Влияние фикоцианинов из Arthrospira platensis на эффективность иммунизации противокоронавирусной вакциной in vivo

Шипелин Владимир Александрович; Холина Арина Владимировна; Замятина Анна Валерьевна; Мазо Владимир Кимович; Никитюк Дмитрий Борисович

Резюме

Создание отечественных специализированных пищевых продуктов, предназначенных для повышения устойчивости иммунной системы человека к вирусным инфекциям, является актуальным разделом современной нутрициологии. Фикоцианины (ФЦ) пищевой цианобактерии Arthrospira platensis обладают потенциальными иммуномодулирующими свойствами. Существенный интерес представляет исследование возможности применения концентратов ФЦ в качестве пероральных иммуностимуляторов и/или иммуноадъювантов в сценариях вакцинации.

Цель настоящего исследования - изучение способности концентрата ФЦ и комплекса ФЦ с яичным белком (Модуль) оказывать влияние на состояние звеньев клеточно-опосредованного и гуморального иммунитета у лабораторных грызунов - мышей BALB/c - на разработанной модели ослабленной вакцинации препаратом "Спутник V".

Материал и методы. В эксперименте использовали 34 самца мышей линии BALB/c c исходной массой тела 20,0±1,0 г в возрасте 4-5 нед. Были сформированы 5 групп: контроль, ФЦ-200, ФЦ-420, Модуль-200 и Модуль-420. Концентрат ФЦ и Модуль вводили перорально ежедневно в течение 49 сут в дозах 200 и 420 мг на 1 кг массы тела (в пересчете на ФЦ). Вакцину "Спутник V" для профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 человека вводили всем животным на 29-е и 50-е сутки. При изучении иммуноадъювантного потенциала концентрата ФЦ и Модуля на 49, 57, 64, 141 и 171-й день методом иммуноферментного анализа оценивали уровни иммуноглобулинов класса G (IgG) к SARS-CoV-2. На 28, 31 и 51-й дни методом цитометрии оценивали иммуностимулирующие свойства путем иммунофенотипирования лимфоцитов крови. По окончании эксперимента на 190-е сутки оценивали интегральные, гематологические и биохимические (сыворотка крови) показатели.

Результаты. При оценке иммуноадъювантных свойств концентрата ФЦ и Модуля на 64-е сутки обнаружено значительное увеличение титров IgG до 1/115 000 и 1/128 000 у животных групп Модуль-200 и Модуль-420 соответственно. У мышей группы Модуль-200 на 141-е сутки концентрация антител была выше контроля практически в 2 раза. С 141-х по 171-е сутки наблюдались повышенные титры антител во всех опытных группах по сравнению с контролем. При исследовании иммуностимулирующих свойств изучаемых объектов на 31-й день исследования у животных групп Модуль-200 и Модуль-420 установлено увеличение численности субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов на 29 и 42% соответственно. По окончании эксперимента были выявлены незначительные сдвиги в биохимических показателях крови, отсутствовали изменения в гематологических показателях; у мышей группы Модуль-420 обнаружено увеличение массы сердца на 11,7%.

Заключение. Проведенный эксперимент продемонстрировал наличие иммуноадъювантных свойств у концентрата ФЦ и Модуля, особенно выраженных в группе Модуль-200. Модуль оказывал иммуностимулирующее действие на клеточно-опосредованный иммунитет. Выраженность эффектов у Модуля в отличие от концентрата ФЦ, по всей видимости, связана с его лучшей стабильностью в условиях среды желудочно-кишечного тракта. Необходимы дальнейшие исследования секреторной активности иммунокомпетентных клеток, которые могут пролить свет на природу воздействия ФЦ на ключевые звенья иммунной системы.

Ключевые слова: Arthrospira platensis; фикоцианины; концентрат фикоцианинов; белковый комплекс фикоцианина; доклинические исследования; иммуномодулятор; иммуноадъювант; SARS-CoV-2

Пандемия COVID-19 продемонстрировала важность нутриентной поддержки организма человека как с позиции противодействия вирусу SARS-CoV-2, так и для формирования устойчивого гуморального иммунного ответа при вакцинации [1, 2]. Создание отечественной специализированной пищевой продукции диетического профилактического питания, предназначенной для повышения устойчивости иммунной системы человека к вирусным инфекциям, является актуальным разделом современной нутрициологии. Важным этапом, определяющим возможность дальнейшей клинической апробации такой продукции, является доклиническое тестирование разработанных пищевых ингредиентов на экспериментальных моделях.

