Анализ влияния ферментных препаратов, получаемых с использованием технологических микроорганизмов, на микробиом и показатели клеточного иммунитета крыс

Багрянцева Ольга Викторовна; Гурэу Зинаида Геннадиевна; Гмошинский Иван Всеволодович; Шевелева Светлана Анатольевна; Маркова Юлия Михайловна; Зотов Владимир Алексеевич ; Трушина Элеонора Николаевна; Шумакова Антонина Александровна; Соколов Илья Евгеньевич; Колобанов Алексей Иванович; Елизарова Елена Викторовна; Хотимченко Сергей Анатольевич

Резюме

Наблюдаемый рост производства ферментных препаратов с использованием мутантных и генетически модифицированных микроорганизмов делает необходимым оценку их рисков здоровью потребителя. Вместе с тем в настоящее время в недостаточной степени изучено их возможное влияние на микробиом и иммунный статус макроорганизма.

Целью исследования было оценить влияние ферментных препаратов: комплекса гидролаз протеолитического и нуклеазного действия из мутантного штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134 (ФП1) и нейтральной протеазы - бациллолизина и сериновой протеазы из мутантного штамма Bacillus subtilis-96 (ВКМ В-3499D) (ФП2) - на микробиом кишечника и клеточный иммунитет подопытных животных.

Материал и методы. Эксперимент по изучению подострой токсичности ферментных препаратов (ФП1 и ФП2) проводили в течение 30 дней с использованием крыс линии Wistar (7 групп крыс по 10 самцов). ФП вводили животным внутрижелудочно в дозах 0 (контроль - физиологический раствор); 1, 10 и 100 мг на 1 кг массы тела в сутки. Состав микробиоценоза изучали путем посева 10-кратных разведений содержимого слепой кишки на дифференциально-диагностические среды. Количество короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК; уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой) в содержимом толстой кишки определяли методом высокоэффективной газовой хроматографии. Экспрессию рецепторов Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток (CD45RА⁺, CD3⁺, CD161⁺, CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺) периферической крови крыс определяли на проточном цитофлуориметре FC-500.

Результаты. Полученные в результате исследований микробиоценоза содержимого слепой кишки данные свидетельствуют о том, что введение ФП1 и ФП2 крысам оказывает значимое влияние на количественный и качественный состав аэробных микроорганизмов, в том числе условно-патогенных, а также вызывает слабовыраженный рост количества бифидо- и лактобактерий. Изменения качественного и количественного состава различных групп микроорганизмов в содержимом слепой кишки, количества КЦЖК в содержимом толстой кишки и показателей клеточного иммунитета при внутрижелудочном введении ФП1 и ФП2 в течение 30 сут обусловили развитие воспалительного процесса у животных всех опытных групп.

Заключение. Выявленные различия состава микробиоценоза слепой кишки и КЦЖК, продуцируемых микрофлорой кишечника, а также показателей клеточного иммунитета подопытных животных при введении ФП1 и ФП2, на наш взгляд, обусловлены спектром продуцируемых микрофлорой кишечника и штаммами Aspergillus oryzae RCAM 01134 и Bacillus subtilis-96 (ВКМ В-3499D) метаболитов. Особенности взаимосвязи между спектром продуцируемых микрофлорой кишечника КЦЖК, их количеством и процентным содержанием Т- и В-лимфоцитов в крови крыс свидетельствуют о различных механизмах влияния ФП1 и ФП2 на микробиом и иммунный статус макроорганизма.

Ключевые слова: оценка рисков; ферментные препараты; короткоцепочечные жирные кислоты; микробиоценоз; клеточный иммунитет; крысы

Многочисленные исследования показали, что питание является одним из основных факторов регуляции качественного и количественного состава микробиома кишечника, иммунного статуса и, следовательно, метаболизма всего организма. При элиминации симбионтной флоры макроорганизм лишается ряда защитных звеньев, включая синтез витаминов, особенно группы В, незаменимых аминокислот, иммуноглобулинов, пропердина, лизоцима и т.п. [1, 2]. Симбионтная микрофлора кишечника влияет на функционирование нервной системы, так как отвечает за синтез гистамина, серотонина и короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК): пропионовой, масляной, валериановой и γ-аминомасляной [3].

