Способность адгезивно-инвазивной Escherichia coli от пациента с болезнью Крона колонизировать и вызывать воспаление в кишечнике мышей

Трусов Никита Вячеславович; Побегуц Ольга Владимировна; Галямина Мария Алексеевна; Смирнов Игорь Павлович; Силаков Николай Максимович; Никитин Николай Сергеевич; Иванов Виктор Алексеевич; Тимонин Андрей Николаевич; Балакина Анастасия Станиславовна; Михайлычева Мария Валерьевна; Уразаева Диана Рафаилевна; Еремеев Артем Валерьевич; Горбачев Алексей Юрьевич; Кравченко Лидия Васильевна; Тутельян Виктор Александрович

Резюме

В настоящее время активно изучается роль кишечной микробиоты в возникновении и/или поддержании воспаления кишечника при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), в частности у пациентов с болезнью Крона (БК).

Цель работы - подбор оптимальных условий для моделирования воспаления кишечника, вызванного изолятом Escherichia coli, полученным от пациента с БК, и обладающего адгезивно-инвазивным фенотипом (АИЕС) в эксперименте in vivo.

Материал и методы. Исследование проведено с использованием 3 групп по 6 мышей-самцов C57Black/6 в каждой: 1-я группа - контроль-вода, 2-я - контроль-пропионат, 3-я - BL2K2-пропионат. После 8 дней карантина мыши 2-й и 3-й групп вместо воды получали 20 мМ раствор пропионата натрия. На 4-й день, за 24 ч до введения штамма всем мышам внутрижелудочно вводили 20 мг стрептомицина в 100 мкл фосфатного буфера. На следующий день мышам 3-й группы внутрижелудочно был введен изолят АИЕС BL2K2, полученный от пациента с БК (БК-изолят), в 100 мкл фосфатного буфера, а контрольным мышам (1-я и 2-я группы) - фосфатный буфер. Через 21, 28 и 35 сут после введения штамма проведен сбор материала: кровь и 3 отдела кишечника (тонкая, слепая и толстая кишка). Из отделов кишечника были получены лизаты, часть из них была использована для посевов на селективную среду для E. coli, получения отдельных колоний с их последующим полногеномным секвенированием для доказательства колонизации BL2K2 разных отделов кишечника. Другая часть использована для определения содержания цитокинов методом иммуноферментного анализа и для протеомного анализа.

Результаты. Показано, что БК-изолят успешно колонизировал кишечник мышей в условиях эксперимента. Колонизация, сохраняющаяся в течение 35 дней, приводила к заметным изменениям в тканях толстой, тонкой и слепой кишки. Обнаружен повышенный уровень цитокинов фактора некроза опухоли α и интерлейкина 6 в лизатах толстой кишки. Сравнительный протеомный анализ ткани толстой кишки показал, что колонизация БК-изолята вызывает активацию процессов, связанных с ответом на бактериальную инфекцию (вырос уровень иммуноглобулинов, активаторов Т-клеточного ответа, рецептора бактериального компонента пилей I типа FimH, секретируемых лектинов, TLR-опосредованных регуляторов, белков, обладающих бактерицидными свойствами), а также активацию процессов, связанных с накоплением внеклеточного матрикса, приводящего к фиброзу, что является одним из признаков воспалительного процесса (повысился уровень коллагенов, регуляторов сборки коллагеновых фибрилл, интегринов и при этом снизился уровень белков, участвующих в деградации внеклеточного матрикса). Колонизация БК-изолята приводила к изменению липидного обмена и снижению энергетического метаболизма в клетках ткани толстой кишки.

Заключение. Разработана модельная система для более глубокого изучения участия АИЕС в инициировании и поддержании воспаления кишечника, что позволит подробнее изучить роль АИЕС в данном процессе.

Ключевые слова: болезнь Крона; адгезивно-инвазивные Escherichia coli; АИЕС; мышиные модели; толстая кишка; цитокины; протеомный анализ

Болезнь Крона (БК), впервые описанная в 1932 г. доктором Б.Б. Кроном [1], представляет собой тяжелое хроническое иммуноопосредованное гранулематозное воспалительное заболевание желудочно-кишечного тракта, с преимущественной локализацией в терминальном отделе подвздошной и толстой кишки. БК - многофакторное заболевание, причинами которого, как полагают, являются генетическая восприимчивость организма хозяина, факторы окружающей среды, состав кишечной микробиоты и иммуноопосредованное повреждение кишечника. Механизмы и причины возникновения и протекания этой болезни интенсивно исследуются в настоящее время, однако до сих пор не ясен механизм манифестации. Было показано, что несколько генетических полиморфизмов повышают риск развития БК. Среди них 3 полиморфизма в гене NOD2, который отвечает за внутриклеточное распознавание бактериального мурамилдипептида [2], а также мутации в генах ATG16L1 и IRGM, участвующих в процессе аутофагии, необходимой для элиминации внутриклеточных бактерий [3]. Однако исследования на монозиготных близнецах доказали, что БК не является генетическим заболеванием [4], что указывает на участие других факторов в его этиологии. В настоящее время активно изучают роль состава кишечной микробиоты в качестве причины или поддержания воспаления кишечника при БК. Обнаружено, что одной из особенностей у пациентов с БК является снижение разнообразия кишечной микрофлоры: уменьшение представительства полезных бактерий, таких как бактерии типа Firmicutes, и увеличение содержания Bacteroidetes и Proteobacteria [5]. Было показано, что процентное содержание Escherichia coli от общего количества бактерий в слизистой оболочке у пациентов с БК существенно повышено по сравнению со здоровыми людьми (0-19%) и достигает 62% [6-8]. Оказалось, что E. coli у пациентов с БК способны успешно проникать через муциновый слой, преодолевать эпителиальный барьер, а также выживать и размножаться внутри макрофагов, несмотря на низкий уровень рН, окислительный стресс, протеолитические ферменты и антимикробные соединения, обусловливающих защитные свойства клеток врожденного иммунитета [6, 9]. Бактерии, обладающие такими свойствами, были отнесены А. Darfeuille-Michaud и соавт. к особой группе адгезивно-инвазивных E. coli (АИЕС). Вероятность выделения этих бактерий у пациентов с БК примерно в 6 раз выше, чем у здоровых людей, что сразу предположило определенную роль АИЕС в развитии заболевания [6, 10]. Показано, что АИЕС не обладают ни одной из известных генетических инвазивных детерминант, характерных для энтероинвазивных, энтеропатогенных или энтеротоксигенных E. coli или Shigella flexneri (например, ген плазмиды ipaC, кодирующий инвазин, или ген, кодирующий интимин энтеропатогенной E. coli). Активность АИЕС сопровождается высвобождением провоспалительных цитокинов [11], т.е., выживая и размножаясь внутри макрофагов, они усугубляют воспалительный процесс, увеличивая количество клеток врожденного иммунитета, используемых ими для дальнейшего проникновения и размножения. Поскольку АИЕС способствуют развитию воспалительного процесса, а также используют генетические особенности хозяина и преимущества окружающей среды, исследователи отнесли эту группу бактерий к патобионтам [12].

