Влияние питьевого рациона с повышенным содержанием дейтерия на микробиом кишечника и антиоксидантный статус организма крыс

Козин Станислав Владимирович ; Сигарева Александра Сергеевна; Моисеев Аркадий Викторович; Козлова Елена Алексеевна; Рубайло Александра Денисовна; Кравцов Александр Анатольевич

Резюме

В свете подготовки в данный момент пилотируемой миссии на Марс крайне актуально понимать характер влияния на организм млекопитающих питьевого рациона с концентрацией дейтерия, соответствующей его уровню в ледниках на Марсе.

Цель работы - оценить динамику содержания дейтерия в организме экспериментальных животных и изменения в окислительных процессах при ежедневном приеме питьевого рациона с концентрацией дейтерия 6704‰.

Материал и методы. Эксперименты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 270-300 г. Реакцию организма на повышение концентрации дейтерия исследовали на 60 животных, которых разделили на 2 равные группы: 1-я группа - крысы потребляли питьевой рацион с концентрацией дейтерия, соответствующей природному уровню (-37‰); 2-я группа - с концентрацией дейтерия 6704‰. Из эксперимента выводили по 5 животных на 5, 8, 11, 16, 21 и 31-е сутки с отбором кала, крови и головного мозга. Исследование стресс-протекторной активности питьевого рациона с модифицированным изотопным составом было проведено на 3 группах крыс (по 7 в каждой). Группа "Контроль, -37‰" - животные потребляли воду с концентрацией дейтерия -37‰; животные группы "Стресс, -37‰" и "Стресс, 6704‰" в течение 38 сут потребляли воду с концентрацией дейтерия соответственно -37 и 6704‰ при моделировании иммобилизационного стресса (4 ч) в течение 3 сут начиная с 33-х. Содержание дейтерия в воде и сыворотке крови определяли методом сравнения с эталоном с помощью ЯМР-спектрометра (Bruker Avance NEO 700 МГц), в лиофилизированных тканях коры головного мозга - с использованием изотопного масс-спектрометра (DELTA V Advantage). Активность свободнорадикальных процессов оценивали по интенсивности хемилюминесценции плазмы крови и супернатанта тканей коры головного мозга, в головном мозге определяли активность каталазы спектрофотометрически, уровень экспрессии генов - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Соотношение доминантных филумов бактерий в кишечном микробиоме оценивали с помощью ПЦР с филум-специфичными праймерами к 16s рРНК.

Результаты и обсуждение. Потребление воды с концентрацией дейтерия 6704‰ в течение 31 дня вызывало увеличение его концентрации в плазме крови крыс с -25±4 до 4425±103‰, а в тканях головного мозга содержание дейтерия увеличилось с -127±7 до 667±32‰. При накоплении дейтерия в организме в коре головного мозга происходило повышение активности каталазы (в 2,2-5,3 раза с 8-х по 31-е сутки, p<0,05), изменение уровня экспрессии ряда генов (Cat, Gclc, Nrf2), обеспечивающих антиоксидантную защиту. Выявлены колебания численности микробиома кишечника, особенно заметные на 5-е и 8-е сутки эксперимента в виде снижения представленности Bacteroides (на 13 и 22%) и роста Firmicutes (на 12 и 16%). Установленные эффекты являются результатом адаптационных реакций на стресс, вызванный повышением концентрации дейтерия во внутренней среде организма. Снижение интенсивности окислительного стресса в тканях головного мозга и крови крыс после перенесенного иммобилизационного стресса обусловлено длительным поступлением воды с концентрацией дейтерия 6704‰ в организм и развитием эффекта перекрестной адаптации.

Заключение. Повышение содержания дейтерия в жидкостях и тканях организма экспериментальных животных обусловливает возникновение стрессовой реакции с включением механизмов адаптации, что сопровождается усилением протекторных свойств организма при иммобилизационном стрессе.

Ключевые слова: дейтерий; микробиом кишечника; иммобилизационный стресс; антиоксидантный статус; адаптация; крысы

Содержание дейтерия в природных водах нашей планеты различается в зависимости от места их нахождения и происхождения [1]. Оно колеблется в диапазоне от -429 до 40‰, при этом считается, что океаническая вода содержит 0‰ дейтерия [2]. Это отражается на содержании дейтерия во фруктах и овощах, выращенных в различных регионах [3]. Известно, что на планете Марс концентрация стабильного изотопа водорода дейтерия колеблется в зависимости от локализации от ~-5 до ~7000‰ [4].