Условно-патогенные микроорганизмы, такие как Bacteroides spp., слабо ферментирующие и не ферментирующие лактозу, гемолитические штаммы энтеробактерий, Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и др., способны модулировать митохондриальную активность симбионтных микроорганизмов кишечника, а также продукцию олигопептидов, которые, связываясь с G-белком (GPCR) рецепторов макрофагов и нейтрофилов, вызывают воспаление в эпителиальных клетках кишечника. В результате этого процесса образуется супероксид-ион (NOX-1), повышающий продукцию активных форм кислорода в клетках макроорганизма [4].

От состояния микробиоты кишечника зависит также иммунный статус организма. Эта связь обусловлена в значительной степени производством кишечной микрофлорой КЦЖК. 3 наиболее распространенные КЦЖК: уксусная, пропионовая и масляная - обычно обнаруживаются в фекалиях в молярных соотношениях от 3:1:1 до 10:2:1. Известно, что рост концентрации ацетил-КоА наблюдается на фоне увеличения концентрации уксусной кислоты. Таким образом, избыточная продукция уксусной кислоты кишечной микрофлорой может играть значимую роль в энергетическом и кислотном балансе макроорганизма. Кроме того, уксусная кислота является незаменимым метаболитом для роста микроорганизмов кишечника [4]. Масляная кислота - ключевой источник энергии для колоноцитов человека. Она предупреждает малигнизацию клеток благодаря своей способности индуцировать апоптоз онкоклеток в толстой кишке и регуляции экспрессии генов макроорганизма путем ингибирования деацетилаз гистонов. Есть также доказательства того, что масляная кислота может активировать глюконеогенез у микроорганизмов посредством цАМФ-зависимого механизма и, таким образом, благотворно воздействовать на метаболизм углеводов и энергетический обмен. Пропионовая кислота также играет значимую роль в глюконеогенезе и формировании энергетического баланса, взаимодействуя с рецепторами кишечника (связанные с G-белком рецепторы), известными как рецепторы жирных кислот FFAR2 и FFAR3. Пропионовая кислота участвует в передаче сигнала о насыщении. Рост содержания уксусной, пропионовой, изовалериановой и изомасляной кислот в содержимом кишечника характерен для развития воспалительных процессов [1].

При нормобиоценозе в желудочно-кишечном тракте преобладают продуценты масляной кислоты, принадлежащие к филуму Firmicutes. Пропионовая кислота продуцируется микроорганизмами, принадлежащими к родам Bacteroides и Negativicutes, а также некоторыми видами бактерий рода Clostridium. Вместе с тем ряд микроорганизмов под влиянием различных факторов среды может изменять метаболическую активность и продуцировать разные КЦЖК, что, несомненно, отражается на иммунном статусе и, следовательно, на метаболических процессах организма [5-8].

К таким факторам могут быть отнесены и ферментные препараты (ФП), используемые в пищевой промышленности в качестве технологических вспомогательных средств. Известно, что при остаточной активности ФП в пищевом продукте или в случае их недостаточной очистки они могут оказывать негативное действие на макроорганизм вследствие присутствия в ФП живых клеток и/или ДНК, РНК штаммов-продуцентов или нежелательных метаболитов. Наблюдаемый значительный рост объема производства пищевой продукции с использованием ФП, получаемых при помощи микробного синтеза, значимым образом повышает риски их неконтролируемого применения в пищевой промышленности. В настоящее время оценка рисков ФП является важнейшей задачей также потому, что более чем в 90% случаев они производятся с использованием мутантных и генетически модифицированных микроорганизмов. Изменение последовательности нуклеотидов ДНК микроорганизмов - продуцентов ФП может способствовать увеличению их вирулентности, патогенности, аллергенности, токсигенности, способности к продукции антибиотиков и других метаболитов [9, 10].

Целью исследования была оценка влияния ФП: комплекса гидролаз протеолитического и нуклеазного действия из мутантного штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134 (ФП1) и нейтральной протеазы - бациллолизина и сериновой протеазы из мутантного штамма Bacillus subtilis-96 (ВКМ В-3499D) (ФП2) - на микробиом кишечника, показатели клеточного иммунитета и метаболизм подопытных животных.