Для изучения взаимодействия АИЕС с организмом хозяина используют мышиные модели. Долгое время не удавалось добиться колонизации АИЕС в кишечнике мышей. В связи с этим в основном использовали мышей, предварительно получавших декстрансульфат натрия (DSS), индуцирующий колит, или трансгенные линии мышей, адаптированные для колонизации АИЕС. Известно, что АИЕС связывается с эпителиальной клеткой через взаимодействие компонента пилей 1 типа белка FimH с молекулой клеточной адгезии, связанной с карциноэмбриональным антигеном 6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6, CEACAM6), аномально экспрессирующейся у пациентов с БК [13]. В связи с этим была создана линия мышей, экспрессирующих человеческие CEACAM, для успешной колонизации АИЕС. Инфекция АИЕС при этом не носит хронический характер и приводит к гибели животных уже на 7-й день после инфицирования. Однако в 2013 г. C. Small и соавт. все же удалось добиться колонизации неадаптированных линий мышей [14]. Никто не мог повторить этот успех. И только спустя 7 лет в 2020 г. английскому ученому M. Ormsby и соавт. удалось колонизировать обычных мышей эталонным штаммом АИЕС LF-82 и добиться хронической инфекции. Они показали, что для этого достаточно предварительно вводить мышам с питьевой водой пропионат натрия, который, как было показано, индуцирует вирулентные свойства АИЕС [15]. В России пока не удалось создать подобную модель хронической инфекции АИЕС на мышах.

Цель данной работы - подбор оптимальных условий для получения такой модели, приводящей не только к длительной колонизации АИЕС, но и к хроническому воспалению кишечника.

Материал и методы

Дизайн эксперимента

Эксперимент по моделированию хронических заболеваний кишечника проводили на половозрелых мышах-самцах C57BL6 возрастом 7-8 нед, полученных из питомника филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследование получило одобрение Этического комитета ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (заседание № 11 от 15.12.2021) и проводилось в соответствии с рекомендациями ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами". Животные находились по 1 особи в пластиковых клетках на подстилке из древесных стружек при естественном освещении.

Общая продолжительность эксперимента составила 47 дней. После 8 дней карантина мыши были разделены на 3 группы по 6 мышей в каждой: 1-я группа - контроль-вода, 2-я группа - контроль-пропионат, 3-я группа - BL2K2-пропионат. Весь экспериментальный период мыши получали полусинтетический рацион для взрослых животных в количестве 5 г/сут сухого корма. После 8 дней карантина мыши 2-й и 3-й групп получали вместо питьевой воды в течение 3 дней 20 мМ раствор пропионата натрия. На следующий день, за 24 ч до введения штамма всем мышам было введено внутрижелудочно 20 мг стрептомицина в 100 мкл фосфатного буфера. После этого на следующий день опытным мышам (3-я группа) внутрижелудочно был введен изолят АИЕС E. coli BL2K2, полученный от пациента с БК, в 100 мкл фосфатного буфера, а контрольным мышам (1-я и 2-я группы) - фосфатный буфер. В течение всего последующего экспериментального периода мыши 1-й группы пили воду, а мыши 2-й и 3-й групп - 20 мМ раствор пропионата натрия ad libitum. Мышей выводили из эксперимента по 2 животных через 21, 28 и 35 дней после введения штамма, проведен сбор материала: кровь и 3 отдела кишечника (тонкая, слепая и толстая кишка).

Бактериальные и клеточные культуры

Изолят E. coli BL2K2 из собственной коллекции штаммов лаборатории протеомного анализа ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России получен путем эндоскопической операции у больного БК в ГБУЗ МКНЦ имени А.С. Логинова ДЗМ. Отбор проб проведен в соответствии с требованиями местного этического комитета на основании информированного согласия пациента. Лабораторный штамм К-12 MG1655 и изолят BL2K2 культивировали на среде LB (Lysogeny broth) и на минимальной среде М9 с добавлением 20 мМ пропионата натрия (PA) при 37 °C и 180 об/мин. Линию клеток Caco-2 культивировали в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37 °С и 5% CO₂. Линию клеток THP-1 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37 °С и 5% CO₂. Макрофаги дифференцировали по стандартному 72-часовому протоколу с использованием 200 нМ 13-форбол-12-миристата ацетата [16].

Анализ адгезивных и инвазивных свойств Escherichia coli

Анализ адгезивно-инвазивного потенциала проводили на клетках Caco-2, как описано ранее [17], с некоторыми модификациями. Слой клеток Caco-2 инфицировали изолятом BL2K2 в соотношении 1:10. Перед инфицированием клетки E. coli разводили стерильным фосфатным буфером, рН 7,4 (PBS) до значения оптической плотности при λ=600 (OD₆₀₀) 0,1, центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин, промывали стерильным PBS и ресуспендировали в 1 мл DMEM. Инфицированные клетки инкубировали в течение 3 ч при 37 °С и 5% CO₂. После инкубации часть лунок дважды промывали PBS для удаления неприкрепившихся бактерий. Затем в лунки добавляли 0,5 мл 0,5% Тритона Х-100 в PBS и инкубировали 5 мин. Лизат собирали в 0,5 мл LB. Эти образцы содержали клетки, которые были прикреплены к клеткам Caco-2 и/ или проникли внутрь. Остальные лунки инкубировали еще 2 ч. После этого среду удаляли и добавляли по 1 мл свежей среды DMEM, содержащей 300 мкг/мл гентамицина. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO₂. После этого лунки промывали PBS, клетки Caco-2 лизировали Тритоном X-100, как описано выше. В лизате содержались только те клетки E. coli, которые проникли внутрь эукариотических клеток. Лизаты Caco-2 высевали на твердый агар с LB и культивировали в течение ночи при 37 °С. Затем подсчитывали количество КОЕ и определяли значения процента адгезии-инвазии и инвазии по сравнению с исходным инокулятом. Анализ проведен в 3 биологических повторах.

Анализ выживаемости в макрофагах

Выживаемость лабораторного штамма K-12 MG1655 и изолята BL2K2 оценивали, как описано ранее [18], с некоторыми модификациями. Макрофаги клеточной линии THP-1 инфицировали E. coli в соотношении 1:100. Клетки E. coli отмывали от среды и ресуспендировали в среде RPMI 1640. В каждую лунку добавляли по 1 мл суспензии. Планшеты центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO₂ для обеспечения интернализации. Монослои клеток дважды промывали PBS для удаления внеклеточных бактерий и обрабатывали средой RPMI, содержащей 300 мкг/мл гентамицина, в течение 1 ч, чтобы убить неинтернализированные бактерии. Впоследствии часть лунок дважды промывали стерильным PBS и лизировали добавлением деионизованной воды с 0,5% (объем/объем) Тритона Х-100 в течение 5 мин для высвобождения интернализованных бактерий. Чтобы точно получить титр бактерий, клеточные лизаты серийно разводили, 50 мкл каждого разведения высевали на твердый агар с LB, инкубировали при 37 °C в течение ночи и определяли КОЕ. Таким образом, было определено количество интернализованных бактерий через 1 ч после заражения. Остальные лунки инкубировали в течение 24 ч. После инкубации их дважды промывали стерильным PBS и лизировали в деионизованной воде, содержащей 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин для высвобождения бактерий, переживших инкубацию и оставшихся в макрофагах. Серии разведений лизатов высевали на твердый агар LB и инкубировали при 37 °С в течение ночи. Количество КОЕ подсчитывали. Таким образом, оценивали количество бактерий, выживших в течение 24 ч инкубации в макрофагах. Анализ проведен в 6 биологических повторах.

Гистологический анализ тканей кишечника

В ходе проведения некропсии лабораторных животных были выделены образцы тонкой, слепой и толстой кишки. Образцы фиксировали 10% забуференным формалином не менее 48 ч. Гистологическую проводку осуществляли с применением восходящих концентраций изопропилового спирта. Заливку образцов проводили таким образом, чтобы плоскость среза проходила поперек продольной оси кишечника. Срезы толщиной 3,5 мкм наносили на заряженные стекла и сушили в вертикальном положении при температуре +40 °С не менее 24 ч. Окрашивание производили гематоксилином-эозином. С целью визуализации бокаловидных клеток проводили дополнительное окрашивание альциановым синим с контрастированием ядер гематоксилином Майера. После заключения под покровное стекло образцы оценивали с помощью световой микроскопии. Изображения получали при помощи программно-аппаратного комплекса ADF 8 Pro (ADF OPTICS CO, Китай).

