на пробиотические бактерии, в частности отмечалось увеличение количества жизнеспособных клеток L. acidophilus и Bifidobacterium spp. Гидролизат сывороточного белка оказывал более выраженное защитное действие на B. lactis Пробио-М8, чем интактный сывороточный белок той же концентрации [2, 5, 8]. Пептиды молочной сыворотки не только оказывали антибактериальное действие в отношении патогенных микроорганизмов (E. coli, B. subtilis и Staphylococcus aureus), но и стимулировали рост пробиотических бактерий Bifidobacterium longum ATCC 15707 [3]. Следует также отметить, что пептиды, образующиеся при ферментативном гидролизе молочной сыворотки, проявляют различные биологические функции, включая благоприятное воздействие на нервную, эндокринную, иммунную, сердечно-сосудистую и пищеварительную системы, что повышает биологическую ценность получаемых на ее основе специализированных пищевых продуктов [3].

На российском рынке бакконцентратов наблюдается высокая зависимость от импорта - доля отечественной продукции составляет лишь 9-12% [1]. Перспективным решением этой проблемы представляется создание заквасок и бакконцентратов на основе отечественных микробных культур и пребиотических компонентов, обладающих как функциональными, так и криопротекторными свойствами. В качестве пребиотиков целесообразно рассматривать гидролизаты белков молочной сыворотки, полученные с помощью протеолитических ферментов.

Т.А. Раскошной и соавт. [7, 9] была разработана технология получения бакконцентрата L. reuteri с использованием питательных сред на основе обезжиренного молока и молочной сыворотки, обработанных ферментными препаратами (ФП) бактериальных эндопротеаз (Alcalase, Neutrase, Protamex, Протосубтилин). Наиболее активный рост пробиотической культуры наблюдался на средах, полученных с использованием ФП Alcalase (Novozymes A/S, Дания) в дозировке 3% от содержания белка в среде.

Чтобы обеспечить расщепление иммуногенных белков молочной сыворотки, устранить горечь, обусловленную образованием горьких пептидов в результате действия эндопротеаз на молочные белки, и получить гидролизаты с высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, наиболее эффективных в качестве компонентов сред для культивирования молочнокислых и бифидобактерий, комбинируют действие эндопротеаз с источниками лейцинаминопептидазы (LAP), - такими ФП, как Flavourzyme (Novozymes A/S, Дания), Flavorpro (Biocatalysts Limited, Великобритания) и др. [10, 11]. В связи с уходом с российского рынка основных производителей протеолитических ферментов проводится поиск отечественных ФП, способных обеспечить глубокий гидролиз белковых субстратов, в частности белков молочной сыворотки, которая является вторичным сырьевым ресурсом молочной промышленности.

В производстве биологически активных добавок с пробиотиками, а также специализированных пищевых продуктов и заквасок важным аспектом является разработка недорогих, эффективных производственных питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Во ВНИИПБТ создан консорциум пробиотических микроорганизмов - молочнокислых и бифидобактерий с целью использования в качестве заквасок для специализированной молочной продукции, подобран состав питательной среды на основе молочной сыворотки для получения бакконцентратов. На основе селекционированного штамма Aspergillus oryzae 21-154 LAP - продуцента комплекса протеолитических ферментов с увеличенной активностью лейцинаминопептидазы, получен новый комплексный ФП Протооризин LAP, предназначенный для глубокого гидролиза белковых субстратов. Ввиду высокой потребности молочнокислых бактерий в сложных питательных веществах, обогащение питательной среды продуктами гидролиза белка (пептидами и пептонами) приводит к повышению их способности сбраживать лактозу и стимулирует рост молочнокислых бактерий более значимо, чем аминокислоты. Для интенсивного накопления биомассы бифидобактериям в большей степени, чем молочнокислым бактериям, требуются аминокислоты, прежде всего пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Обладая некоторой протеолитической активностью, бифидобактерии могут дополнительно обеспечить свои потребности в азотистых веществах [12, 13].