Материал и методы

Получение штаммов, наработка экспериментальных партий и анализ ферментативной активности ФП1 и ФП2 проведены в ВНИИПБТ - филиале ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" [11-14]. В экспериментальных исследованиях были использованы крысы линии Wistar (самцы), полученные из питомника "Столбовая" ФГБУН НЦБМТФМБА России"

В эксперименте по изучению подострой токсичности ФП1 и ФП2 использовали 7 групп крыс по 10 самцов в каждой с исходной массой тела 135±10 г. После недельной адаптации крысы получали в течение последующих 30 сут полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93 в условиях неограниченного доступа и внутрижелудочно ФП в расчетных дозах 0 (контроль), 1, 10 и 100 мг на 1 кг массы тела в 0,15 М растворе NaCl в расчете на содержание сухого органического вещества (TOS). Работу с животными и выведение их из эксперимента проводили в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики, что подтверждено заключением этической комиссии ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (№ 1 от 16.01.2022) [15, 16]. Выводили животных из эксперимента на 30-е сутки, после 16-часового голодания путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией.

Состав микробиоценоза кишечника изучали путем посева (10-кратных разведений) содержимого слепой кишки, выделяемой в стерильных условиях во время выведения животных из эксперимента, на специфические дифференциально-диагностические среды. Определяли количественное содержание бифидобактерий (Bifidobacterium spp.), лактобацилл (Lactobacillus spp.), бактероидов (Bacteroides spp.), общее содержание анаэробных микроорганизмов (ОМЧ анаэробов), процент содержания гемолитических анаэробных микроорганизмов (ОМЧ гемолитических анаэробов) и аэробных микроорганизмов (ОМЧ гемолитических аэробов), общее содержание аэробных микроорганизмов (ОМЧ аэробов), энтеробактерий (Enterobacteriaceae spp.), энтерококков (Enterococcus spp.), стафилококков (Staphylococcus spp.). Инкубирование анаэробных микроорганизмов осуществляли с использованием пакетов для химического связывания кислорода Oxoid™ AnaeroGen™ (Thermo Scientific, США). Идентификацию микроорганизмов проводили путем изучения морфологии колоний, микроскопии мазков и определения биохимических свойств. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов, выросших на питательных средах, выражали в lg КОЕ/г в массе содержимого слепой кишки.

Экспрессию рецепторов Т- и В-лимфоцитов (Лф), NK-клеток (CD45RА⁺, CD3⁺, CD161⁺, CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺) периферической крови крыс определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: APC, FITC, РЕ (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Количество Т- и В-Лф и NK-клеток выражали в процентах от общего числа проанализированных клеток; содержание CD3⁺CD4⁺ (Т-хелперов) и CD3⁺CD8⁺ (Т-цитотоксических Лф) - в процентах от общего числа CD3⁺-клеток. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) определяли путем расчета отношения количества Лф СD4⁺/CD8⁺. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter Cytomics, США).

Содержание КЦЖК (уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой) в содержимом толстой кишки крыс анализировали путем экстракции нативных фекалий в водно-солевом растворе (к 50-100 мг образца добавляли 5 см³ солевого раствора, содержащего 882 г/л (NH₄)₂SO₄ и 238 г/л NaH₂PO₄, рН 1,6, с учетом того, что образцы до исследований хранились при температуре -80 °С в течение 2 нед). Содержимое толстой кишки крыс собирали в стерильные пробирки с утра до выведения животных из эксперимента. Содержание КЦЖК определяли методом высокоэффективной газовой хроматографии на хроматографе Agilent 8890 (Agilent, США) с пламенно-ионизационным детектором и парофазным пробоотборником 7697 А. Идентификацию КЦЖК проводили исходя из времени удерживания стандартных образцов соединений [17].

Статистическую обработку проводили с помощью пакета SPSS 18.0 и программы Excel. Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки, корреляции между полученными значениями. Достоверность различия количественных показателей оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни и/или t-теста Стьюдента, долевых показателей - с использованием точного U-критерия Фишера и многомерного критерия c² Пирсона. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Влияние на состояние микробиоценоза кишечника крыс

Комплекс гидролаз протеолитического и нуклеазного действия из мутантного штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134 и ФП2 оказывал значимое влияние на состояние микробиоценоза кишечника крыс (рис. 1, 2).