Получение триптических гидролизатов ткани кишечника

Кусочки ткани массой 90 мг гомогенизировали в гомогенизаторе стекло/стекло в 600 мкл 100 мМ трис-HCl (pH 8,5) в ледяной бане. Из них брали 400 мкл для протеомного анализа, а 200 мкл - для анализа цитокинов. К 400 мкл лизата добавляли 40 мкл 10% дезоксихолата натрия (DCNa) и смесь ингибиторов протеаз (Promega). Образцы обрабатывали ультразвуком при 4 °C в течение 6 раундов по 30 с. Образцы центрифугировали при 14 000 g при 4 °C в течение 10 мин для удаления дебриса. Белки в образцах переосаждали с помощью хлороформ-метанола. Белковый осадок ресуспендировали в 100 мкл 50 мМ буфера трис-HCl (pH 8,5) и измеряли концентрацию белка с помощью набора для анализа Assay BCA (Sigma). Дисульфидные связи восстанавливали путем добавления гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) (Sigma) до конечной концентрации 5 мМ, а алкилирование связей S-S проводили добавлением хлорацетамида (Sigma) до конечной концентрации 30 мМ и инкубации при 80 °C в течение 10 мин. Трипсин (Trypsin Gold, Promega) добавляли к образцу в соотношении трипсин : белок 1:100 (w/w), после чего инкубировали при 37 °C в течение 3 ч. Затем трипсин снова добавляли к образцу в том же соотношении и инкубировали при 37 °C в течение еще 16 ч. Для остановки трипсинолиза добавляли трифторуксусную кислоту (TFA, Sigma) до конечной концентрации 0,5% (значение pH должно быть менее 2,0). Полученные пептидные экстракты высушивали под вакуумом на центрифужном испарителе SpeedVac (Labconco, США) и ресуспендировали в буфере, содержащем 3% ацетонитрила и 0,1% TFA. Концентрацию пептидов измеряли с помощью набора для анализа Assay BCA (Sigma).

Масс-спектрометрический анализ с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ масс-спектрометрия)

Высокоэффективную жидкостную хроматографию c масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ масс-спектрометрию) полученных пептидных экстрактов проводили с использованием масс-спектрометра Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific, США). Для ионизации использовали источник наноэлектроспрея (nano-ESI) в сочетании с высоконапорной нанопроточной хроматографией на хроматографе UHPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Изготовленная в лаборатории обращенно-фазовая колонка ID 100 мм с длиной 500 мм из плавленого кварца TSP100375 (Molex, США) была заполнена фазой Kinetex C18, 2,4 мкм (Phenomenex, США) с использованием ячейки для впрыска под давлением (Next Advance, США). Во время проведения ВЭЖХ она термостатически контролировалась при 60 °C. Образцы загружали в буфер A (0,1% муравьиной кислоты) и элюировали линейным (90 мин) градиентом от 3 до 55% буфера B (0,1% муравьиной кислоты, 80% ацетонитрила) при скорости потока 220 нл/мин. Масс-спектрометрические данные сохранялись во время автоматического переключения между сканированиями MS1 и до 12 сканирований MS/MS (метод TopN). Целевое значение автоматической регулировки усиления (AGC) для сканирования MS1 было установлено на уровне 3x10e6 в диапазоне 390-1400 m/z с максимальным временем инжекции ионов 45 мс и разрешением 60 000. Ионы-предшественники были изолированы при ширине окна 2,0 m/z, а затем фрагментированы путем высокоэнергетической диссоциации с нормализованной энергией столкновения 30 эВ. Сканирование MS/MS было сохранено с разрешением 30 000 при 400 m/z и AGC 10e5 для целевых ионов с максимальным временем инжекции ионов 50 мс. Идентификацию белков проводили против базы белков UniProt Proteome: Mus musculus (Mouse).

Определение чувствительности к антибиотикам

Для определения чувствительности изолята E. coli BL2K2 к антибиотикам 100 мкл ночной культуры BL2K2 в среде LB пересевали в 10 мл той же среды, переносили в стерильный 96-луночный планшет по 195 мкл и добавляли 5 мкл антибиотика (хлорамфеникол, тетрациклин и ампициллин) до конечной концентрации: 0,1; 0,5; 1, 5, 10, 50, 100 и 250 мкг/мл в 3 повторах. В качестве контроля использовали среду LB без добавления антибиотика. Инкубировали планшеты в течение 16 ч при 37 °С. Рост культуры оценивали по изменению OD₆₀₀.

Определение способности формировать биопленки

Для определения плотности биопленки использовали краситель кристаллический фиолетовый. 100 мкл ночной культуры BL2K2 в среде LB пересевали в 10 мл той же среды, переносили в стерильный 96-луночный планшет по 200 мкл и культивировали в течение 24 ч при 30 °С. После этого измеряли OD₆₀₀. Затем лунки дважды промывали PBS для удаления неприкрепившихся клеток и окрашивали 0,5% раствором кристаллического фиолетового в течение 30 мин. Далее лунки промывали 5 раз дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре. В лунки добавляли 200 мкл 96% этанола и инкубировали в течение 30 мин. Образование биопленки количественно оценивали путем измерения поглощения при 550 нм (OD₅₅₀). Индекс образования биопленки рассчитывали как отношение OD₅₅₀ к OD₆₀₀.

Для измерения уровня цитокинов использовали иммуноферментные тест-системы для определения фактора некроза опухоли α (ФНОα) и интерлейкина 6 (ИЛ-6) (Вектор-Бест-Европа, Россия).

Статистический анализ

Статистическую обработку данных иммуноферментного анализа и построение графиков осуществляли в графической программе OriginPro 2021, данные представляли в виде средних значений со стандартным отклонением для троекратных измерений. Биоинформатический анализ протеомных данных проводили с помощью рабочего процесса Quantms. Использовали ветвь рабочего процесса Data-dependent acquisition, label-free quantification (DDA-LFQ): файлы сырых данных сначала конвертировали в формат mzML, затем проводили идентификацию пептидов с помощью Comet и количественное определение белков с помощью программы ProteomicsLFQ из пакета OpenMS, уровни ложных обнаружений (False discovery rate, FDR) белков оценивали с помощью метода pickedFDR, анализ дифференциальной экспрессии проводили с помощью статистического пакета MSstats.