Изменения концентрации дейтерия в питьевом рационе, даже в небольшом диапазоне, могут отражаться на интенсивности биохимических процессов [5], приводить к активации [6-8] и ингибированию [7, 9, 10] различных процессов. Изотопные эффекты в организме млекопитающих могут проявляться как при снижении [11-13], так и при повышении [14] концентрации дейтерия во внутренней среде. При длительном употреблении питьевого рациона с концентрацией дейтерия ниже природного уровня у экспериментальных животных происходит снижение его концентрации в плазме крови, тканях печени, почек и сердца [15]. Подобные колебания изотопного состава во внутренней среде организма могут приводить к увеличению активности гуморальных и клеточных защитных систем за счет эффекта предадаптации. Изотопный ²Н/¹H обмен возможен в -OH, -NH, -SH-группах, имеющих свободные неподеленные пары электронов, и в низкомолекулярных соединениях, способных к образованию водородных связей [16, 17]. Изотопные эффекты могут быть связаны не только с эффектом предадаптации, но и с ²Н/¹H-заменами в активных и аллостерических центрах ферментов [1, 18], что приводит к модификации их термодинамических и кинетических параметров [19, 20]. В нескольких работах описан механизм реализации изотопных эффектов в живых системах за счет изменений в электрон-транспортной цепи митохондрий [21, 22]. Ранее нами было установлено, что при потреблении питьевого рациона с концентрацией дейтерия 3815‰ в течение 2 мес наблюдается повышение его концентрации в крови экспериментальных животных с -37 до 2127‰. Это обусловливает увеличение антиоксидантного потенциала в тканях печени и снижение интенсивности свободнорадикальных процессов в крови и гепатоцитах [11]. В условиях активной подготовки пилотируемой миссии на Марс крайне важно понимать, какое влияние питьевой рацион с повышенным содержанием дейтерия относительно земного уровня будет оказывать на организм млекопитающих.

Цель работы - исследование динамики содержания дейтерия в организме экспериментальных животных и изменений в окислительных процессах при ежедневном приеме питьевого рациона с концентрацией дейтерия 6704‰.

Материал и методы

Животные, модель стресса и дизайн эксперимента

Эксперименты были выполнены на крысах-самцах линии Вистар, возраст которых составлял 3 мес, масса тела 270-300 г. В каждой клетке (размеры: 300×400×150 мм) содержали по 6 животных в помещении с ламинарным потоком воздуха, при температуре 22±1 °С и относительной влажности 55±10%, при естественном освещении. Пища и вода были доступны ad libitum. Все манипуляции проводили между 09:00 и 16:00 ч.

Исследование реакции организма на поступление дейтерия было выполнено на 60 крысах. Животные были разделены на 2 равные группы: 1-я группа (n=30) - крысы потребляли питьевой рацион с концентрацией дейтерия, соответствующей природному уровню (-37‰); 2-я группа (n=30) - с концентрацией дейтерия 6704‰.

Из эксперимента выводили по 5 животных на 5, 8, 11, 16, 23 и 31-е сутки. В эти дни производили отбор кала и крови, а также извлекали головной мозг после декапитации. Кал использовали для оценки микро­биома кишечника. Кровь использовали для приготовления плазмы и сыворотки. Изотопное ²Н/¹H соотношение исследовали в сыворотке, а в плазме крови определяли интенсивность процессов свободнорадикального окисления. Кору головного мозга извлекали на холоде, замораживали в жидком азоте и использовали для последующих анализов: определения интенсивности хемилюминесценции, активности каталазы, уровня экспрессии генов (анализ методом полимеразной цепной реакции - ПЦР).

Исследование стресс-протекторной активности питьевого рациона с модифицированным изотопным составом было проведено на 3 группах крыс линии Вистар (по 7 в каждой):

- группа "Контроль, -37‰" - животные потребляли воду с концентрацией дейтерия -37‰;

- группа "Стресс, -37‰" - крысы потребляли воду с концентрацией дейтерия -37‰ в течение 32 сут перед моделированием иммобилизационного стресса и до окончания эксперимента;

- группа "Стресс, 6704‰" - потребляли воду с концентрацией дейтерия 6704‰ в течение 32 дней перед моделированием иммобилизационного стресса и до окончания эксперимента.