Выбор пищевого иммуномодулятора для этих целей определяется его способностью влиять на совокупность реакций иммунного ответа, активируемых для защиты организма от инфекционных агентов [3]. Иммуномодуляторы классифицируются на иммуностимуляторы, иммуноадъюванты и иммунодепрессанты [4]. Если иммунодепрессанты применяются для ингибирования аномального гуморального и клеточного иммунитета при лечении аутоиммунных заболеваний, то иммуностимуляторы воздействуют неспецифически и используются для повышения устойчивости организма к инфекции, действуя как через врожденные, так и через адаптивные механизмы иммунного ответа [5]. Иммуноадъюванты, в свою очередь, находят применение для повышения эффективности гуморального иммунного ответа при вакцинации, не вызывая специфических антигенных эффектов [3, 5].

Помимо разнообразных растительных источников природных биологически активных веществ (БАВ) [3] с широко изученными иммуномодулирующими свойствами [эхинацея (Echinacea purpurea L.), лакрица (Glycyrrhiza glabra L.), куркума (Curcuma longa L.) и др.], отдельный интерес представляет исследование БАВ из морских организмов, в частности из микроводорослей и цианобактерий [6, 7]. К числу последних относится Arthrospira platensis (A. platensis), содержащая наряду с незначительным количеством макроэлементов (калий, кальций, магний, фосфор, натрий) ряд микроэлементов (медь, железо, марганец, цинк, хром, селен), витамины группы В (В₁, В₂, В₃), К, D и Е, природные фотосинтетические пигменты - фикобилипротеины, которые являются основным источником фикоцианинов (ФЦ), а также хлорофиллы и каротиноиды [8].

Фикобилипротеины A. platensis (С-ФЦ и аллофикоцианин) обладают потенциальными антиоксидантными, антиканцерогенными, противовоспалительными, антимикробными и противовирусными свойствами [9, 10]. Несмотря на многолетнюю историю исследований A. platensis в научной литературе представлено незначительное количество экспериментальных работ, посвященных изучению иммуномодулирующих свойств ФЦ in vivo. В работе [11] установлено усиление иммунного ответа, выраженное в достоверном увеличении сывороточной концентрации интерферона γ у более чем 50% мужчин 40-65 лет, употреблявших в течение 2 мес концентрированный водный экстракт A. platensis. В 2 независимых исследованиях было показано существенное воздействие 7-дневного потребления экстракта на основе A. platensis на активность NK-клеток у здоровых североамериканцев и датчан, проявляющееся в увеличении экспрессии мРНК маркеров NK-клеток NKG2D, NK- и Т-клеток перфорина [12, 13]. В 30-дневном исследовании подострой пероральной токсичности [14] у мышей линии BALB/c С-ФЦ не вызывал неблагоприятных эффектов даже при максимальной дозе 2000 мг на 1 кг массы тела. Вместе с этим при изучении концентрации 12 цитокинов в сыворотке крови было обнаружено, что С-ФЦ дозозависимо подавляет синтез провоспалительных цитокинов (интерферона γ и фактора некроза опухоли α) на фоне повышения уровней противовоспалительного цитокина - интерлейкина 10. Таким образом, проведенные исследования ФЦ in vivo демонстрируют их безопасность и иммуномодулирующий потенциал.

Несмотря на широкий круг научных исследований по использованию биомассы A. platensis в питании в доступной научной литературе отсутствуют сведения об ее использовании в качестве пищевых ингредиентов в составе специализированной пищевой продукции, предназначенной для повышения эффективности иммунизации, в том числе при коронавирусных инфекциях. В этой связи существенный интерес представляет исследование возможности применения концентратов ФЦ в качестве пероральных иммуностимуляторов или иммуноадъювантов в сценариях вакцинации. Вместе с этим следует учитывать, что ФЦ являются фото- и термочувствительными соединениями [15], восприимчивыми к деградации в ходе технологического процесса или при хранении. Кроме того, важным дестабилизирующим фактором ФЦ является кислотность среды, оказывающая влияние на скорость их денатурации и/или протеолиза [16], особенно в процессе желудочно-кишечного переваривания [17]. Создание комплексов ФЦ с различными белками, как это показано для других светочувствительных микронутриентов, может, по-видимому, снизить степень их деградации [18].

Целью настоящего исследования была экспериментальная оценка способности концентратов фикобилипротеинов и их комплексов с яичным белком оказывать влияние на состояние звеньев клеточно-опосредованного и гуморального иммунитета у лабораторных грызунов - мышей BALB/c - на разработанной модели ослабленной двукратной иммунизации вакциной "Спутник V".