Результаты и обсуждение

Фенотипическая характеристика изолята Escherichia coli BL2K2

В работе использовали изолят E. сoli BL2K2, полученный при эндоскопическом обследовании пациента с БК, находившегося на лечении в ГБУЗ МКНЦ имени А.С. Логинова ДЗМ. Прежде чем использовать этот изолят, был проведен анализ его фенотипических свойств (рис. 1). Показано, что он способен к адгезии к клеткам Сасо-2 (в среднем 22% прикрепившихся к эукариотическим клеткам от количества введенного инокулята (см. рис. 1А). В сравнении с лабораторным штаммом К12 MG1655, не обладающим адгезивно-инвазивным фенотипом, этот показатель в 2 раза больше. BL2K2 обладает очень высокой способностью проникать в эукариотические клетки, 2,88% клеток были способны к инвазии в клетки Сасо-2, что значительно выше показателя для лабораторного штамма (0,036%) (см. рис. 1Б). Эти данные указывают на то, что изолят BL2K2 мы можем отнести к штаммам E. coli, обладающим адгезивно-инвазивным фенотипом. Изолят BL2K2 также способен выживать в течение 24 ч в макрофагах. Количество выживших клеток составляет около 95,5% от числа интернализованных макрофагами бактерий (см. рис. 1В), тогда как для лабораторного штамма этот показатель составляет 11,4%. Поскольку мы использовали пропионат натрия в качестве индуктора вирулентности, мы также провели анализ способности выживать в макрофагах изолята BL2K2, выращенного не на богатой среде LB, а на минимальной среде М9 с добавлением пропионата в качестве источника углерода. Анализ показал, что в этом случае интернализованные бактериальные клетки полностью остаются живыми в макрофагах после суток инкубации. Способность изолята BL2K2, культивируемого на среде LB, формировать биопленки была сопоставима с лабораторным штаммом MG1655, однако присутствие пропионата вызывало значительное увеличение этой способности (см. рис. 1Г). Мы также показали, что изолят BL2K2 проявлял очень высокую степень устойчивости к хлорамфениколу, тетрациклину и ампициллину (см. рис. 1Д). Этот показатель мы использовали в дальнейшем для анализа колонизации изолята BL2K2 в ткани слепой и толстой кишки мышей. Чтобы селективно выделить изолят E. coli, который мы внесли в организм мышей, мы добавляли в агар МакКонки-ГРМ для энтеробактерий по 50 мкг/мл ампициллина и тетрациклина, поскольку при этих концентрациях антибиотика изолят BL2K2 проявляет устойчивость. Таким образом, мы показали, что наш изолят обладает способностью прикрепляться и проникать в клетки эпителия, выживать в макрофагах, формировать биопленки и проявляет устойчивость к антибиотикам. При этом пропионат способствует активации вирулентных свойств изолята BL2K2, что убедило нас использовать его для усиления колонизации в мышиной модели.

Колонизация адгезивно-инвазивными E. coli BL2K2 толстой и слепой кишки

Анализ степени колонизации изолята BL2K2 в слепой и толстой кишке мы проводили через 21, 28 и 35 сут после внутрижелудочного введения бактерии мышам (рис. 2А). Для этого делали посевы лизатов ткани слепой и толстой кишки на селективный для Enterobacteriaceae агар, куда добавляли антибиотики (50 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина). Антибиотики были добавлены для селекции штамма BL2K2, который, как показано выше, проявлял значительную устойчивость к этим концентрациям антибиотиков. Наибольшее количество бактерий было определено на 28-й день инфекции, оно составляло 1,2×10⁴ для слепой и 2,2×10⁴ для толстой кишки из расчета на 30 мг ткани. Через 21 и 35 сут инфекции количество бактериальных клеток было ниже и их больше определилось в слепой кишке по сравнению с толстой. Через 21 и 35 дней инфекции количество клеток штамма BL2K2 составляло соответственно 2,75×10³ и 1,7×10³ для слепой кишки и 4,46×10³ и 7,5×10² для толстой кишки. Мы не наблюдали колонии E. coli при посеве контрольных образцов, при этом при посеве лизатов ткани толстой и слепой кишки всех мышей, которым вводили изолят BL2K2, наблюдались колонии на агаре (см. рис. 2Б). Колонии, полученные от каждой мыши из опытных групп, были отобраны и помещены в среду LB. Из полученных культур была выделена ДНК для полногеномного секвенирования. Сравнительный анализ полученных геномных последовательностей с последовательностью генома, полученного нами ранее для изолята BL2K2, показал, что все колонии соответствовали изоляту, которым инфицировали мышей (данные не опубликованы). Таким образом, эксперименты показали хроническую и в целом стабильную колонизацию изолята BL2K2 в слепой и толстой кишке мышей, получавших стрептомицин и пропионат.

Воспаление и патология при хронической инфекции изолятом Escherichia coli BL2K2

Гистологический анализ

На рис. 3 представлены поперечные срезы кишечника различной локализации. Окрашивание проводили с помощью гематоксилина и эозина (см. рис. 3А) и альциановым синим (см. рис. 3Б). Показаны все 3 группы образцов: контроль-вода - группа, в которой мыши содержались в течение 35 сут без введения им пропионата и изолята E. coli, контроль-пропионат - группа, в которой мышей поили в течение 35 сут пропионатом, но им не вводили изолят E. coli, и BL2K2-пропионат - группа, в которой мышей в течение 35 сут поили пропионатом и которым вводили изолят E. coli BL2K2. Показано, что в группе контроль-вода слизистая оболочка толстой, тонкой и слепой кишки на всем протяжении истончена, с очагами незначительной инфильтрации иммунными клетками, бокаловидные клетки сохранены. Крипты ровные, без признаков ветвления. Лимфатические и кровеносные сосуды не расширены. Тонкая кишка без видимых воспалительных изменений. Структура ворсинок и крипт сохранена, воспалительная инфильтрация отсутствует. В группе контроль-пропионат отмечаются незначительные изменения слизистой оболочки проксимального отдела толстой кишки, включая слепую кишку. В слизистой и подслизистой оболочках дистальных отделов толстой кишки наблюдается отечность собственной пластинки и очаговой инфильтрации иммунными клетками. В группе BL2K2-пропионат к 35-м суткам нарастает отек собственной пластинки толстой кишки, она становится более утолщенной. Наблюдаются изменения, наиболее выраженные в проксимальных отделах толстой кишки. Поражение представлено диффузной инфильтрацией слизистой и подслизистой оболочек. В подслизистой оболочке слепой кишки множественные очаговые инфильтраты, приводящие к потере крипт. В области инфильтратов отсутствуют бокаловидные клетки. Число бокаловидных клеток снижено. Про­свет крипт местами расширен.

Таким образом, мы наблюдали не только устойчивую колонизацию изолята BL2K2 в кишечнике мышей, но и заметные изменения в ткани толстой, тонкой и слепой кишки.

Содержание цитокинов в лизатах ткани толстой кишки

Поскольку наиболее заметные изменения мы наблюдали в ткани толстой кишки, был измерен уровень цитокинов - ФНОα и ИЛ-6 - в лизатах этого отдела кишечника всех мышей. Кроме того, был выполнен сравнительный протеомный анализ ткани кишечника до и после инфицирования мышей изолятом BL2K2. Для большинства образцов лизатов мы увидели разницу между контрольными образцами и образцами ткани после инфицирования мышей изолятом BL2K2. Уровень ФНОα увеличивался только в образцах, полученных через 35 дней инфекции, и составлял в среднем 2,99 пг/10 мг ткани (рис. 4А). Уровень ИЛ-6 был выше контроля начиная с 21-го дня инфекции и составлял 2,19; 6,96 и 2,95 пг/10 мг ткани через соответственно 21, 28 и 35 дней инфекции (см. рис. 4Б). В тканевом лизате не всех мышей в группах нам удалось измерить цитокины, что может быть связано с трудностями попадания в область поражения при отборе материала. Однако обнаруженная нами разница в большинстве случаев между контрольными и опытными образцами свидетельствует о том, что кишечный иммунитет реагирует на инфицирование изолятом BL2K2, повышенный уровень цитокинов может свидетельствовать об очагах воспаления в кишечнике инфицированных мышей.

Сравнительный протеомный анализ

Для подтверждения функциональных изменений в ткани кишечника в результате колонизации мышей изолятом BL2K2 был проведен сравнительный протеомный анализ ткани толстой кишки мышей без и через 21, 28 и 35 сут инфицирования. В качестве контроля брали часть толстой кишки мышей, которые получали вместо питьевой воды в течение всего срока эксперимента пропионат. Во всех группах идентифицировано около 2200 белков (табл. 1). На рис. 5 представлены вулканоплоты, демонстрирующие количество дифференциальных белков с отсечкой FC (Log2) ≥1 и p_value ≤0,05. Поскольку отличающихся белков было не так много, мы расширили диапазон дифференциальных белков для последующего функционального анализа, приняв отсечку по FC ≥0,5.