Воздействие ФП1 в различных дозах обусловливало незначительное повышение общего количества содержащихся в кишечнике анаэробных микроорганизмов, лакто- и бифидобактерий. Содержание бактероидов в 3-й группе снижалось по сравнению с контролем и средними значениями во 2-й группе (р<0,05), а в 4-й группе восстанавливалось до значений 1-й группы (контроль) (см. рис. 1).

Введение ФП2 стало причиной небольшого роста содержания лактобактерий во всех опытных группах (контроль - lg7,76±1,65 КОЕ/г, 2-4-я группы - lg8,50±0,78, lg8,28±1,17 и lg8,67±1,02 КОЕ/г соответственно, р<0,05). Отмечено статистически значимое (р<0,05) дозозависимое повышение количества бифидобактерий при введении ФП2 с lg7,71±0,61 КОЕ/г при минимальной дозе (1 мг на 1 кг массы тела в сутки, 5-я группа) до lg8,83±0,89 КОЕ/г при дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки (7-я группа). Введение ФП2 не вызывало значимых изменений в общем количестве выделяемых анаэробов и бактероидов (см. рис. 1).

При введении минимальной дозы ФП1 наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение (по сравнению с контролем) содержания в слепой кишке всех групп условно-патогенных микроорганизмов, за исключением Enterococcus spp. Повышение дозы вводимого ФП1 сопровождалось достоверным (р<0,05) снижением содержания в слепой кишке всех групп условно-патогенных микроорганизмов. ФП2 при внутрижелудочном поступлении вызывал разнонаправленные изменения в количественном содержании условно-патогенных микроорганизмов, за исключением незначимого роста количества Enterococcus spp. до уровня, не достигающего контроля, и статистически значимого увеличения количества плесеней (p<0,05) (рис. 2). ОМЧ аэробов в содержимом слепой кишки у животных 2, 3 и 4-й опытных групп изменялось разнонаправленно по сравнению с контролем, а в 5-7-й группах увеличивалось (см. рис. 2).

Введение ФП1 в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки приводило к снижению процентного содержания гемолизирующих эритроциты микроорганизмов с 53,0% (в контрольной группе) до 48,7% (во 2-й группе) и 40,3% (в 3-й группе). Однако при введении ФП1 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки (4-я группа) количество гемолизирующих колоний возрастало (р<0,05) до 70,0% от числа колоний, выросших на кровяном агаре. Это свидетельствует о повышении патогенности аэробной флоры кишечника при воздействии ФП1 в высокой дозе.

Содержание энтерококков при введении ФП2 было ниже, чем в контрольной группе, но значимым образом не изменялось по мере увеличения дозы фермента. Количество колоний энтеробактерий, стафилококков и дрожжеподобных грибов менялось разнонаправленно, снижаясь при его введении в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки, повышаясь в группе животных, получавших ФП2 в дозе 10 мг на 1 кг массы тела в сутки, и снова снижаясь в группе получавших этот фермент в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки. На фоне введения этого фермента наблюдалось статистически значимое (р<0,05) увеличение содержания гемолитических штаммов микроорганизмов в 5-й группе - 77,2% (против 53,0% в контроле). Далее, по мере увеличения вводимой дозы этого фермента, наблюдалось снижение процентного содержания в содержимом слепой кишки гемолитических штаммов микроорганизмов до 74,1% (6-я группа) и 61,7% (7-я группа) (р<0,05). Таким образом, ФП2 в высоких концентрациях способствует подавлению роста гемолитических микроорганизмов в составе микробиоценоза кишечника (см. рис. 2). В целом можно предположить, что ФП1 и ФП2 содержат в составе антибиотические вещества, подавляющие рост как грамнегативных, так и грампозитивных микроорганизмов.

Влияние на состояние клеточного иммунитета животных

Введение ФП1 вызвало изменения в субпопуляционном составе Лф и NK-клеток. Об этом свидетельствует незначимое повышение во 2-й группе и статистически значимое снижение процентного содержания в периферической крови цитотоксических Т-Лф (CD3⁺CD8⁺) у животных 3-й и 4-й групп (р<0,05). Содержание Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺), наоборот, в крови у крыс из 3-й и 4-й групп немного превышало контрольные значения (р<0,05). Количество NK-клеток с фенотипом (CD161⁺) при введении различных доз ФП1 более чем в 2 раза превышало контрольные значения (2, 3, 4-я группы, р<0,05), но не имело дозозависимого характера (рис. 3). ИРИ (СD4⁺/CD8⁺) увеличивался дозозависимо при введении ФП1 с 1,76 до 2,56 против 1,92 (р<0,05) в контрольной группе.