Иммобилизационный стресс, широко используемый метод моделирования острого стресса, заключается не только в физическом обездвиживании, но и в создании сильного эмоционального напряжения вследствие того, что подопытное животное не может избежать угрозы. Меняя продолжительность обездвиживания, можно изучать, как организм реагирует на стресс разной интенсивности. Иммобилизационный стресс моделировали на 33-и сутки эксперимента. Животных фиксировали на спине, привязывая конечности, чтобы крыса оставалась в неподвижном положении. Процедуру стресса проделывали ежедневно по 4 ч в течение 3 сут. Ежедневно осуществляли контроль за животными, осматривая конечности.

На 38-е сутки животных выводили из эксперимента, осуществляли забор крови и изъятие головного мозга. В плазме крови оценивали интенсивность окислительных процессов, происходящих в организме. После отделения кору головного мозга хранили в жидком азоте. Для изучения интенсивности процессов свободнорадикального окисления супернатант из тканей головного мозга готовили на холоде.

Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, Директивы Европейского сообщества 2010/63/EU и Руководства по работе с лабораторными животными, включая этические принципы проведения испытаний на животных (принцип 3R) ФГБНУ "ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН", в котором исследование одобрено биоэтической комиссией (протокол № 7/2023 от 07.03.2023).

Определение содержания дейтерия в крови

Концентрацию дейтерия в воде и сыворотке крови определяли методом сравнения с эталоном с помощью ЯМР-спектрометра Bruker Avance NEO 700 МГц [23] в центре коллективного пользования НОРЦ "Фармация" РУДН.

Определение содержания дейтерия в тканях головного мозга

Изотопное ²Н/¹H соотношение в лиофилизированных тканях головного мозга определяли на изотопном масс-спектрометре DELTA V Advantage, который был совмещен с элементным анализатором Flash 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) и оснащен пиролитическим реактором. Образцы массой 240-280 мкг гомогенизировали и помещали в серебряные капсулы, после чего их переносили в автосэмплер элементного анализатора Flash 2000. После попадания в пиролитический реактор, температура в котором составляла 1350 °С, капсула сгорала в потоке гелия марки-6.0 (90 мл/мин). Выделенный при пиролизе водород по капилляру попадал в масс-спектрометр DELTA V Advantage через систему газораспределения Conflo II.

Хемилюминесцентный анализ

Интенсивность свободнорадикальных процессов в крови и тканях головного мозга животных оценивали с использованием хемилюминометра Lum-100 (Россия) по светосумме (в условных единицах). Хемилюминесценцию (ХЛ) плазмы крови (0,1 см³ плазмы + 0,8 см³ фосфатного буфера, pH 7,4) возбуждали введением 0,1 см³ 0,3% пероксида водорода. Инициацию свечения супернатанта коры головного мозга (0,2 см³ супернатанта + 2,8 см³ фосфатного буфера), полученного путем добавления к 100 мг растертой в ступке ткани, охлажденной жидким азотом, 1 см³ фосфатного буфера, встряхивания в течение 15 мин и последующего центрифугирования в течение 10 мин пpи 4000 g, вызывали при помощи введения 30 мкм³ 35 мМ ионов Fe²⁺ в виде раствора сульфата железа (II). Полученные результаты представляли виде процентов от контрольного образца.

Активность каталазы

Активность каталазы в супернатанте коры головного мозга определяли спектрофотометрически [24] по скорости убывания в среде инкубации перекиси водорода, которая при взаимодействии с молибдатом аммония образует стойкий окрашенный комплекс (λ=410 нм). Активность каталазы пропорциональна разности оптической плотности холостой и опытной пробы, выражали в мКат/г белка; результаты представляли в процентах от контроля.

Состав кишечного микробиома

Соотношение доминантных филумов бактерий в кишечном микробиоме оценивали с помощью ПЦР с филум-специфичными праймерами к 16s рРНК. Последовательности праймеров представлены в табл. 1.

Количественный ПЦР-анализ осуществлялся на термоциклере CFX96^TM Real-Time System (Bio-Rad, США) с использованием набора qPCRmix-HS SYBR ("Евроген", Россия). Условия реакции были следующими: общая денатурация при 94 °С 5 мин, далее 35 циклов: денатурация при 94 °С в течение 10 с, отжиг праймеров при 55 °С 10 с, элонгация при 72 °С 15 с. Количественное соотношение каждого филума рассчитывали по формуле:

где Е - эффективность ПЦР.