Для начала мы сравнили группу мышей контроль-вода с группой мышей контроль-пропионат, чтобы понять, какие изменения в ткани кишечника могут происходить при длительном употреблении пропионата. Определено 32 белка, представленность которых выросла, и 15 белков, представленность которых снизилась. Среди белков, уровень которых вырос в 2 и более раза, в основном наблюдались белки метаболизма, но, кроме этого, определились белки, связанные с ответом на бактериальную инфекцию. Это бактерицидный лектин C-типа Reg3g, который действует исключительно против грамположительных бактерий и опосредует уничтожение бактерий путем связывания с поверхностными углеводными фрагментами пептидогликана и тем самым ограничивает бактериальную колонизацию эпителиальной поверхности кишечника. Вырос уровень играющего роль во врожденном иммунитете активатора транскрипции STAT1, активация которого интерфероном I типа приводит к образованию комплекса белков STAT1 и IFN p48, что в свою очередь приводит к формированию ISGF-3 (IFN-стимулируемый генный фактор 3) [19]. Увеличился уровень убиквитин-протеинлигазы Trim31, которая действует как регулятор противовирусного иммунного ответа и воспаления, опосредуя убиквитинирование субстратов, т.е. пропионат индуцировал антибактериальную активность. Увеличилось содержание фукозилтрансферазы Fut2, которая отвечает за фукозилирование гликопротеинов или гликолипидов хозяина и опосредует взаимодействие с кишечной микробиотой. Повысилась представленность плазминогена Plg, из которого образуется плазмин, играющий важную роль в фибринолизе. Мы также определили белок дифференциации клеток индуцированного миелоидного лейкоза Mcl-1 (FC=2,82), который участвует в сигнальных каскадах, ведущих к апоптозу в ответ на повреждение ДНК. Среди белков, уровень которых снизился в 2 раза и более, оказались компоненты иммуноглобулинов (Ighg1, Igkv17-127, Ighg2b) и фибриногены (Fgb и Fgg). Фибриногены после расщепления тромбином полимеризуются, образуя фибриновую матрицу.

Далее мы сравнили каждую группу образцов ткани кишечника через 21, 28 и 35 сут инфекции изолятом BL2K2 с образцами ткани кишечника мышей группы контроль-пропионат. На рис. 6 показаны диаграммы Венна, демонстрирующие количество общих и уникальных для каждого дня инфекции дифференциальных белков. При 21-дневной инфекции количество меняющихся белков сравнительно небольшое (128 белков). Однако через 28 (308 белков) и 35 (213 белков) дней инфицирования количество меняющихся белков значительно возросло. Из них общими в случае 21 дня и 28 дней инфекции были 37 белков, а в случае 21 дня и 35 дней - 32 белка.

В табл. 2 указано общее количество идентифицированных белков, которые были отобраны для сравнения групп контроль-пропионат и BL2K2-пропионат, а также количество меняющих свой уровень белков, которое возрастало по мере увеличения времени колонизации изолята BL2K2. Для анализа мы также взяли белки, уникальные для каждой группы образцов.

Мы проследили, как меняются функциональные группы дифференциальных белков в зависимости от количества дней после инфицирования изолятом BL2K2 (21, 28 и 35 дней). Наиболее представленными функциональными группами среди белков, уровень которых повышался на протяжении всех дней инфекции, белки метаболизма (25,4, 11,9 и 10,3% при 21, 28 и 35 днях инфекции соответственно), белки, участвующие в клеточной регуляции (17,9; 10,2 и 20,5% при 21, 28 и 35 днях инфекции соответственно), а также белки, участвующие в ответе на бактериальную инфекцию (7,5; 16,9 и 12,8% при 21, 28 и 35 днях инфекции соответственно) (рис. 7). На 21-й и 28-й дни инфекции вырос уровень белков внеклеточного матрикса (6 и 15,3% соответственно). В основном это коллагены и белки, отвечающие за формирование фибриллярных структур (рис. 8). К 35-му дню инфекции увеличился уровень белков, связанных с организацией цитоскелета и хроматина.

Наряду с увеличением уровня цитокинов мы наблюдали в ткани толстой кишки увеличение уровня белков, связанных с ответом на бактериальную инфекцию.

Уже через 21 день после инфицирования мышей изолятом BL2K2 наблюдалось увеличение уровня гликопротеина Cd200, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируемых в различных тканях, включая В- и Т-лимфоциты, фактора комплемента Cfb, являющегося частью альтернативного пути системы комплемента, аннексина A13, который, как известно, обладает иммуномодулирующей активностью, участвует в ключевых механизмах адаптивного иммунитета, таких как привлечение и активация антигенпрезентирующих клеток, дифференцировка Т-клеток [20], и гликопротеина Gp2, рецептора М-клеток, специфически связывающегося с компонентом пилей I типа белком FimH у E. coli. Интернализуя E. coli из просвета кишечника, он доставляет их через М-клетки в нижележащие организованные лимфоидные фолликулы, где они захватываются антигенпрезентирующими дендритными клетками, чтобы вызвать иммунный ответ слизистой оболочки.

Через 28 дней инфекции количество белков, связанных с ответом на бактериальную инфекцию, увеличивалось. Сюда вошли несколько иммуноглобулинов (Ighg2b, Fcgr2, Igkv17), 2 секретируемых лектина Colec10 и Reg4, играющих важную роль в пролиферации и дифференцировке ткани кишечника. Известно, что их экспрессия активируется в ответ на повреждение ткани, они играют роль в заживлении поврежденной слизистой оболочки. Показано, что именно Reg4 играет важную роль в инициировании многоэтапного процесса канцерогенеза колоректального рака на уровне аденомы, повышая устойчивость к запрограммированной клеточной гибели [21]. Увеличивался уровень ГТФазы Tgtp2, которая является частью защиты врожденной иммунной системы при инфекции. Показано, что экспрессия ее гена специфично индуцируется интерферонами или бактериальными липополисахаридами [22]. Повысился уровень регулятора сигнальных путей Wdfy1, опосредованных TLR3 и TLR4 рецепторами. Он также способствует активации продукции интерферона β (IFN-β) и воспалительных цитокинов. Известно, что нокаут гена, кодирующий Wdfy1, снижает иммунные реакции, опосредованные TLR3 и TLR4 in vivo [23].

Через 28 дней инфекции наблюдалось увеличение уровня просапозина Psap, предшественника подмножества липидсвязывающих белков-сапозинов, играющих важную роль в лизосомальной деградации сфинголипидов с короткими гидрофильными головными группами. Сапозины не только облегчают переваривание гликолипидов, но и действуют как белки-переносчики, нагружая гликолипидами антигенпрезентирующие молекулы семейства CD1 [24]. Обычные Т-клетки, распознающие пептидные антигены в главных комплексах гистосовместимости I и II классов, являются основными эффекторами противомикробного иммунитета. Однако при инфекции активируются и нетрадиционные популяции Т-клеток. Одна из таких популяций реагирует на липидные антигены, представленные молекулами CD1, которые кодируются генами, расположенными вне локуса главного комплекса гистосовместимости. Эти Т-клетки в первую очередь секретируют IFN-γ и обладают цитолитической функцией, что характеризует их как основные эффекторные Т-клетки при инфекциях, вызванных внутриклеточными бактериями, такими, например, как Mycobacterium tuberculosis [25].

Увеличился уровень щелочной фосфатазы Alpi, многофункционального белка, защищающего эпителиальный барьер кишечника. Этот белок участвует в детоксикации бактериальных липополисахаридов, регуляции секреции бикарбоната и уровня белков плотного соединения, а также выработки лизоцимов, которые контролируют количество бактерий в кишечнике [26]. Увеличение уровня щелочной фосфатазы было обнаружено ранее в воспаленной ткани толстой кишки у пациентов с БК [27].