При введении ФП2 у крыс из 5-й группы при минимальной дозировке ФП2 наблюдалось незначимое повышение, а у крыс других групп - снижение количества Т-цитотоксических Лф (CD3⁺CD8⁺) до 25,0% от общего содержания проанализированных клеток в 7-й группе против 32,9% у животных контрольной группы (p<0,05). Содержание Т-Лф (CD3⁺) не претерпело значимых изменений при введении всех доз ФП2. Содержание NK-клеток (CD161⁺) превышало значения у крыс контрольной группы при введении ФП2 вне зависимости от его дозы. Количество Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) повышалось с 60,8% при введении ФП2 в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки до 72,2% при введении в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки (р<0,05), что свидетельствует о значимых изменениях показателей клеточного иммунитета при увеличении дозы ФП2 (см. рис. 3). ИРИ (СD4⁺/CD8⁺), составив 1,83 в 5-й группе, увеличивался дозозависимо до 2,28 (6-я группа) и 2,94 при максимальной дозе ФП2, превысив показатель животных контрольной группы - 1,92 (р<0,05). Таким образом, полученные значения показателя ИРИ свидетельствуют о том, что внутрижелудочное введение ФП1 и ФП2 вызывает воспалительный процесс, что подтверждается полученными сведениями о качественном и количественном составе микробиоценоза слепой кишки.

Изучение содержания короткоцепочечных жирных кислот в содержимом толстой кишки

Количественное содержание всех определяемых КЦЖК в содержимом толстой кишки при введении ФП1 и ФП2 статистически значимо отличалось от такового у животных контрольной группы. Во всех опытных группах в исследуемых образцах преобладала уксусная кислота (см. таблицу). Количество уксусной, пропионовой и масляной кислот при введении ФП1 увеличивалось по сравнению с контролем (р<0,05). Особенно выраженным это повышение было при введении ФП1 в дозах 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в сутки, однако введение в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки сопровождалось резким снижением концентрации этих КЦЖК в фекалиях. Содержание изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот в опытных группах (2-4-я группы) в ~2 раза превышало их количество в контроле, но не зависело значимым образом от дозы. Во всех группах животных, получавших ФП2 (5-7-я группы), наблюдалось достоверное (в ≥2 раза) повышение содержания определяемых КЦЖК. Данное изменение также не имело дозозависимого характера. Наибольшие количества жирных кислот в содержимом толстой кишки отмечены в группе, получавшей ФП2 в максимальной дозе - 100 мг на 1 кг массы тела в сутки (см. таблицу).

Расчет корреляции между содержанием отдельных групп микроорганизмов в содержимом слепой кишки и количеством КЦЖК в содержимом толстой кишки выявил различия реакции организма при введении животным ФП1 и ФП2 (рис. 4).

Установлена зависимость между определяемым количеством микроорганизмов в содержимом слепой кишки и уровнем продуцируемых ими КЦЖК. В случае с ФП1 положительная сильная корреляция отмечена между ОМЧ анаэробов и количеством изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот (r от 0,752 до 0,938, р<0,05), а также между содержанием лактобактерий и уровнем уксусной, пропионовой, изомасляной, изовалериановой и валериановой кислотами (r от 0,625 до 0,989, р<0,05) (см. рис. 4, ФП1). Увеличение концентрации гемолитических аэробных микроорганизмов и энтерококков в содержимом слепой кишки вызывало снижение продукции кишечной микробиотой КЦЖК. Высокая степень корреляции выявлена между содержанием плесневых и дрожжеподобных грибов и количеством уксусной, пропионовой и масляной кислот (r от 0,739 до 0,958), а также валериановой (r=0,475-0,611) кислоты (р<0,05). Количество энтеробактерий и стафилококков коррелировало с содержанием масляной кислоты (r=0,540, р<0,05) (см. рис. 4, ФП1).