Материал и методы

Характеристика использованных концентратов фикоцианинов

Объектом исследования был образец сухой биомассы A. platensis (НПО "Биосоляр МГУ", РФ). Для проведения in vivo исследований получали экстракт ФЦ с его последующим концентрированием согласно ранее описанной методике [19]. Полученный сухой концентрат ФЦ характеризовался степенью чистоты 1,98; суммарное содержание ФЦ (С-ФЦ и аллофикоцианина) составляло 50,9±0,7%. Полученный концентрат использовали для приготовления сухого пищевого ингредиента (далее - Модуль), представляющего собой комплекс концентрата ФЦ A. platensis с яичным белком, добавленным в соотношении 5:1 (белок : ФЦ). Для этого навеску сухого концентрата ФЦ вносили в раствор яичного белка, произведенного по ГОСТ 30363-2013 (АО "РусАгроГрупп ПКФ", РФ), перемешивали, охлаждали до -18 °С и лиофильно высушивали. Массовая доля ФЦ в Модуле составляла 8,8±0,2%. Методом флуоресцентной спектроскопии было показано [20] образование связи между ФЦ и аминокислотами, входящими в состав яичного белка, с последующим экранированием молекул ФЦ от действия возбуждающего излучения. Таким образом, ФЦ в составе Модуля в определенной степени изолированы от действия внешних факторов, что может влиять на их стабильность при хранении и переработке [20].

Следование нормативным стандартам

Исследование проведено на базе Центра биологических испытаний Филиала ГНЦ ФИБХ РАН, имеющего сертификаты соответствия принципам надлежащей лабораторной практики Федеральной службы аккредитации (приказ № НЛП-4 от 03.03.2022) и GLP OECD Турецкого аккредитационного агентства ТÜRKAK (AB-0028-Il от 19.03.2024). Исследование было проведено в соответствии c межгосударственным стандартом "Принципы надлежащей лабораторной практики" (ГОСТ 33044-2014). Условия содержания и ухода за животными соответствовали ГОСТ 33216 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами" и Директиве 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. При проведении эксперимента не было зарегистрировано отклонений, способных повлиять на интерпретацию полученных данных. Все экспериментальные манипуляции выполняли согласно утвержденным в лаборатории стандартным операционным процедурам.

Обращение с экспериментальными животными и этические стандарты

Процедуры с животными были рассмотрены и утверждены биоэтической комиссией Филиала ГНЦ ФИБХ РАН (протокол № 939/23 от 23.06.2023). В эксперименте использовали 34 самца мышей линии BALB/c с исходной массой тела 20,0±1,0 г в возрасте 4-5 нед, полученных из НПП "Питомник лабораторных животных" ГНЦ ФИБХ РАН (Пущино, Московская область, РФ). Производителем животных были предоставлены сведения о контроле их здоровья, подтверждающие статус SPF-животных (свободные от определенных патогенов). Мышей содержали по отдельности в поликарбонатных клетках в комнате барьерного типа. В клетки помещали дополнительно материал обогащения окружающей среды (древесные волокна Lignocel Nesting, JRS, Германия). Условия параметров микроклимата в комнатах содержания животных соответствовали требованиям руководства [21]. Мышей содержали в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 20-24 °C, относительной влажности 30-55%, 10-кратной смене объема воздуха комнаты в час и 12-часовом цикле освещения: "день" - 08:00-20:00, "ночь" - 20:00-08:00. Животные получали ad libitum воду, очищенную на установке Milli-RO, и стандартный гранулированный автоклавируемый корм для содержания лабораторных грызунов (Altromin 1324).

Дизайн исследования

В основе дизайна исследования лежали рекомендации по проведению доклинических испытаний лекарственных веществ [22]. Были сформированы 5 групп по 6 и 7 особей в каждой (табл. 1). Тестируемые объекты (концентрат ФЦ и Модуль) вводили животным перорально зондом в желудок в дозах 200 и 420 мг на 1 кг массы тела ежедневно в течение 49 сут (в объеме 10 мл/ кг). Дозы для 2-5-й групп (см. табл. 1) рассчитывали исходя из процентного содержания ФЦ в концентрате (2-я и 3-я группы) и Модуле (4-я и 5-я группы), в соответствии с последними значениями массы тела. Комбинированную векторную вакцину "Гам-КОВИД-Вак" ("Спутник V") для профилактики коронавирусной инфекции человека вводили двукратно на 29-й и 50-й день исследования внутримышечно в объеме 50 мкл в четырехглавую мышцу бедра.

Всех животных ежедневно осматривали для своевременного выявления отклонений после тестируемых объектов. Массу тела регистрировали перед началом введения препаратов и далее еженедельно в течение всего исследования. В ходе прижизненной фазы исследования на 49, 57, 64, 141 и 171-й день у животных собрали образцы крови в объеме 100 мкл для получения сыворотки с последующим проведением иммуноферментного анализа (ИФА) для изучения уровней иммуноглобулинов класса G (IgG) к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2. Образцы крови помещали в пробирки без антикоагулянта, оставляли для сворачивания в течение 60 мин, центрифугировали (1600 g, 4 °C, 15 мин) и хранили при температуре -15--25 °C до проведения анализа. Для оценки клеточного иммунного ответа (иммунофенотипирование лимфоцитов) образцы цельной крови (100 мкл) были собраны на 28, 31 и 51-й день исследования. Кровь брали из латеральной хвостовой вены с помощью катетера с иглой 26G. Образцы крови помещали в пробирки, содержащие K₃EDTA, и сразу передавали для анализа.