Уровень экспрессии генов

Выделение нуклеиновых кислот из лиофилизированных тканей коры головного мозга производили с помощью различных коммерческих наборов: ДНК - с помощью набора "Проба-ГС" ("ДНК-технология", Россия); РНК - с помощью ExtractRNA ("Евроген", Россия) - монофазного водного раствора фенола и гуанидин-изотиоцианата с дальнейшим добавлением хлороформа для разделения фаз и изопропилового спирта для преципитации РНК. Качественный анализ выделенных образцов нуклеиновых кислот, а также продуктов ПЦР проводили с помощью гель-электрофореза в 2% агарозном геле с 1x TAE буфером.

Для обратной транскрипции использовали изолированную РНК и коммерческий набор REVERTA-L (AmpliSens, Россия) согласно прилагаемому протоколу. Количественный ПЦР-анализ осуществлялся на термоциклере CFX96^TM Real-Time System (Bio-Rad, США) с использованием набора qPCRmix-HS SYBR ("Евроген", Россия). Нормализованный уровень экспрессии рассчитывали по формуле 2(^-ΔΔCq). Для обработки результатов использовали стандартное ПО Bio-Rad CFX Manager (версия 2.1). В качестве референсов использовался ген Gapdh.

Статистическая обработка

Для статистического анализа данных был применен пакет Statistica 10. В исследовании использовали следующие непараметрические методы: H-критерий Краскела-Уоллиса - для сравнения медиан в независимых группах; U-критерий Манна-Уитни - для оценки значимости различий между двумя независимыми малыми выборками; W-критерий Вилкоксона - для выявления различий между двумя малыми выборками с парными (связанными) измерениями. Статистически значимыми считали различия при уровне p<0,05.

Результаты

Содержание дейтерия в плазме крови и коре головного мозга

Результаты, полученные методом изотопной масс-спектрометрии, представлены в табл. 2. В 0-й день, до начала приема питьевого рациона с повышенным относительно природного уровня содержанием ²Н его концентрация в сыворотке крови составила 25±4‰. У животных 2-й группы и группы "Стресс, 6704‰" наблюдали стабильное повышение концентрации ²Н в сыворотке крови. На 5-й день эксперимента концентрация дейтерия в сыворотке увеличилась на 125%. Повышение концентрации дейтерия в крови происходило до 23-го дня (превышение контрольного значения составило 468%). Концентрация дейтерия в образцах сыворотки крови животных на 31-й день практически не отличалась от значений на 23-й день.

Потребление воды с повышенным содержанием дейтерия привело к стабильному возрастанию уровня дейтерия в тканях головного мозга крыс. Так, уже через 5 дней отмечено увеличение на 17%. Далее повышение содержания дейтерия составило 33, 42, 56, 74 и 91% соответственно для 8, 11, 16, 23 и 31-го дней по отношению к 0-му дню (контролю).

Необходимо отметить, что скорость изотопного ²H/¹H обмена в крови и головном мозге была неравномерной в течение эксперимента (табл. 3). Она была выше в первые 5 сут, а затем скорость повышения концентрации дейтерия постепенно снижалась. Отрицательное значение для плазмы крови для периода с 24-го по 31-й дни отражает незначительное снижение (p>0,05) уровня дейтерия, полученное для 31-го дня, по отношению к предыдущему, 23-му дню.

Таким образом, потребление крысами питьевого рациона с повышенным относительно природного уровня содержанием дейтерия приводит к увеличению его концентрации в крови и тканях головного мозга. При этом скорость изотопного ²H/¹H обмена в крови и мозге экспериментальных животных максимальна в первые 8 дней применения обогащенной дейтерием воды. В дальнейшем происходит снижение данного параметра, что, вероятно, связано с насыщением макромолекул тканей крови и мозга атомами дейтерия.

Хемилюминесценция плазмы крови

Представленные на рис. 1 данные показывают, что при потреблении крысами воды с повышенным содержанием дейтерия (6704‰) в плазме крови происходило смещение антиоксидантного/прооксидантного равновесия. Начиная с 8-го дня наблюдалась активация интенсивности ХЛ вплоть до 16-го дня, когда было отмечено максимальное повышение - 23% к контролю. Затем происходило снижение данного показателя и на 31-й день потребления интенсивность ХЛ вернулась к физиологической норме и существенно не отличалась от контрольного значения.

Известно, что интенсивность ХЛ прямо пропорциональна скорости формирования свободных радикалов в исследуемой системе. Увеличение светосуммы ХЛ плазмы крови может быть следствием как уменьшения ее антиоксидантного потенциала, так и активацией свободнорадикальных процессов.