Цель исследований - создание бакконцентрата молочных и бифидобактерий на основе гидролизата молочной сыворотки и концентрата сывороточного белка с использованием отечественного ФП Протооризин LAP.

Материал и методы

Объект исследований - симбиотический консорциум, включающий штаммы молочнокислых бактерий: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, Lactobacillus plantarum 578/25, Lactobacillus helveticus 842(D)-2, Lactococcus lactis subsp. lactis М-12, Streptococcus thermophilus В-92 и бифидобактерии Bifidobacterium longum Б-2.

В качестве основы для приготовления питательной среды использовали неосветленную творожную молочную сыворотку фермерского хозяйства "Луч" (Московская область, Волоколамский район). В 1200 см³ сыворотки добавляли 60 г концентрата сывороточных белков (КСБ) ("ООО Миксэм", РФ), затем вносили ФП β-галактозидазы ("Зитекс", Индия) в дозировке 0,1% от содержания лактозы, устанавливали рН 5,5 и проводили гидролиз в течение 2 ч при 50 °С. Далее доводили рН до 6,2, в контрольный вариант вносили протеолитические ФП Alcalase^® 2.4 L в дозировке 2% от содержания белка и Flavourzyme^® 1000 L - 1% от содержания белка. В экспериментальный вариант вносили ФП Протооризин LAP в дозировке 1,5% от содержания белка. Проводили гидролиз в течение 4 ч при 55 °С по ранее отработанным параметрам [11], что позволило получить гидролизаты с пониженной аллергенностью и отсутствием горького и соленого привкусов.

В полученные гидролизаты вносили минеральные соли и ростостимулирующие добавки: KH₂PO₄ - 0,1%, MnSO₄×4 H₂O - 0,05%, MgSO₄×7 H₂O - 0,02%, Na₃C₆H₅O₇ ×2H₂O - 0,03%. Для ускорения адаптации консорциума и интенсификации роста бифидобактерий в полученные гидролизаты вносили L-цистеин солянокислый - 0,05 г, а также в 2 первых пассажах при пересеве консорциума добавляли Твин-80 - 1 см³ на 1 дм³ среды. Готовые среды нейтрализовали до рН 7,0, выдерживали 9 мин при 90 °С для инактивации ферментов и пастеризации, с последующим быстрым охлаждением среды до 38±1 °С.

В полученных питательных средах проводили определение аминного азота методом формольного титрования по ГОСТ 25179-2014 "Молоко и молочные продукты. Методы определения массовой доли белка", определяли содержание свободных аминокислот нингидриновым методом и растворимого белка спектрофотометрическим методом [14]. Разделение белков в полученных гидролизатах по ММ методом электрофореза проводили в 12% полиакриламидном геле (25 мМ трис-глициновый буфер, pH 8,3, с додецилсульфатом натрия в концентрации 1 мг/см³) в ячейке для электрофореза Mini Protean Cell system (Bio-Rad, США). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250 (Amresco, США).

Для изучения динамики роста и развития консорциума на приготовленных питательных средах культивирование проводили в течение 24 ч при 37 °С. Засев питательных сред осуществляли 5% посевного материала консорциума. Культивирование проводили в микроаэрофильных условиях при периодическом неинтенсивном перемешивании культуральных жидкостей (КЖ) в колбах 3-4 раза в сутки.

Контроль процессов ферментации осуществляли по следующим показателям: содержание сухих веществ, титруемая кислотность, активная кислотность, содержание редуцирующих веществ методом Шомоди-Нельсона по ГОСТ Р 54905 "Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности бета-глюканазы", а также микроскопированием посевного материала и КЖ с использованием микроскопа Nikon ECLIPSE Ci-S/Ci-L с программным обеспечением Infinity Analyze Lumenera (Lumenera Corporation, Канада).