К 35-му дню инфекции мы обнаружили рост уровня CD2-ассоциированного белка Cd2ap, который участвует в формировании специализированного соединения между Т-клеткой и антигенпрезентирующей клеткой, что необходимо для распознавания антигена и запуска Т-клеточного ответа [28], бактерицидного белка распознавания пептидогликана Pglyrp1, который связывается с внешней мембраной грамотрицательных бактерий и убивает бактерии, воздействуя на них снаружи и одновременно вызывая 3 синергетических стрессовых реакции: окислительный стресс, тиоловый стресс и стресс, вызванный металлами [29, 30]. Также обнаружили рост уровня хеликазы DHX36, которая регулирует выработку интерферона I типа, распознавая чужеродную двухцепочечную ДНК бактерий [31].

Вместе с тем к 35-му дню инфекции наблюдался рост фактора ADP-рибозилирования Arl8b, который локализуется в компартментах MHC II в дендритных клетках и регулирует формирование комплексов MHC II с пептидами, обеспечивая доставку антигенов в лизосомы и образование комплексов MHC II-пептид. В дендритных клетках с нокаутом гена аrl8b наблюдается дефект в формировании комплекса MHC II с антигеном и в его доставке на клеточную поверхность во время инфекции, что приводит к инактивации Т-клеточного ответа. Перемещение антигенов в ранних эндоцитарных везикулах регулируется малой ГТФазой Rab5 и ее эффекторами. Представленность Rab5 также растет у инфицированных мышей в ткани толстой кишки [32].

На 35-й день инфекции повысился уровень синтазы оксида азота Nos1, которая вырабатывает оксид азота (NO), активируется IFN-γ или ФНОα. NO выделяется в виде свободных радикалов при иммунном ответе и является токсичным для бактерий. Известно, что Nos1 усиленно экспрессируется в воспаленном кишечнике, и у пациентов с язвенным колитом наблюдается повышенная концентрация NO [33]. В результате реакции радикалов NO с супероксидными радикалами образуется пероксинитрит, который может генерировать нитрат. В отличие от облигатных анаэробных бактерий, факультативные анаэробные бактерии, в том числе Enterobacteriaceae, могут использовать нитрат в качестве конечного акцептора электронов при анаэробном дыхании [34]. E. coli получает преимущество в росте, используя нитраты только во время воспаления кишечника.

Таким образом, сравнительный протеомный анализ показал, что колонизация изолята BL2K2 в толстой кишке мышей вызывает активацию процессов, связанных с ответом на бактериальную инфекцию, при этом активируются компоненты, связанные как с гуморальным, так и с клеточным иммунитетом, в частности связанные с презентацией бактериальных антигенов на антигенпрезентирующих комплексах.

В настоящее время показана фундаментальная роль внеклеточного матрикса в регуляции воспалительных реакций, включая привлечение, удержание и активность иммунных клеток.

Известно, что существует тесная взаимосвязь между внеклеточным матриксом и адаптивным и врожденным иммунитетом, поскольку отложение и деградация коллагена тесно связаны с активностью иммунных клеток. При фиброзе воспалительные Т-клетки и дендритные клетки мигрируют к хемоаттрактантам вдоль коллагеновых волокон. Нарушения регуляции ремоделирования внеклеточного матрикса и патологическое накопление избыточного количества внеклеточного матрикса, определяемое как фиброз, наблюдалось ранее при БК [35] и многих других хронических инфекционных заболеваниях, вызванных бактериями [36].

В нашем случае через 21 сут инфекции наблюдалось увеличение уровня меприна Mep1b, представителя семейства астацинов, которые играют ключевую роль в гомеостазе соединительной ткани, регулируя правильную сборку коллагеновых фибрилл [37, 38]. В кишечнике меприны также играют важную роль в сохранении барьерных функций: в частности, меприн Mep1b находится на апикальной стороне эпителиальных клеток и предотвращает прикрепление и проникновение бактерий. Известно, что во время воспаления экспрессия генов, кодирующих меприны, увеличивается [39].

Через 28 сут инфекции мы обнаружили увеличение уровня нескольких коллагенов (Col2a1, Col14a1, Col4a2) и белков, способствующих формированию фибриллярных внеклеточных структур и разрастанию ткани (семейство малых протеогликанов, которые связываются с коллагеновыми фибриллами и волокнами в межклеточном матриксе Dcn, Lum, Bgn, Vwa1). Вырос уровень 3 интегринов - интегрина-бета 1 (ITB1), интегрина-бета 4 (ITB4) и интегрина-a 5 (ITA5). Известно, что интегрины связывают актиновый цитоскелет с внеклеточным матриксом и передают сигналы между внеклеточным матриксом и цитоплазматическими доменами. Интегриновые комплексы обеспечивают адгезию клеток к белкам внеклеточного матрикса, таким как фибронектин, ламинин и коллаген. Они играют роль не только в развитии ткани, дифференцировке, но и в иммунном ответе. Известно, что связывание и закрепление инфильтрирующих Т-клеток периферической крови в очагах воспаления подавляется антителами против ITB1, ITA5 и фибронектина, что указывает на участие этих белков в адгезии Т-клеток [40]. Показано, что интегриновый комплекс ITA5:ITB1 является рецептором для ИЛ-1β и необходим для ИЛ-1β-сигналинга [41].

Увеличился уровень коронина Coro1b, который является компонентом и регулятором межклеточных соединений и играет критическую роль в динамическом ремоделировании межклеточных соединений эндотелия и сборке эндотелиальных сетей [42]. Наряду с этим мы наблюдали снижение содержания фермента Prss2, участвующего в деградации коллагена, рецептора плазминогена Plgrkt, который регулирует активацию матриксных металлопротеиназ, таких как MMP2 и MMP9, вовлеченных в деградацию компонентов внеклеточного матрикса, и АМФ-активируемой протеинкиназы Prkab1, основного клеточного метаболического датчика, связывающего энергетический статус клетки с адгезией ее к внеклеточному матриксу и отложением внеклеточного матрикса [43].

Таким образом, протеомные данные указывают на нарушение в регуляции ремоделирования внеклеточного матрикса в сторону накопления количества внеклеточного матрикса, приводящее в конечном счете к фиброзу, что является одним из признаков воспалительного процесса.

Наиболее представленными функциональными группами среди белков, уровень которых снизился через 21, 28 и 35 сут инфекции, являются белки метаболизма (42,9; 29,4 и 43,4% соответственно), транспортеры (12,9; 8,9 и 9,6% соответственно) и белки, участвующие в клеточной адгезии (10; 4,8 и 6% соответственно) (рис. 9). Среди белков метаболизма - большое количество белков, участвующих в энергетическом метаболизме и обмене липидов и жирных кислот. Это позволяет предположить, что инфекция BL2K2 изменяет липидный обмен и энергетический метаболизм в ткани толстой кишки мышей. На протяжении всех дней инфекции мы наблюдали снижение уровня перилипинов Plin1 и Plin4, поверхностных белков, которые регулируют формирование и разрушение липидных капель - резервуаров липидов, которые участвуют в различных метаболических процессах, энергетическом гомеостазе, воспалении, во внутри- и межклеточной передаче сигналов, а также во взаимодействии патогена с организмом хозяина [44]. Внутриклеточные бактерии манипулируют липидными мембранами, чтобы стимулировать их катаболизм (липофагию), что позволяет патогену получать питательные вещества и энергию, необходимые для размножения.

Вместе с тем мы наблюдали снижение большого количества ферментов, связанных с биосинтезом и деградацией липидов, а также с бета-окислением жирных кислот. Полученные нами результаты согласуются с данными исследования A. Tazi и соавт., где было показано, что колонизация мышей E. coli изменяет липидный обмен и снижает уровни циркулирующих липидных капель [45]. Среди регуляторных белков для всех дней инфекции происходило снижение уровня регуляторов, связанных с инактивацией апоптоза. Это индуцированный фактором некроза опухоли белок Tnfaip8, который подавляет апоптоз путем ингибирования активности каспазы-8, малая ГТФаза Rab-5A, регулирующая созревание фагосом, содержащих апоптотические клетки, Mth938 домен-содержащий белок Aamdc, митоген-активируемая протеинкиназа Map2k5, действующая как часть MAPK/ERK сигнального пути.