В конце прижизненной фазы на 190-й день исследования животные были подвергнуты эвтаназии путем анестезии (Телазол^®/Ксиланит^®) с последующим терминальным взятием крови из нижней полой вены для оценки гематологических и биохимических показателей крови. Для анализа гематологии образцы крови помещали в пробирки Microvette^®, содержащие K₃ЭДТА. Для биохимического анализа образцы крови помещали в пробирки без антикоагулянта, оставляли в течение 60 мин для сворачивания и центрифугировали (1600 g, 4 °C, 15 мин). Полученную сыворотку хранили при температуре -15--25 °C до проведения анализа. При некропсии были оценены интегральные показатели - процентные отношения массы органов (головной мозг, почки, сердце, надпочечники, легкие, печень, тимус и селезенка) к массе тела. Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Вакцина

Для иммунизации животных была использована комбинированная векторная вакцина "Гам-КОВИД-Вак" ("Спутник V"), Филиал "Медгамал" ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, РФ) для профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2. Вакцина состоит из 2 компонентов: компонент I и компонент II. В состав компонента I входит рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 26-го серотипа, несущий ген белка S вируса SARS-CoV-2 в количестве (1,0±0,5)×10¹¹ частиц/ доза. В состав компонента II входит рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5-го серотипа, несущий ген белка S вируса SARS-CoV-2 в количестве (1,0±0,5)×10¹¹ частиц/доза.

Оценка показателей гуморального иммунного ответа методом иммуноферментного анализа

В качестве реагентов для ИФА были использованы наборы для иммуноферментного выявления IgG к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2 "SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи" по ТУ 21.20.23-090-01894956-2020 (Филиал "Медгамал" ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, РФ). Определение проводили согласно рекомендациям производителя со следующей модификацией: после отмывки несвязавшихся антител, в качестве конъюгата вносили моноклональные антитела к IgG мыши (XpressBio, США), конъюгированные с пероксидазой хрена. Результаты изучения уровней специфических IgG к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 представлены в виде титров, отражающих предельное разведение сыворотки крови, при котором могут быть обнаружены антитела.

Оценка показателей клеточного иммунного ответа методом проточной цитометрии

Образы крови, помещенные в пробирку с K₃ЭДТА, анализировали на автоматизированном проточном цитометре Attune^® NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Fisher Scientific, США). Методом проточной цитометрии получены данные о процентном содержании В-клеток (CD19-ER780, Elabscience, Китай), NK-клеток (CD335-APC, Elabscience, Китай), общее содержание Т-клеток (CD3-PE, Elabscience, Китай), Т-хелперы (в гейте CD3, CD4-PerCP/Cy5.5, Elabscience, Китай) и T-киллеры (в гейте CD3, меченные CD8а-PE/Cy7, Elabscience, Китай). Субпопуляционные данные получены в общей популяции лейкоцитов (CD45-FITC, Elabscience, Китай). Обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения FlowJo 10. Иммунорегуляторный индекс (ИИ, IMMi) рассчитывали как отношение количества Т-хелперов к количеству T-киллеров.

Оценка гематологических и биохимических показателей крови

Гематологические показатели определяли в пробах цельной крови в К₃ЭДТА в течение 2-3 ч после их отбора на гематологическом анализаторе Mythic 18 Vet (C2 Diagnostics S.A., Франция). Анализировали количество эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит, количество лейкоцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, средний объем эритроцита, широту распределения эритроцитов по объему, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, тромбокрит, широту распределения тромбоцитов по объему, абсолютное и относительное количество лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов.

В сыворотке крови на автоматическом биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400 (Prestige 24i, Tokyo Boeki, Япония) с использованием реагентов (Randox Laboratories Ltd, Великобритания) анализировали стандартный набор биохимических показателей.

Статистический анализ

Использовали методы описательной статистики: расчет среднего и стандартного отклонения; для уровней специфических IgG рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку среднего. Для установления межгрупповых различий данные анализировали многофакторным дисперсионным анализом ANOVA-2 с последующим тестом Дункана. Значения масс органов анализировали однофакторным дисперсионным анализом с использованием теста Краскела-Уоллиса. При уровне значимости дисперсионного анализа р<0,05 применяли тест Манна-Уитни для попарного сравнения групп. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 7.1. Различия определяли при 5% уровне значимости. Анализ взаимосвязей в показателях гуморального иммунитета мышей проводили методом главных компонент в среде R версии 4.4.1 (2024-06-14) с использованием модулей "factoextra" и "FactoMineR" [23-25].