В процессе ферментации проводили нейтрализацию КЖ 10% раствором NaOH. По завершении ферментации определяли титр микроорганизмов при рассеве на селективные агаризованные среды: для молочнокислых бактерий - на агар MRS для лактобактерий (Himedia M641. Lactobacillus MRS Agar) и на агар Ли (Himedia M602); для бифидобактерий - на агар для бифидобактерий (Himedia M 1396. Bifidobacterium Agar). Подсчет выросших колоний проводили с использованием автоматического счетчика колоний Scan 500 (Interscience, Франция).

Бактериальную массу выделяли на центрифуге ОПН-16 (Labtex, Россия) при 10 000 об/мин (4 °C) в течение 15 мин. Концентрирование полученных КЖ осуществляли с использованием инновационного баромембранного процесса ультрафильтрации. Использовали экспериментальную ячейку с плоской мембраной и лопастной мешалкой. Фильтрацию проводили в тупиковом режиме через полисульфонамидную мембрану УПМ-20 ("Владипор", Россия) при температуре 20 °С. Полученный концентрат замораживали в морозильной камере SANYO MDF-192(T) (SANYO, Япония) и лиофильно высушивали на сублиматоре Thermo Scientific Heto LyoLab 3000 (Thermo Scientific Heto, Дания). Для определения жизнеспособности клеток пробиотических бактерий после лиофилизации готовые бакконцентраты разводили в стерильной дистиллированной воде и рассевали на указанные выше селективные среды для подсчета титра.

Статистическую обработку результатов, полученных не менее чем в 3 повторностях, проводили с использованием программы Statistica 6.0 методом однофакторного дисперсионного анализа при уровне значимости 0,05.

Результаты и обсуждение

Обработка базовой основы питательной среды β-галактозидазой, приводящая к трансформации лактозы до глюкозы и галактозы, позволила оптимизировать питательную среду и создать благоприятные условия для накопления биомассы молочнокислых и бифидобактерий, входящих в состав консорциума, не вызывая конкуренции за углеводный субстрат. Реакция трансгликозилирования протекает параллельно с гидролизом субстрата, а глюкоза служит активным акцептором галактозильного остатка, обеспечивая синтез продуктов трансгликозилирования лактозы [15].

Подобранный режим обеспечил гидролиз 53,0% лактозы базовой основы питательной среды (от суммарного содержания 4,6% лактозы творожной сыворотки и КСБ), что является оптимальным для последующей стадии ферментации.

Проведение гидролиза позволяет молочнокислым бактериям, входящим в состав консорциума, не только более активно утилизировать лактозу, но и вырабатывать из галактозы полисахарид галактозан, придающий вязкость сгустку [16, 17].

Экзополисахариды не только обладают большим потенциалом в профилактике заболеваний человека [18, 19], они также могут стать ингредиентами в пищевой промышленности для придания особой качественной структуры и вкуса, что является преимуществом в биотехнологических процессах производства бакконцентратов на молочных средах. В публикациях [20, 21] отмечается, что экзополисахариды, продуцируемые пробиотическими штаммами молочнокислых и бифидобактерий, также способны взаимодействовать с кишечной микробиотой. Фактически некоторые из этих полимеров могут использоваться в качестве источника ферментируемых углеводов рядом кишечных комменсалов, предположительно, участвуя в высвобождении бактериальных метаболитов, полезных для организма хозяина.

Для обогащения питательной среды аминокислотами и пептидами в гидролизат молочной сыворотки вносили КСБ. Сывороточные белки представляют собой водорастворимую фракцию белков молока и содержат 50-60% β-лактоглобулина с ММ около 18,3 кДа, как правило, в форме димера с ММ 35-40 кДа и 20% α-лактальбумина с ММ 14,2 кДа [22, 23]. Эти белки не гидролизуются пепсином желудочного сока и проявляют иммуногенные свойства, что затрудняет их использование в производстве пищевых продуктов, включая специализированные. В связи с этим основным качественным показателем полноты гидролиза сывороточных белков является отсутствие на электрофореграммах выраженных полос, соответствующих белкам с ММ выше 10 кДа.