Заключение

В нашей работе мы показали, что БК-изолят E. coli BL2K2, полученный от пациента с БК и обладающий адгезивно-инвазивным фенотипом, успешно колонизирует кишечник мышей и вызывает изменения в основном в ткани толстой и слепой кишки, а также увеличение уровня цитокинов ФНОα и ИЛ-6. Причем колонизацию и уровень цитокинов мы анализировали исключительно в лизатах ткани кишечника.

Кроме того, мы проследили за динамикой колонизации и воспаления, определив, что максимальный уровень колонизации наблюдается на 28-е сутки после инфицирования БК-изолятом, что совпадает с максимальным увеличением уровня цитокина ИЛ-6. В желудочно-кишечном тракте ИЛ-6 выполняет различные функции: от поддержания целостности кишечного эпителия и барьерной функции слизистой оболочки до модуляции иммунного ответа на воздействие микроорганизмов из окружающей среды [46]. Резкий скачок уровня ИЛ-6 сопровождается снижением уровня белков плотных контактов клаудинов и окклюдина с последующим повышением проницаемости кишечника.

С помощью сравнительного протеомного анализа методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии нам удалось показать, что колонизация БК-изолята вызывает в ткани толстой кишки активацию процессов, связанных с ответом на бактериальную инфекцию, а также с накоплением внеклеточного матрикса, приводящего к фиброзу, что является одним из признаков воспалительного процесса. При этом наибольшее количество дифференциально экспрессирующихся белков в протеоме толстой кишки наблюдалось также через 28 сут инфекции.

Мы разработали модельную систему для дальнейшего изучения участия АИЕС в инициировании и поддержании воспаления кишечника, что позволит глубже изучить и понять роль АИЕС в данном процессе.