Полученные данные показывают, что потребление воды с повышенным содержанием дейтерия в начале эксперимента привело к нарушению баланса про- и антиоксидантных процессов. При более продолжительном воздействии произошло восстановление равновесия.

Прооксидантно-антиоксидантный баланс в головном мозге

На 5-е сутки эксперимента происходило резкое повышение светосуммы свечения на 23% к контролю (0-й день). К 8-м суткам этот показатель снижался до первоначального значения (рис. 2). Затем отмечено возрастание интенсивности ХЛ в тканях коры головного мозга на 16 и 24% соответственно на 11-е и 16-е сутки эксперимента (p<0,05). В дальнейшем на 23-и и 31-е сутки эксперимента наблюдалось снижение интенсивности ХЛ до уровня, не отличающегося от контроля.

Анализ результатов исследования активности каталазы (рис. 3) показал, что данный параметр возрастал на протяжении всего эксперимента. Статистически значимые отличия выявлены на 8, 11, 16, 23 и 31-й дни, когда активность каталазы увеличилась на 222, 244, 467, 511 и 533% соответственно.

Кроме того, на фоне повышения концентрации дейтерия в коре головного мозга крыс происходит усиление экспрессии генов (рис. 4), ответственных за синтез каталазы (Cat), глутаматцистеинлигазы (Gclc) - первого фермента клеточного пути биосинтеза GSH, редокс-чувствительного транскрипционного фактора Nrf2 (Nfe2I2). Следует отметить некоторую закономерность в изменении активности генов данных белков. В 1-ю неделю потребления утяжеленной воды в коре головного мозга происходила активация генов всех 3 белков. На 2-й и 3-й неделе эксперимента наблюдалась пассивация экспрессии генов Cat, Gclc, Nrf2 в данном отделе мозга. При дальнейшем повышении концентрации дейтерия в тканях головного мозга после 4 нед потребления изотопно-модифицированной воды происходило очередное повышение активности данных генов, за исключением гена Gclc.

Таким образом, поступление дейтерия в организм млекопитающих приводит к смещению редокс-состояния в тканях головного мозга. Параллельно наблюдается активация системы антиоксидантной защиты, которая проявляется в росте активности каталазы и усилении экспрессии ряда генов, кодирующих антиоксидантные белки.

Микробиом кишечника

Ежедневное повышение содержания дейтерия в организме крыс приводило к изменению количественного состава кишечного микробиома (табл. 4).

Наиболее выраженно эти сдвиги затронули основных представителей кишечной микрофлоры, таких как Bacteroides и Firmicutes. Изменение численности Firmicutes и Bacteroides имело противоположные тенденции: при повышении численности бактерий типа Firmicutes наблюдалось снижение представителей Bacteroides. Наиболее ярко это проявлялось на 5-й и 8-й дни эксперимента, когда численность Bacteroides снизилась на 13 и 22% по сравнению с показателями, измеренными в 0-й день эксперимента. При этом популяция бактерий типа Firmicutes, наоборот, возрастала в эти сутки на 12 и 16% по сравнению с первоначальным значением.

Количественные изменения затронули популяции субдоминантных представителей кишечной микрофлоры. Повышение количества таких таксонов, как Actinobacteria, Deferribacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, происходило по колоколообразной зависимости с течением всего времени эксперимента. Как видно из табл. 4, максимальная представленность в микробиоме данных групп микроорганизмов наблюдалась на 5-11-е сутки изотопного замещения протия на дейтерий во внутренней среде организма. Доля семейства бактерий типа Deferribacteria достигла 2,4%, Betaproteobacteria - 2,6%, Epsilonproteobacteria - 1,8% по сравнению с начальным днем (0-й день) эксперимента (0,002, 0,04 и 0,31%). Небольшие количественные сдвиги в сторону повышения наблюдались в представленности бактерий типа Actinobacteria, к которым относят Bifidobacterium и Collinsella. У Saccaribacteria на фоне повышения содержания дейтерия в организме хозяина происходили неоднозначные изменения роста популяции. К 5-м суткам эксперимента их количество увеличилось, с 8-11-х суток снизилось и в дальнейшем не отличалось от начального уровня.

В контрольной группе на протяжении всего эксперимента достоверных изменений численности исследованных представителей микробиома не наблюдалось.