Для количественной оценки глубины и интенсивности гидролиза белков в питательных средах изучали содержание растворимого белка и свободных аминокислот (табл. 1). Высокое содержание свободных аминокислот в гидролизатах существенно занижает результаты определения содержания растворимого белка традиционным методом Лоури. Поэтому, учитывая использование в работе ФП с высокой активностью LAP, для получения корректных данных по содержанию растворимого белка применяли метод оптической спектрофотометрии в диапазоне 210-220 нм [14].

Полученные данные показали высокую эффективность Протооризина LAP при гидролизе иммуногенных белков молочной сыворотки (рис. 1). В отличие от варианта с применением комплекса импортных коммерческих препаратов, где осталась выраженная полоса на уровне около 18,3 кДа, соответствующая нерасщепленному β-лактоглобулину, в варианте с Протооризином LAP данная полоса практически незаметна. Все остальные молочные белки были успешно гидролизованы используемыми ФП до пептидов и аминокислот.

Использование Протооризина LAP также значительно увеличило содержание аминокислот в питательной среде. Если действие Флавозима привело к повышению содержания аминокислот лишь на 45% по сравнению с контролем (без гидролиза протеолитическими ферментами), то Протооризин LAP повысил содержание аминокислот в 4,3 раза по сравнению с контролем.

Показатель аминного азота в среде с Alcalase^® 2.4 L + Flavourzyme^® 1000 L составил 310,2 мг%, а в питательной среде с Протооризином LAP - 514,2 мг%. Полученные значения свидетельствуют о достаточном содержании доступного аминного азота для роста и развития консорциума на приготовленных питательных средах.

Подготовленные питательные среды засевали консорциумом молочнокислых и бифидобактерий и культивировали при 37 °С в течение 24 ч.

Из данных рис. 2 очевидно - штаммы молочнокислых и бифидобактерий, входящие в состав консорциума, активно утилизируют углеводы питательных сред на основе гидролизатов молочной сыворотки, что обусловлено наличием более легкоусвояемых форм азота (аминокислоты, низкомолекулярные пептиды), а также различиями молочнокислых и бифидобактерий в механизмах регуляции метаболизма, которые обеспечивают взаимодополняемость сбраживания углеводов, характерную для симбиоза.

Кислотообразование относится к показателям специфической активности пробиотиков на основе лакто- и бифидобактерий. Продуцируемые ими карбоновые кислоты играют существенную роль в становлении и функционировании кишечной микробиоты желудочно-кишечного тракта. Кислотообразование является культуральным свойством, характеризующим биохимическую и в значительной степени определяющим антагонистическую активность клеток производственных штаммов молочнокислых бактерий [24]. Кислотообразующая активность характеризует интенсивность сбраживания углеводного субстрата. Согласно полученным данным, представленным в табл. 1 и на рис. 3, кислотообразующая активность консорциума молочнокислых и бифидобактерий коррелировала с более высоким содержанием свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов в питательной среде, на что указывает появление третьего пика титруемой кислотности в варианте с Протооризином LAP на час раньше, чем на среде с Alcalase^® 2.4 L + Flavourzyme^® 1000 L. Это подтверждается данными, полученными А.В. Бегуновой с соавт. [25].

Следует отметить, что рост и развитие консорциума на питательной среде с Протооризином LAP продемонстрировали лучшую динамику сбраживания углеводов и кислотообразующей активности (см. рис. 2, 3), чем на среде с Alcalase^® 2.4 L + Flavourzyme^® 1000 L.

Проведенная микроскопия образцов КЖ показала высокую плотность популяции штаммов, входящих в состав консорциума, что позволяет судить о стабильности соотношения клеток молочнокислых и бифидобактерий 2:1, при этом клетки Bifidobacterium longum, без бифуркации, имели правильную форму гранулированных палочек, без ветвлений, а также обнаруживались коккоидные и диплококкоидные клетки. Клетки молочнокислых бактерий L. bulgaricus, L. plantarum и Lactobacillus helveticus, без деформаций, представлены палочками, а Lac. lactis и St. thermophilus - мелкими и более крупными кокками, что соответствует культурально-морфологическим характеристикам [26] и является несомненным признаком достаточной концентрации необходимых питательных компонентов и ростовых факторов.