Результаты и обсуждение

Характеристика in vivo модели

Для оценки иммуностимулирующего и иммуноадъювантного потенциала концентрата ФЦ и Модуля у мышей BALB/c при иммунизации вакциной "Спутник V" против вируса SARS-CoV-2 была разработана модель, позволяющая прижизненно в длительной перспективе мониторировать показатели гуморального и клеточного иммунного ответа. Для этих целей была выбрана схема 49-дневного периода профилактического кормления разработанными препаратами с двукратной прайм-буст иммунизацией вакциной "Спутник V" на 29-й и 50-й день исследования по рекомендованной для клинического применения схеме [26]. Следует отметить, что режим дозирования вакцины в проведенных ранее in vivo исследованиях на мышах с использованием препарата "Спутник V" соответствовал дозам для человека [27, 28], что, по-видимому, способствует длительной стимуляции специфических антител к SARS-CoV-2, затрудняя их адекватную оценку. Для возможности мониторинга иммунологических показателей в доступные временные рамки нами была предпринята попытка воспроизвести экспериментальную модель при десятикратно ослабленных дозах вакцинации, что позволило в течение 141 дня с момента первой иммунизации оценивать формирование и угасание гуморального иммунного ответа у мышей BALB/c. Как видно из данных, представленных на рис. 2, средние значения титров специфических IgG за день до второй вакцинации (49-е сутки) составляли в среднем не более чем 1/2000. Однако уже через неделю после второй иммунизации титры выросли более чем в 10 раз и достигли своего максимума к 64-му дню исследования, составляя в среднем 1/60 000 и оставаясь существенно высокими (1/14 200) вплоть до 171-го дня. Эти результаты свидетельствуют о высокой иммуногенности вакцины "Спутник V" у мышей линии BALB/c даже при десятикратно сниженных дозах иммунизации.

При выборе экспериментальных доз ФЦ мы руководствовались результатами 30-дневного исследования подострой пероральной токсичности [14], где С-ФЦ у мышей линии BALB/c, начиная с дозы 500 мг на 1 кг массы тела и более, вызывал дозозависимое увеличение активности ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы, являющихся 2 из 3 ферментов первой линии антиоксидантной защиты [29]. Следует отметить, что в работе [14], начиная с дозы ФЦ 200 мг на 1 кг массы тела, в крови мышей было обнаружено дозозависимое снижение синтеза провоспалительных цитокинов - интерферона γ и фактора некроза опухоли α - на фоне повышения уровней противовоспалительного интерлейкина 10.

Результаты мониторинга состояния здоровья животных и оценки интегральных показателей

На протяжении всего эксперимента ни у одного животного не наблюдалось отклонений, связанных с введением тестируемых объектов или противокоронавирусной вакцины; отсутствовали различия в приростах массы тела. При оценке относительных масс органов, собранных при некропсии, у животных, получавших ФЦ в дозе 420 мг/кг, отмечено достоверное увеличение массы сердца на 11,7% по сравнению с контролем (p<0,05, критерий Манна-Уитни). Данные изменения, несмотря на незначительную величину, выходят за пределы естественной вариабельности нормы и связаны, по-видимому, с выявленными у 2 мышей в этой группе признаками очаговой вакуолизации саркоплазмы кардиомиоцитов (данные не показаны). Для уточнения причин дегенерации кардиомиоцитов или выявления других цитоплазматических включений требуется проведение ультраструктурного исследования с привлечением методов электронной микроскопии [30].

Исследование иммуноадъювантных свойств концентрата фикоцианинов и Модуля

Для оценки иммуноадъювантных свойств концентрата ФЦ и Модуля на фоне их 49-дневного потребления изучали динамику гуморального иммунного ответа у мышей после иммунизации вакциной "Спутник V". Во всех опытных группах, как и в контроле, пик выработки специфических IgG был зафиксирован после вакцинации вторым компонентом на 64-е сутки исследования (см. рис. 2). К этому моменту наиболее значительное увеличение количества антител наблюдалось в группах, получавших Модуль в дозах 200 и 420 мг на 1 кг массы тела, - средние титры IgG к SARS-CoV-2 достигали 1/115 000 и 1/128 000. В 4-й группе (Модуль-200) на 141-е сутки эксперимента концентрация антител держалась достоверно выше относительно контрольной группы практически в 2 раза (p<0,05, критерий Манна-Уитни). В период наблюдения с 141-го по 171-й день обращают на себя внимание в среднем повышенные титры антител во всех опытных группах по сравнению с контролем.