Что касается ФП2, то как и в случае с ФП1, высокие коэффициенты корреляции были отмечены между общим количеством анаэробных микроорганизмов и содержанием КЦЖК. Также отмечалась высокая и средняя степень зависимости между содержанием в фекалиях КЦЖК и количеством лактобактерий. Введение ФП2 оказывало наиболее значимое влияние на общее количество аэробных микроорганизмов в содержимом кишечника (r от 0,878 до 0,996) и плесневых грибов (r от 0,776 до 0,973) (р<0,05) и, следовательно, на продукцию КЦЖК. Корреляция между количеством высеваемых гемолитических штаммов аэробных микроорганизмов и количеством КЦЖК была менее выраженной, но достаточно значимой. Она была обратной и составила в отношении пропионовой кислоты r=-0,696, для изомасляной кислоты r=-0,672, для изовалериановой кислоты r=-0,692 (р<0,05) (см. рис. 4, ФП2).

На фоне введения ФП1 наблюдалась прямая зависимость между количеством всех определяемых КЦЖК в содержимом толстой кишки и процентом NK-клеток в периферической крови (от r=0,802 в случае с изовалериановой кислотой до r=0,948 в случае с пропионовой кислотой, р<0,05). Обратная высокая зависимость (r>0,5, р<0,05) отмечалась в отношении определяемых количеств уксусной, пропионовой, масляной, валериановой кислот и процентом содержания Т-Лф (CD3⁺) в периферической крови, а также между количеством изомасляной, изовалериановой, валериановой кислоты и содержанием В-Лф (CD45RA⁺) (рис. 5, ФП1). ИРИ (CD4/CD8) у крыс, получавших ФП1, не зависел значимым образом от синтеза КЦЖК(r от -0,082 до 0,441).

При введении ФП2 наблюдалась отрицательная зависимость между содержанием В-Лф (CD45RA⁺) и всеми КЦЖК (r от -0,943 до -0,699), а также между процентом содержания в крови T-цитотоксических Лф (CD3⁺CD8⁺) и всеми видами определяемых жирных кислот (r от -0,778 до -0,415) (р<0,05) (см. рис. 5, ФП2). ИРИ (CD4/CD8) имел высокую степень корреляции с количеством различных КЦЖК (r от 0,592 до 0,889, р<0,05).

Обсуждение

Анализ возможного использования изучаемых ФП в пищевой промышленности в подостром эксперименте показал, что оба фермента оказывали выраженное действие на количественный и качественный состав микробиоценоза слепой кишки и иммунный статус крыс. Их введение в желудочно-кишечный тракт оказывало слабовыраженное пробиотическое действие на подопытных животных, что определялось достоверным увеличением количества бифидобактерий и недостоверным ростом высеваемых из содержимого слепой кишки лактобактерий.

ФП1, производимый с использованием мутантного штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134, значительно подавлял рост условно-патогенных микроорганизмов и вызывал увеличение содержания в содержимом слепой кишки гемолизирующих эритроциты колоний. Это свидетельствует о повышении патогенного потенциала аэробных микроорганизмов в составе микробиоценоза крыс и об активации воспалительных процессов при воздействии ФП1, а также наличии в составе фермента антибиотических веществ.

При введении ФП2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки наблюдались недостоверный рост общего количества аэробных микроорганизмов, дрожжеподобных и плесневых грибов, снижение в содержимом слепой кишки количества энтеробактерий, стафилококков (по сравнению с контролем). ФП2 в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в сутки вызывал выраженный рост процентного содержания гемолитических микроорганизмов с дальнейшим значимым снижением этого показателя при его внутрижелудочном введении в дозах 10 и 100 мг на 1 кг массы тела в сутки. Полученные данные свидетельствуют, по-видимому, о наличии в составе данного ФП2 антибиотических веществ. Однако это требует подтверждения. Вследствие развития воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте крыс данные изменения вызвали активацию клеточного иммунитета. При этом ФП1 вызывал менее выраженное, чем ФП2, влияние на содержание в слепой кишке общего количества анаэробных микроорганизмов, бифидо- и лактобактерий. Кроме того, его введение стало причиной снижения количества бактероидов в составе микробиома.