По окончании процесса ферментации определяли количество жизнеспособных клеток в КЖ. Результаты представлены в табл. 2.

В результате проведенных серий ферментаций установлено, что КЖ, содержащие максимальное количество жизнеспособных клеток бифидобактерий и молочнокислых бактерий в активной фазе роста, целесообразно получать на стадии окончания экспоненциальной фазы роста и устойчивого выхода на стационарную фазу (15-17 ч развития консорциума), когда титр жизнеспособных клеток наиболее высокий и сохраняется на том же уровне до 22-го часа ферментации, и далее направлять на концентрирование и лиофильную сушку.

Для отработки режима концентрирования использовали влажный осадок после центрифугирования консорциума с содержанием жизнеспособных клеток не менее 6×10¹⁰ КОЕ/см³, а концентрирование фильтрата осуществляли при давлении 1,2 МПа через мембрану УПМ-20, при этом содержание жизнеспособных клеток в концентратах составляло (5-7)×10¹² КОЕ/см³.

Исходя из видовой принадлежности штаммов-продуцентов, входящих в состав консорциума, был подобран состав защитной среды с внесением сухого рисового мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом, равным 25, желатозы (5%), лимоннокислого натрия (1%) и аскорбиновой кислоты (0,1%). Вместо воды при приготовлении криопротекторной среды использовали полученные пермеаты, нейтрализованные до pH 7, а остатки неиспользованных пермеатов возвращали на стадию приготовления питательных сред.

Далее смешивали полученные жидкие концентраты с влажным осадком и криозащитной средой (криопротекторами) в соотношении 1:1. Криопротекторы предохраняют клетки микроорганизмов от негативного влияния фазового перехода воды в лед при замораживании, а также способствуют понижению осмотического давления внутри клеток и тем самым препятствуют разрыву клеточных оболочек при оттаивании и замораживании [27].

Процесс замораживания проводили в морозильной камере и лиофильно высушивали. Экспериментально подобранные условия лиофилизации предусматривают 3 возможных режима предварительного замораживания бактериальных концентратов консорциума: 1) 8 ч при -55 °С; 2) 8 ч при -35--40 °С и 3) 12-14 ч при -25 °С. Применение этих условий обеспечивало в дальнейшем (после проведения досушивания лиофилизатов бактериальных концентратов консорциума в течение 12-16 ч при 25 °С до остаточной влажности <4%) сохранение жизнеспособности клеток не менее 3,0×10¹⁰ КОЕ/г.

Для определения жизнеспособности клеток бактерий после лиофилизации готовые сухие образцы бакконцентратов разводили в стерильной дистиллированной воде и рассевали на селективные среды. Результаты представлены в табл. 3.

Заключение

Проведение гидролиза питательной среды, содержащей молочную сыворотку и КСБ, последовательно ФП β-галактозидазы (0,05% по лактозе, 2 ч при 50 °С) и Протооризином LAP (1,5% по белку, 4 ч при 55 °С, рН 6,2) позволяет снизить содержание лактозы и иммуногенных белков, при этом питательная среда обогащается низкомолекулярными пептидами и аминокислотами.

Культивирование консорциума молочнокислых и бифидобактерий (L. delbrueckii ssp. bulgaricus Д-16, L. plantarum 578/25, L. helveticus 842(D)-2, Lc. lactis subsp. lactis М-12, St. thermophilus В-92, B. longum Б-2) в течение 24 ч на среде с гидролизатом сывороточных белков позволяет интенсивно сбраживать углеводы при высокой скорости роста консорциума и обеспечивает титр жизнеспособных клеток на конец культивирования до 6,34×10⁹ КОЕ/см³.