Для изучения корреляции между показателями, характеризующими гуморальный иммунный ответ к SARS-CoV-2 у мышей, - уровнями специфических IgG, и оценки вклада потребления концентрата ФЦ и Модуля в их динамику был использован метод главных компонент. На основании матрицы корреляций были построены векторы взаимосвязи переменных (рис. 3). Поскольку корреляционная матрица отражает степень линейной связи между различными переменными, то векторы будут задавать направления с максимальной дисперсией данных [31]. Согласно представленным на рис. 3 графикам, РСА сгруппировал коррелирующие в динамике показатели уровней IgG к SARS-CoV-2 в 2 главные компоненты, в одной из которых кластеризовались данные контрольной группы и группы ФЦ-420, а в другой - данные групп Модуль-200, Модуль-420 и ФЦ-200 как наиболее близко взаимосвязанные на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что, несмотря на высокую дисперсию значений IgG в группах, вектор группы Модуль-200 имел практически ортогональную направленность по сравнению с контролем. Эти сведения, вместе с отмеченными ранее достоверными отличиями титров антител группы Модуль-200 от контроля (на 141-й день), в определенной степени характеризуют комплекс ФЦ с яичным белком как оказывающий иммуноадъювантное действие у мышей линии BALB/c при дозе 200 мг на 1 кг массы тела.

Исследование иммуностимулирующих свойств концентрата фикоцианинов и Модуля

Для оценки иммуностимулирующих свойств концентрата ФЦ и Модуля на фоне вакцинации изучали состояние клеточного иммунного ответа мышей путем иммунофенотипирования лимфоцитов за день до введения первого компонента вакцины, спустя 48 ч после введения (31-е сутки) и через сутки после введения второго компонента (51-е сутки). Отсутствовали изменения в показателях клеточного иммунитета между группами до начала иммунизации вакциной "Спутник V" и после введения второго компонента (данные не показаны). Вместе с этим через 48 ч после первой иммунизации были обнаружены статистически значимые изменения у животных групп Модуль-200 и Модуль-420 (табл. 2). В группе животных, получавших Модуль в дозе 200 мг на 1 кг массы тела, было выявлено достоверное увеличение популяции цитотоксических Т-лимфоцитов на 29,3% относительно показателя контрольной группы (р<0,05, тест Манна-Уитни). В группе Модуль-420 было также обнаружено достоверное дозозависимое увеличение концентрации цитотоксических Т-лимфоцитов на 42% на фоне снижения концентрации T-хелперов на 27,4% и иммунорегуляторного индекса на 45,7% относительно контроля (р<0,05, тест Манна-Уитни). Таким образом, употребление Модуля уже на 31-е сутки в обеих дозах способствовало стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета, увеличивая выработку цитотоксических Т-лимфоцитов. Считается, что именно цитотоксические Т-лимфоциты (CD8⁺-Т-клетки) остаются активными в отношении вируса даже при снижении титров антител или при ускользании вариантов SARS-CoV-2 от иммунной защиты после перенесенной болезни или вакцинации [32, 33].

Характеристика гематологических и биохимических показателей

По окончании эксперимента (190-й день) отсутствовали изменения в гематологических показателях мышей после употребления в течение 49 сут концентрата ФЦ и Модуля на фоне вакцинации (данные не показаны). При оценке биохимических показателей крови (табл. 3) наблюдались изменения в концентрациях мочевины у животных группы Модуль-420, креатинина в группах ФЦ-420, Модуль-200 и Модуль-420, альбумина и соотношения альбумин/глобулины в группе ФЦ-420. Тем не менее выявленные изменения были не дозозависимыми, незначительными по величине и достигли уровня статистической значимости лишь за счет высокой однородности выборки.

Заключение

Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод о наличии иммуноадъювантных свойств у концентрата ФЦ и Модуля, особенно выраженных в группе Модуль-200. Вместе с этим только Модуль обладал дозозависимыми иммуностимулирующими свойствами в отношении показателей клеточно-опосредованного иммунитета. Выявленные иммуномодулирующие эффекты не оказывали влияния на гематологические показатели и вызывали незначительные (в пределах физиологической нормы) сдвиги в биохимических показателях крови. Вместе с этим при наибольшей из доз Модуля (420 мг на 1 кг массы тела) отмечены признаки очаговой вакуолизации саркоплазмы кардиомиоцитов, по-видимому, оказавшие влияние на увеличение массы сердца у животных этой группы, что может рассматриваться как признак органотоксического действия высокой дозы ФЦ в Модуле. Следует отметить, что проявление большинства эффектов у Модуля в отличие от концентрата ФЦ, по всей видимости, связано с его лучшей стабильностью в условиях среды желудочно-кишечного тракта. Для выяснения механизмов выявленных эффектов необходимо проведение дополнительных исследований, не вошедших в цели настоящего эксперимента, среди которых, в частности, исследование секреторной активности иммунокомпетентных клеток - уровней цитокинов и хемокинов. Отдельный интерес представляет исследование иммуномодулирующей способности концентратов высокоочищенных ФЦ (70% и более) в липосомальной форме. Разработанная в рамках настоящего исследования invivo модель может быть использована в доклинических испытаниях эффективности профилактических схем приема пероральных БАВ-иммуномодуляторов и исследованиях иммуноадъювантов. Результаты проведенного исследования делают целесообразным в дальнейшем проведение клинической апробации Модуля в пересчете дозировок, не превышающих использованную в настоящем исследовании дозу ФЦ 200 мг на 1 кг массы тела.