Литература

1. Crohn B.B., Ginzburg L., Oppenheimer G.D. Regional ileitis: a pathologic and clinical entity // JAMA. 1932. Vol. 99, N 16. P. 1323-1329. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.1932.02740680019005
2. Lozynska L., Pinyazhko R., Lozynska M., Plawski A., Makukh H., Lukavetskyy O. et al. NOD2c.3019-3020insC AND c.2104C>T gene variants among patients from Western Ukraine with Crohn’s disease and colorectal cancer // Exp. Oncol. 2022. Vol. 44, N 1. P. 52-59. DOI: https://doi.org/10.32471/exp-oncology.2312-8852.vol-44-no-1.17305
3. Salem M., Ammitzboell M., Nys K., Seidelin J.B., Nielsen O.H. ATG16L1: a multifunctional susceptibility factor in Crohn disease // Autophagy. 2015. Vol. 11, N 4. P. 585-594. DOI: https://doi.org/10.1080/15548627.2015.1017187
4. Halfvarson J., Jess T., Bodin L., Järnerot G., Munkholm P., Binder V. et al. Longitudinal concordance for clinical characteristics in a Swedish-Danish twin population with inflammatory bowel disease // Inflamm. Bowel Dis. 2007. Vol. 13, N 12. P. 1536-1544. DOI: https://doi.org/10.1002/ibd.20242
5. Oyri S.F., Muzes G., Sipos F. Dysbiotic gut microbiome: a key element of Crohn’s disease // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2015. Vol. 43. P. 36-49. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cimid.2015.10.005
6. Darfeuille-Michaud A., Boudeau J., Bulois P., Neut C., Glasser A.-L., Barnich N. et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease // Gastroenterology. 2004. Vol. 127, N 2. P. 412-421. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2004.04.061
7. Kittana H., Gomes-Neto J.C., Heck K., Juritsch A.F., Sughroue J., Xian Y. et al. Evidence for a causal role for Escherichia coli strains identified as adherent-invasive (AIEC) in intestinal inflammation // mSphere. 2023. Vol. 8, N 2. Article ID e0047822. DOI: https://doi.org/10.1128/msphere.00478-22
8. Costa R.F., Ferrari M.L., Bringer M.-A., Darfeuille-Michaud A., Martins F.S., Barnich N. Characterization of mucosa-associated Escherichia coli strains isolated from Crohn’s disease patients in Brazil // BMC Microbiol. 2020. Vol. 20, N 1. P. 178. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-020-01856-x
9. Boudeau J., Glasser A.L., Neut C., Desreumaux P., Cortot A., Rich C. et al. Invasive ability of Escherichia coli strains isolated from ileal mucosa in Crohn’s disease // Gastroenterology. 2000. Vol. 118, N 4. P. A1847. DOI: https://doi.org/10.1016/s0016-5085(00)83467-8
10. Nadalian B., Yadegar A., Houri H., Olfatifar M., Shahrokh S., Asadzadeh Aghdaei H. et al. Prevalence of the pathobiont adherent‐invasive Escherichia coli and inflammatory bowel disease: a systematic review and meta‐analysis // J. Gastroenterol. Hepatol. 2021. Vol. 36, N 4. P. 852-863. DOI: https://doi.org/10.1111/jgh.15260
11. Vazeille E., Buisson A., Bringer M.-A., Goutte M., Ouchchane L., Hugot J.-P. et al. Monocyte-derived macrophages from Crohn’s disease patients are impaired in the ability to control intracellular adherent-invasive Escherichia coli and exhibit disordered cytokine secretion profile // J. Crohns Colitis. 2015. Vol. 9, N 5. P. 410-420. DOI: https://doi.org/10.1093/ecco-jcc/jjv053
12. Hornef M. Pathogens, commensal symbionts, and pathobionts: discovery and functional effects on the host // ILAR J. 2015. Vol. 56, N 2. P. 159-162. DOI: https://doi.org/10.1093/ilar/ilv007
13. Dreux N., Denizot J., Martinez-Medina M., Mellmann A., Billig M., Kisiela D. et al. Point mutations in FimH adhesin of Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli enhance intestinal inflammatory response // PLoS Pathog. 2013. Vol. 9, N 1. Article ID e1003141. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003141
14. Small C.L.N., Reid-Yu S.A, McPhee J.B., Coombes B.K. Persistent infection with Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis // Nat. Commun. 2013. Vol. 4. P. 1957. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms2957
15. Ormsby M.J., Johnson S.A., Carpena N., Meikle L.M., Goldstone R.J., McIntosh A. et al. Propionic acid promotes the virulent phenotype of Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli // Cell Rep. 2020. Vol. 30, N 7. P. 2297-2305.e5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.01.078
16. Starr T., Bauler T.J., Malik-Kale P., Steele-Mortimer O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella typhimurium // PLoS One. 2018. Vol. 13, N 3. Article ID e0193601. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193601
17. Olivares-Morales M.J., De La Fuente M.K., Dubois-Camacho K., Parada D., Diaz-Jiménez D., Torres-Riquelme A. et al. Glucocorticoids impair phagocytosis and inflammatory response against Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli // Front. Immunol. 2018. Vol. 16, N 9. P. 1026. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01026
18. Fanelli G., Pasqua M., Prosseda G., Grossi M., Colonna B. AcrAB efflux pump impacts on the survival of adherent-invasive Escherichia coli strain LF82 inside macrophages // Sci. Rep. 2023. Vol. 13, N 1. P. 2692. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29817-0
19. Samra S., Bergerson J.R.E., Freeman A.F., Stuart E., Turvey S.E. JAK-STAT signaling pathway, immunodeficiency, inflammation, immune dysregulation, and inborn errors of immunity // J. Allergy Clin. Immunol. 2025. Vol. 155, N 2. P. 357-367. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2024.09.020
20. Weyd H. More than just innate affairs - on the role of annexins in adaptive immunity // Biol. Chem. 2016. Vol. 397, N 10. P. 1017-1029. DOI: https://doi.org/10.1515/hsz-2016-0191
21. Vanderlaag K., Wang W., Fayadat-Dilman L., Wagner J., Bald L., Grein J. et al. Regenerating islet-derived family member, 4 modulates multiple receptor tyrosine kinases and mediators of drug resistance in cancer // Int. J. Cancer. 2012. Vol. 130, N 6. P. 1251-1263. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.26089
22. Pilla-Moffett D., Barber M.F., Taylor G.A., Coer J. Interferon-inducible GTPases in host resistance, inflammation and disease // J. Mol. Biol. 2016. Vol. 428, N 17. P. 3495-3513. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jmb.2016.04.032
23. Yang Y., Hu Y.-H, Liu Y. Wdfy1 deficiency impairs Tlr3-mediated immune responses in vivo // Cell. Mol. Immunol. 2020. Vol. 17, N 9. P. 1014-1016. DOI: https://doi.org/10.1038/s41423-020-0461-4
24. Teyton L. Role of lipid transfer proteins in loading CD1 antigen-presenting molecules // J. Lipid Res. 2018. Vol. 59, N 8. P. 1367-1373. DOI: https://doi.org/10.1194/jlr.R083212
25. Adams E.J. Lipid presentation by human CD1 molecules and the diverse T cell populations that respond to them // Curr. Opin. Immunol. 2014. Vol. 26. P. 1-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.coi.2013.09.005
26. Singh S.B., Lin H.C. Role of intestinal alkaline phosphatase in innate immunity // Biomolecules. 2021. Vol. 11, N 12. P. 1784. DOI: https://doi.org/10.3390/biom11121784
27. Alrubia S., Al-Majdoub Z.M., Achour B., Rostami-Hodjegan A., Barber J. Quantitative assessment of the impact of Crohn’s disease on protein abundance of human intestinal drug-metabolising enzymes and transporters // J. Pharm. Sci. 2022. Vol. 111, N 10. P. 2917-2929. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xphs.2022.07.012
28. Zhang L., He J., Zhao W., Zhou Y., Li J., Li S. et al. CD2AP promotes the progression of glioblastoma multiforme via TRIM5-mediated NF-kB signaling // Cell Death Dis. 2024. Vol. 15, N 10. P. 722. DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-024-07094-7
29. Yang Ch.-K., Kashyap D.R., Kowalczyk D.A., Rudner D.Z., Wang X., Gupta D., Dziarski R. Respiratory chain components are required for peptidoglycan recognition protein-induced thiol depletion and killing in Bacillus subtilis and Escherichia coli // Sci. Rep. 2021. Vol. 11, N 1. P. 64. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-79811-z
30. Osanai A., Sashinami H., Asano K., Li S.J., Hu D.L., Nakane A. Mouse peptidoglycan recognition protein PGLYRP-1 plays a role in the host innate immune response against Listeria monocytogenes infection // Infect. Immun. 2011. Vol. 79, N 2. P. 858-866. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00466-10
31. Briard B., Place D.E., Kanneganti T.D. DNA sensing in the innate immune response // Physiology. 2020. Vol. 35, N 2. P. 112-124. DOI: https://doi.org/10.1152/physiol.00022.2019
32. Michelet X., Garg S., Wolf B.J., Tuli A., Ricciardi-Castagnoli P., Brenner M.B. MHC class II presentation is controlled by the lysosomal small GTPase, Arl8b // J. Immunol. 2015. Vol. 194, N 5. P. 2079-2088. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1401072
33. Soufli I., Toumi R., Rafa H., Touil-Boukoffa C. Overview of cytokines and nitric oxide involvement in immuno-pathogenesis of inflammatory bowel diseases // World J. Gastrointest. Pharmacol. Ther. 2016. Vol. 7, N 3. P. 353-360. DOI: https://doi.org/10.4292/wjgpt.v7.i3.353
34. Winter S.E., Winter M.G., Xavier M.N., Thiennimitr P., Poon V., Keestra A.M. et al. Host-derived nitrate boosts growth of E. coli in the inflamed gut // Science. 2013. Vol. 339, N 6120. P. 708-711. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1232467
35. Scheibe K., Kersten C., Schmied A., Vieth M., Primbs T., Carlé B. et al. Inhibiting interleukin 36 receptor signaling reduces fibrosis in mice with chronic intestinal inflammation // Gastroenterology. 2019. Vol. 156, N 4. P. 1082-1097.e11. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.11.029
36. Schwarz D., Lipoldová M., Reinecke H., Sohrabi Y. Targeting inflammation with collagen // Clin. Transl. Med. 2022. Vol. 12, N 5. P. e831. DOI: https://doi.org/10.1002/ctm2.831
37. Broder C., Becker-Pauly C. The metalloproteases meprin α and meprin β: unique enzymes in inflammation, neurodegeneration, cancer and fibrosis // Biochem. J. 2013. Vol. 450, N 2. P. 253-264. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20121751
38. Herzog C., Haun R.S., Kaushal G.P. Role of meprin metalloproteinases in cytokine processing and inflammation // Cytokine. 2019. Vol. 114. P. 18-25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2018.11.032
39. Arnold P., Otte A., Becker-Pauly C. Meprin metalloproteases: molecular regulation and function in inflammation and fibrosis // Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017. Vol. 1864, N 11. Pt B. P. 2096-2104. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2017.05.011
40. Ito M., Hirata S., Arai S., Takahashi T. T cell adherence and mucosal injury in ulcerative colitis: involvement of integrin-fibronectin interaction in situ // J. Gastroenterol. 1995. Vol. 30, suppl. 8. P. 70-72.
41. Maynard S.A., Pchelintseva E., Zwi-Dantsis L., Nagelkerke A., Gopal S., Korchev Y.E. et al. IL-1β mediated nanoscale surface clustering of integrin α5β1 regulates the adhesion of mesenchymal stem cells // Sci. Rep. 2021. Vol. 11, N 1. P. 6890. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-021-86315-x
42. Werner A.C., Weckbach L.T., Salvermoser M., Pitter B., Cao J., Maier-Begandt D. et al. Coronin 1B controls endothelial actin dynamics at cell-cell junctions and is required for endothelial network assembly // Front. Cell Dev. Biol. 2020. Vol. 8. P. 708. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00708
43. Georgiadou M., Lilja J., Jacquemet G., Guzmán C., Rafaeva M., Alibert C. et al. AMPK negatively regulates tensin-dependent integrin activity // J. Cell Biol. 2017. Vol. 216, N 4. P. 1107-1121. DOI: https://doi.org/10.1083/jcb.201609066
44. Libbing C.L., McDevitt A.R., Azcueta R.M.P., Ahila A., Mulye M. Lipid droplets: a significant but understudied contributor of host-bacterial interactions // Cells. 2019. Vol. 8, N 4. P. 354. DOI: https://doi.org/10.3390/cells8040354
45. Tazi A., Araujo J.R., Mulet C., Arena E.T., Nigro G., Pédron T. et al. Disentangling host-microbiota regulation of lipid secretion by enterocytes: insights from commensals Lactobacillus paracasei and Escherichia coli // mBio. 2018. Vol. 9, N 5. Article ID e01493-18. DOI: https://doi.org/10.1128/mBio.01493-18
46. Guo Y., Wang B., Wang T., Gao L., Yang Z.J., Wang F.F. et al. Biological characteristics of IL-6 and related intestinal diseases // Int. J. Biol. Sci. 2021. Vol. 17, N 1. P. 204-219. DOI: https://doi.org/10.7150/ijbs.51362

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.