При получении бакконцентрата КЖ концентрируется до 5×10¹² КОЕ/см³, концентрат лиофильно высушивается с защитной средой в соотношении 1:1 до влажности менее 4%. Полученная пищевая добавка с титром клеток в препарате не менее 3×10¹⁰ КОЕ/г может быть рекомендована для использования в составе биологически активных добавок к пище в качестве источника бифидобактерий, пробиотических лактобактерий и молочнокислых бактерий.

Таким образом, использование нового ФП протеолитического действия при приготовлении питательной среды для культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов обеспечило высокие показатели жизнеспособности и продуктивности штаммов, входящих в состав консорциума. Разработанные технологические режимы могут быть использованы в технологии производства бакконцентрата на основе созданного консорциума молочнокислых и бифидобактерий.

Литература

1. Пойманов В.В., Гришанова Д.С., Антипов С.Т. Исследование процессов замораживания и вакуум-сублимационной сушки бактериальных концентратов для молочной отрасли // Вестник ВГУИТ. 2018. Т. 80, № 4. С. 19-24. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2018-4-19-24

2. Zhang C., Zhang Y., Li H., Liu X. The potential of proteins, hydrolysates and peptides as growth factors for Lactobacillus and Bifidobacterium: current research and future perspectives // Food Funct. 2020. Vol. 11, N 3. P. 1946-1957. DOI: https://doi.org/10.1039/c9fo02961c

3. Gao P.P., Liu H.Q., Ye Z.W., Zheng Q.W., Zou Y., Wei T. et al. The beneficial potential of protein hydrolysates as prebiotic for probiotics and its biological activity: a review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2023. Vol. 9. P. 1-13. DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2023.2260467

4. Харитонов Д.В., Харитонова И.В., Просеков А.Ю. Разработка концепции создания синбиотиков и синбиотических молочных продуктов // Техника и технология пищевых производств. 2013. Т. 31, № 4. С. 91-94.

5. Wang H., Huang T., Liu K., Yu J., Yao G., Zhang W. et al. Protective effects of whey protein hydrolysate on Bifidobacterium animalis ssp. lactis Probio-M8 during freeze-drying and storage // J. Dairy Sci. 2022. Vol. 105, N 9. P. 7308-7321. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2021-21546

6. Крумликов В.Ю., Остроумов Л.А., Сухих С.А., Кригер О.В. Подбор параметров стабилизации (замораживание и сушка) симбиотического консорциума с целью получения закваски прямого внесения // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 42, № 3. С. 25-30.

7. Раскошная Т.А., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Бегунова А.В. Разработка питательной среды и режимов культивирования Lactobacillus reuteri для получения бактериального концентрата // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 42, № 3. С. 56-62.

8. Yu Y.-J., Amorim M., Marques C., Calhau C., Pintado M. Effects of whey peptide extract on the growth of probiotics and gut microbiota // J. Funct. Foods. 2016. Vol. 21. P. 507-516. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.10.035

9. Семенихина В.Ф., Раскошная Т.А., Рожкова И.В., Бегунова А.В., Ширшова Т.И. Разработка технологического процесса получения бактериального концентрата Lactobacillus reuteri // Вестник ОрелГАУ. 2016. № 5 (62). С. 86-93.

10. Мельникова Е.И., Богданова Е.В. Оценка кинетических параметров протеолиза сывороточных белков в УФ-концентрате подсырной сыворотки // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2020. Т. 82, № 4. С. 107-112. DOI: https://doi.org/10.20914/2310-1202-2020-4-107-112

11. Sereda A.S., Kostyleva E.V., Velikoretskaya I.A., Tsurikova N.V. Whey proteins hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2022. Vol. 1052. Article ID 012045. DOI: https://doi.org/10.1088/1755-1315/1052/1/012045

12. Shah N.P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods // J. Dairy Sci. 2000. Vol. 83, N 4. P. 894-907. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(00)74953-8

13. Утебаева А.А., Бурмасова М.А., Сысоева М.А. Перспективы использования бифидобактерий в продуктах функционального питания и лекарственных средствах // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, № 4. С. 100-109. DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2016-6-4-100-109

14. Суховская И.В., Борвинская Е.В., Смирнов Л.П., Немова Н.Н. Сравнительный анализ методов определения концентрации белка спектрофотометрии в диапазоне 200-220 нм и по Бредфорд // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2010. № 2. С. 68-71.