ФП1 и ФП2 различным образом действовали на количество выделяемых из содержимого толстой кишки КЦЖК. Выявлена значимая прямая зависимость между высеваемыми количествами дрожжеподобных и плесневых грибов и содержанием в содержимом кишки уксусной, пропионовой и масляной кислот (r>0,5, p<0,05). Определяемые количества этих КЦЖК находились в обратной зависимости с количеством гемолитических штаммов аэробных микроорганизмов, а изовалериановой кислоты - с количеством энтерококков.

Выявленные корреляции между содержанием различных групп микроорганизмов в слепой кишке и КЦЖК подтверждают полученные ранее данные о диагностической значимости определения количеств уксусной, пропионовой и масляной кислот в фекалиях при анализе микробиоценоза кишечника [4, 7]. Изменение продуцируемых микрофлорой кишечника количеств изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот при введении ферментных препаратов и корреляция этих значений с количеством различных групп микроорганизмов свидетельствует об участии этих КЦЖК в индукции воспалительного процесса у подопытных животных.

Введение ФП1 и ФП2 крысам вызывало рост процентного содержания в периферической крови NK-клеток с фенотипом (CD161⁺) (p<0,05). Расчетные значения показателя ИРИ с большой степенью вероятности свидетельствуют о том, что внутрижелудочное введение ФП1 и ФП2 вызывало воспаление у подопытных животных.

Наибольшая прямая зависимость отмечалась между содержанием в крови NK-клеток с фенотипом (CD161⁺) и всеми определяемыми КЦЖК. Высокая степень обратной корреляции выявлена между количеством содержащихся в крови Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) и КЦЖК [за исключением соотношения (CD3⁺CD4⁺)/масляная кислота при введении ФП1], а также процентом Т-цитотоксических Лф (CD3⁺CD8⁺) и уровнем КЦЖК при введении ФП2. Значимые корреляции между содержанием в крови крыс Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺), процентным содержанием в крови цитотоксических Лф (CD3⁺CD8⁺) и уровнем КЦЖК при введении ФП1 не выявлены (r от -0,275 до 0,141). На фоне введения ФП2, напротив, отмечена высокая степень (р<0,05) прямой зависимости для CD3⁺CD4⁺ (r от 0,489 в случае с уксусной кислотой до 0,819 в случае с пропионовой кислотой) и обратной зависимости для CD3⁺CD8⁺ (от -0,415 до -0,779).

Различия в степени корреляции между спектром продуцируемых микрофлорой кишечника КЦЖК, количеством КЦЖК и процентным содержанием в периферической крови Т- и В-Лф свидетельствуют о разных механизмах влияния ФП1 и ФП2 на изученные показатели иммунитета.

Заключение

В подостром эксперименте на крысах линии Wistar показано выраженное негативное влияние комплекса гидролаз протеолитического и нуклеазного действия из мутантного штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134 (ФП1) и нейтральной протеазы - бациллолизина и сериновой протеазы из мутантного штамма Bacillus subtilis-96 (ВКМ В-3499D) (ФП2) на количественный и качественный состав аэробов и условно-патогенных микроорганизмов в содержимом слепой кишки. Выявленная разница в количественном и качественном составе микрофлоры кишечника, продуцируемых микрофлорой КЦЖК при введении различных доз ФП1 и ФП2, обусловила различия показателей клеточного иммунитета у подопытных животных. Полученные данные свидетельствуют об индукции в организме воспалительных процессов при введении как ФП1, так и ФП2.

Особенности влияния ФП1 и ФП2 на количественное содержание КЦЖК в содержимом толстой кишки и показатели клеточного иммунитета подопытных животных, на наш взгляд, обусловлены различным спектром продуцируемых микрофлорой кишечника и штаммами Aspergillus oryzae RCAM 01134 и Bacillus subtilis-96 (ВКМ В-3499D) метаболитов. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке рисков пищевой продукции, получаемой при помощи микробного синтеза.