Литература

1. Rust P., Ekmekcioglu C. The role of diet and specific nutrients during the COVID-19 pandemic: what have we learned over the last three years? // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2023. Vol. 20, N 7. P. 5400. DOI: https://doi.org/10.3390/ijerph20075400
2. Deng Y., Huang L., Liu P., Geng X., Lin Z., Zheng Z. et al. Association of fat-soluble vitamins (A, D, and E) status with humoral immune response to COVID-19 inactivated vaccination // Front. Nutr. 2023. Vol. 10. Article ID 1167920. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2023.1167920
3. Sotto A. Di, Vitalone A., Giacomo S. Di. Plant-derived nutraceuticals and immune system modulation: an evidence-based overview // Vaccines. 2020. Vol. 3, N 8. P. 468. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines8030468
4. Behl T., Kumar K., Brisc C., Rus M., Nistor-Cseppento D., Bustea C. et al. Exploring the multifocal role of phytochemicals as immunomodulators // Biomed. Pharmacother. 2021. Vol. 133. Article ID 110959. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110959
5. Hooda P., Malik R., Bhatia S., Al-Harrasi A. Najmi A., Zoghebi K. et al. Phytoimmunomodulators: a review of natural modulators for complex immune system // Heliyon. 2023. Vol. 10, N 1. Article ID e23790. DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e23790
6. Montuori E., de Pascale D., Lauritano C. Recent discoveries on marine organism immunomodulatory activities // Mar. Drugs. 2022. Vol. 20, N 7. P. 422. DOI: https://doi.org/10.3390/md20070422
7. Bouyahya A., Bakrim S., Chamkhi I., Taha D., El Omari N., El Mneyiy N. et al. Bioactive substances of cyanobacteria and microalgae: sources, metabolism, and anticancer mechanism insights // Biomed. Pharmacother. 2024. Vol. 170. Article ID 115989. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.115989
8. Fernandes R., Campos J., Serra M., Fidalgo J., Almeida H., Casas A. et al. Exploring the benefits of phycocyanin: from Spirulina cultivation to its widespread applications // Pharmaceuticals (Basel). 2023. Vol. 16, N 4. P. 592. DOI: https://doi.org/10.3390/ph16040592
9. Gentscheva G., Nikolova K., Panayotova V., Peycheva K., Makedonski L., Slavov P. et al. Application of Arthrospira platensis for medicinal purposes and the food industry: a review of the literature // Life. 2023. Vol. 13. P. 845. DOI: https://doi.org/10.3390/life13030845
10. Бирюлина Н.А., Мазо В.К., Багрянцева О.В. Фикоцианины Arthrospira platensis: перспективы использования в специализированной пищевой продукции (краткий обзор) // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 30-36. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-30-36
11. Ratha S.K., Renuka N., Rawat I., Bux F. Prospective options of algae-derived nutraceuticals as supplements to combat COVID-19 and human coronavirus diseases // Nutrition. 2021. Vol. 83. Article ID 111089. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nut.2020.111089
12. Finamore A., Palmery M., Bensehaila S., Peluso I. Antioxidant, immunomodulating, and microbial-modulating activities of the sustainable and ecofriendly Spirulina // Oxid. Med. Cell. Longev. 2017. Vol. 2017. Article ID 3247528. DOI: https://doi.org/10.1155/2017/3247528
13. Nielsen C.H., Balachandran P., Christensen O., Pugh N.D., Tamta H., Sufka K.J. et al. Enhancement of natural killer cell activity in healthy subjects by Immulina®, a Spirulina extract enriched for Braun-type lipoproteins // Planta Med. 2010. Vol. 76, N 16. P. 1802-1808. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0030-1250043
14. Grover P., Bhatnagar A., Kumari N., Narayan Bhatt A., Kumar Nishad D., Purkayastha J. C-Phycocyanin - a novel protein from Spirulina platensis - in vivo toxicity, antioxidant and immunomodulatory studies // Saudi J. Biol. Sci. 2021. Vol. 28, N 3. P. 1853-1859. DOI: https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.12.037
15. Петрухина Д.И., Лыков И.Н. Cтабильность фикоцианина цианобактерии Spirulina subsalsa при различных температурных условиях хранения // Сборник трудов по итогам международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы и достижения в естественных и математических науках". Самара, 2017. Т. 4. 46 c. URL: https://izron.ru/articles/ (дата обращения 10.09.2024)