15. Морозова А.Н., Головнева Н.А., Рябая Н.Е., Сафонова М.Е. Галактозидазы Bifidobacterium longum БИМ в-813Д с трансгликозилирующей активностью // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2021. № 2. С. 61-68. DOI: https://doi.org/10.11134/btp.2.2021.5

16. Горбатова К.К., Гунькова П.И. Биохимия молока и молочных продуктов : учебник. 5-е изд., испр. и доп. Санкт-Петербург : ГИОРД, 2021. 336 с. ISBN: 976-5-98879-219-2.

17. Zhang K., Liu S., Liang S., Xiang F., Wang X., Lian H. et al. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: Structure, biological activity, structure-activity relationship, and application in the food industry: a review // Int. J. Biol. Macromol. 2024. Vol. 257, pt 2. Article ID 128733. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128733

18. Захарова Ю.В., Леванова Л.А., Отдушкина Л.Ю. Фундаментальные и прикладные аспекты исследования экзополисахаридов бифидобактерий // Фундаментальная и клиническая медицина. 2021. Т. 6, № 1. С. 53-59. DOI: https://doi.org/10.23946/2500-0764-2021-6-1-53-59

19. Rajoka M.S.R., Wu Y., Mehwish H.M., Bansal M., Zhao L. Lactobacillus exopolysaccharides: new perspectives on engineering strategies, physiochemical functions, and immunomodulatory effects on host health // Trends Food Sci. Technol. 2020. Vol. 103. P. 36-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2020.06.003

20. Castro-Bravo N., Margolles A., Wells J., Ruas-Madiedo P. Exopolysaccharides synthesized by Bifidobacterium animalis subsp. lactis interact with TLR4 in intestinal epithelial cells // Anaerobe. 2019. Vol. 56. P. 98-101. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2019.02.014

21. Castro-Bravo N., Wells J.M., Margolles A., Ruas-Madiedo P. Interactions of surface exopolysaccharides from Bifidobacterium and Lactobacilus within the intestinal environment // Front. Microbiol. 2018. Vol. 9. Р. 2426. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02426

22. Deeth H., Bansal N. Whey proteins: an overview // Whey Proteins: from Milk to Medicine. San Diego : Academic Press, 2019. P. 1-50. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812124-5.00001-1

23. Guo M., Wang C. Chemistry of whey proteins // Whey Protein Production, Chemistry, Functionality, and Applications / ed. M. Guo. Wiley, 2019. P. 39-65. DOI: https://doi.org/10.1002/9781119256052.ch3

24. Несчисляев В.А., Мокин П.А., Орлова Е.В., Маслов Ю.Н., Савина А.С. Кислотообразование и кислотоустойчивость пробиотиков // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2020. Т. 22, № 12. С. 34-38. DOI: https://doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-12-34-38

25. Бегунова А.В., Рожкова И.В., Зверева Е.А., Глазунова О.А., Федорова Т.В. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными и гипотензивными свойствами // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. T. 55, № 6. С. 566-577. DOI: https://doi.org/10.1134/S0555109919060047

26. Беркли Р., Бок Э., Бун Д. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2 т. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита, Дж. Стейли, С. Уилльямса ; пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. 9-е изд. Москва : Мир. 1997. 429 с. ISBN: 5-03-00310-3.

27. Занданова Т.Н. Выбор криопротекторов для замораживания бактериального концентрата симбиотической закваски // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. 2021. № 3. С. 163-168. DOI: https://doi.org/10.36718/1819-4036-2021-3-163-168

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.