Литература

1. Mohajeri M.H., Brummer R.J.M., Rastall R.A., Weersma R.K., Harmsen H.J.M. et al. The role of the microbiome for human health: from basic science to clinical applications // Eur. J. Nutr. 2018. Vol. 57, suppl. 1. S1-S14. DOI: https://doi.org/10.1007/s00394-018-1703-4

2. Шевелева С.А., Куваева И.Б., Ефимочкина Н.Р., Маркова Ю.М., Просянников М.Ю. Микробиом кишечника: от эталона нормы к патологии // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 4. С. 35-51. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10040

3. Hou K., Wu Z.X., Chen X.Y., Wang J.Q., Zhang D. et al. Microbiota in health and diseases // Signal Transduct. Target. Ther. 2022. Vol. 7, N 1. P. 135; DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-022-00974-4

4. Kotlyarov S. Role of short-chain fatty acids produced by gut microbiota in innate lung immunity and pathogenesis of the heterogeneous course of chronic obstructive pulmonary disease // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, N 9. P. 4768. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23094768

5. Scheithauer T.P.M, Rampanelli E., Nieuwdorp M., Vallance B.A., Verchere C.B., van Raalte D.H. et al. Gut microbiota as a trigger for metabolic inflammation in obesity and type 2 diabetes // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. Article ID 571731. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.571731

6. Mills S., Lane J.A., Smith G.J., Grimaldi K.A., Ross R.P., Stanton C. Precision nutrition and the microbiome. Part II: potential opportunities and pathways to commercialisation // Nutrients. 2019. Vol. 11, N 7. P. 1468. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11071468

7. Маркова Ю.М., Сидорова Ю.С. Зерновые продукты из амаранта, киноа и гречихи: роль в питании человека и поддержании кишечного микробиома // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 17-29. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-17-29

8. Ciani M., Lippolis A., Fava F., Rodolfi L., Niccolai A., Tredici M.R. Microbes: food for the future // Foods. 2021. Vol. 10. P. 971. DOI: https://doi.org/10.3390/foods10050971

9. Багрянцева О.В. Обоснование необходимости разработки мероприятий по управлению рисками, связанными с использованием пищевой продукции, производимой при помощи микробного синтеза // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 2. С. 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017

10. Серба Е.М., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Соколова Е.Н., Погоржельская Н.С. и др. Мицелиальные грибы - перспективный источник гидролаз и ценных биополимеров // Вестник Российской сельскохозяйственной науки. 2016. № 4. С. 41-43.

11. Серба Е.М., Мочалина П.Ю., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Шелехова Н.В. и др. Исследование ионного состава биомассы Аspergillus oryzae - продуцента гидролитических ферментов // Микология и фитопатология. 2019. № 2. С. 95-100. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026364819020090

12. Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Цурикова Н.В., Минеева Д.Т., Бобровенко Е.Ю. Получение нового штамма Bacillus subtilis-96 - продуцента протеолитических ферментов для пищевой промышленности // Пищевая промышленность. 2021. № 9. С. 35-36. DOI: https://doi.org/10.52653/PPI.2021.9.9.012

13. Костылева Е.В., Середа А.С., Великорецкая И.А., Минеева Д.Т., Цурикова Н.В. Эффективность ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Bacillus subtilis-96 при гидролизе белков молочной сыворотки и яичного белка // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 2 (540). С. 72-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-2-72-80

14. Park E.J., Khaliullin T.O., Shurin M.R., Kisin E.R., Yanamala N., Fadeel B. et al. Fibrous nanocellulose, crystalline nanocellulose, carbon nanotubes, and crocidolite asbestos elicit disparate immune responses upon pharyngeal aspiration in mice // J. Immunotoxicol. 2018. Vol. 15, N 1. P. 12-23. DOI: https://doi.org/10.1080/1547691X.2017.1414339

15. Yanamala N., Farcas M.T., Hatfield M.K., Kisin E.R., Kagan V.E., Geraci C.L. et al. In vivo evaluation of the pulmonary toxicity of cellulose nanocrystals: a renewable and sustainable nanomaterial of the future // ACS Sustain. Chem. Eng. 2014. Vol. 2, N 7. P. 1691-1698. DOI: https://doi.org/10.1021/sc500153k

16. Zhang Ch., Tang P., Xu H., Weng Ya., Tang Q., Zhao H. Analysis of short-chain fatty acids in fecal samples by headspace-gas chromatography // Chromatographia. 2018. Vol. 81, N 9. P. 1317-1323. DOI: https://doi.org/10.1007/s10337-018-3572-7

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.