16. Adjali A., Clarot I., Chen Z., Marchioni E., Boudier A. Physicochemical degradation of phycocyanin and means to improve its stability: a short review // J. Pharm. Anal. 2022. Vol. 12, N 3. P. 406-414. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpha.2021.12.005
17. Teixé-Roig J., Oms-Oliu G., Ballesté-Muñoz S., Odriozola-Serrano I., Martín-Belloso O. Encapsulation and controlled release of phycocyanin during the in vitro digestion using polysaccharide-added double emulsions (W1/O/W2) // Food Struct. 2022. Vol. 31. Article ID 100249. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foostr.2021.100249
18. Vasava H., Singh R., Yadav T. Characterisation of whey protein-polyphenol conjugates prepared by the noncovalent and covalent methods for their effect on the functional properties of whey proteins // Int. J. Dairy Technol. 2022. Vol. 75, N 3. P. 563-574. DOI: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1471-0307.12874
19. Бирюлина Н.А., Зорин С.Н., Никитюк Д.Б., Мазо В.К. Модифицированный метод получения фикоцианинового концентрата биомассы Arthrospira platensis // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 110-116. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-110-116
20. Novokshanova A., Bilyalova A., Aksenov I. Spectrometric study of the interaction of phycocyanins with egg proteins // E3S Web Conf. 2023. Vol. 463. Article ID 01021. DOI: https://doi.org/10.1051/e3sconf/202346301021
21. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the National Academies. Washington : The National Academies Press, 2011. 246 p. ISBN-13: 978-0-309-15401-7; ISBN-10: 978-0-309-15401-4.
22. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Москва : Гриф и К, 2012. 944 с. ISBN: 978-5-8125-1466-3.
23. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria, 2024. URL: https://www.R-project.org (дата обращения: 10.09.2024).
24. Kassambara A., Mundt F. Factoextra: Extract and Visualize the Results of Multivariate Data Analyses. R package version 1.0.7, 2020. URL: https://CRAN.R-project.org/package=factoextra (дата обращения: 10.09.2024).
25. Le S., Josse J., Husson F. FactoMineR: an R package for multivariate analysis // J. Stat. Software. 2008. Vol. 25, N 1. P. 1-18. DOI: https://doi.org/10.18637/jss.v025.i01
26. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I., Shcheblyakov D.V., Dzharullaeva A.S. et al. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia // Lancet. 2020. Vol. 396, N 10 255. P. 887-897. DOI: https://doi.org/1010.1016/S0140-6736(20)31866-3
27. Elgallal E.A., Sadawe I.A., Elghobassa A.H., Alshoushan A.A.A., Bensaber S.M., Elbakay M.A. et al. The effect of Sputnik V COVID-19 vaccine on the body weight of mice // J. Pharm. Res. Rep. 2021. Vol. 2, N 2. P. 2-3. DOI: https://doi.org/10.47363/JPRSR/2021(2)114
28. Dolzhikova I.V., Tukhvatulin A.I., Grousova D.M., Zorkov I.D., Komyakova M.E. Ilyukhina A.A. et al. Immunogenicity and protectivity of Sputnik V vaccine in hACE2-transgenic mice against homologous and heterologous SARS-CoV-2 lineages including far-distanced Omicron BA.5 // Vaccines. 2024. Vol. 12. P. 1152. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines12101152
29. Ighodaro O.M., Akinloye O.A. First line defence antioxidants-superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid // Alexandria J. Med. 2018. Vol. 54. P. 287-293. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajme.2017.09.001
30. Fishbein G.A., Bois M.C., d’Amati G., Glass C., Masuelli L., Rodriguez E.R. et al. Ultrastructural cardiac pathology: the wide (yet so very small) world of cardiac electron microscopy // Cardiovasc. Pathol. 2024. Vol. 73. Article ID 107670. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carpath.2024.107670
31. Jolliffe I.T., Cadima J. Principal component analysis: a review and recent developments // Philos. Trans. A Math. Phys. Eng. Sci. 2016. Vol. 374, N 2065. Article ID 20150202. DOI: https://doi.org/10.1098/rsta.2015.0202
32. Fathi M., Charley L., Cooper L.J., Varadarajan N., Meyer D.D. Cytotoxic T lymphocytes targeting a conserved SARS-CoV-2 spike epitope are efficient serial killers // Biotechniques. 2022. Vol. 72, N 4. P. 113-120. DOI: https://doi.org/10.2144/btn-2022-0016
33. Alter G., Yu J., Liu J., Chandrashekar A., Borducchi E.N., Tostanoski L.H. et al. Immunogenicity of Ad26.COV2.S vaccine against SARS-CoV-2 variants in humans // Nature. 2021. Vol. 596, N 7871. P. 268-272. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03681-2

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.