Стресс-протекторный эффект

Как видно из табл. 5, максимальная интенсивность ХЛ наблюдалась у животных в группе "Стресс, -37‰". Возрастание по сравнению с показателями крыс группы "Контроль, -37‰" составило 29% для плазмы крови и 39% - для коры головного мозга. Рост интегральной интенсивности ХЛ плазмы крови свидетельствует о формировании окислительного стресса у животных в исследуемой группе. У крыс, которые потребляли обогащенный дейтерием питьевой рацион в течение 38 дней и подверглись иммобилизационному стрессу, наблюдалось существенно меньшее возрастание инте9нсивности ХЛ. Так, для плазмы крови возрастание составило 12%, а для коры головного мозга - 21%, что статистически значимо меньше, чем в группе "Стресс, -37‰".

Таким образом, стрессорное воздействие приводило к существенно менее интенсивной активации окислительных процессов в крови и тканях головного мозга у тех животных, которые в течение 38 дней потребляли питьевой рацион, обогащенный дейтерием.

Обсуждение

У экспериментальных животных, потреблявших питьевой рацион с повышенной концентрацией дейтерия, наблюдается его постепенное накопление в крови и тканях головного мозга. Это приводит к изотопному замещению (протий на дейтерий) в составе ключевых биомолекул - белков, липидов и нуклеиновых кислот [16]. Данный процесс осуществляется по механизму Гротгуса: протоны и дейтроны мигрируют по цепям водородных связей, переходя от одной молекулы к другой. Кроме того, интенсивному изотопному обмену способствуют водородные связи между биомолекулами и молекулами их гидратных оболочек [25].

Таким образом, благодаря активному изотопному обмену в биомолекулах происходит обогащение дейтерием внутренней жидкости и тканей организма [26].

Известно, что изменение внутренней среды организма вызывает реакцию стресс-реализующих систем. Если интенсивность стресса не превосходит потенциал стресс-лимитирующей системы организма, его действие сводится к включению компенсаторных механизмов и развитию адаптации к вызвавшему стресс фактору. Данный процесс обеспечивается активацией систем регуляции, а затем эффекторных органов, что способствует новому уровню функций в организме в изменившихся условиях среды. Все это касается и модификации изотопного состава внутренней среды организма [1]. В проведенном исследовании мы установили, что повышение уровня дейтерия в жидкостях и тканях организма млекопитающих приводит к развитию умеренной стрессовой реакции и адаптационного синдрома.

Согласно данным литературы, митохондрии рассматриваются в качестве одной из потенциальных мишеней воздействия как низких, так и высоких концентраций дейтерия на клеточном уровне. Предполагается, что в результате изотопного обмена дейтерий/протий увеличивается вероятность нахождения дейтерия в протонных каналах первого и третьего комплекса, а также в АТФ-синтазе пятого комплекса электрон-транспортной цепи [25]. Как известно, перенос протона в протонных помпах и транслоказе электрон-транспортной цепи осуществляется по цепочке водородных связей между аминокислотными остатками. Попадание дейтерия в один из указанных белков-переносчиков приводит к повышению прочности водородной связи и изменению их проводимости. Все эти процессы способны существенным образом изменять функциональные параметры митохондрий и клетки в целом. Так, ранее нами было показано, что снижение концентрации дейтерия приводит к падению мембранного потенциала митохондрий и внутриклеточного уровня Ca²⁺ - одного из важнейших клеточных регуляторов [27]. Мы предполагаем, что в развитии стрессовой реакции в клетках головного мозга, связанной с повышением содержания дейтерия, могут быть задействованы указанные выше процессы. Как известно, изменение мембранного потенциала митохондрий и увеличение концентрации цитоплазматического кальция способствуют продукции активных форм кислорода в митохондриях [21]. В наших экспериментах при повышении содержания дейтерия наблюдалась активация продукции свободных радикалов в тканях головного мозга. Наибольшее нарушение редокс-баланса наблюдалось в начальной фазе эксперимента, что коррелирует с пиковой скоростью изотопного обмена в системном кровотоке и церебральных тканях. При более продолжительном воздействии интенсивность продукции активных форм кислорода и азота уменьшается, что выражается уменьшением светосуммы ХЛ.

Из результатов наших исследований видно, что на начальных этапах воздействия происходит разбалансировка в работе антиоксидантной системы. Активность каталазы увеличивается и сохраняется высокой до конца эксперимента, что является результатом компенсаторной реакции на смещение редокс-равновесия. В ходе эксперимента было отмечено, что изменение экспрессии генов, ответственных за синтез каталазы и Nrf2, имеет U-образную зависимость. В первую и последнюю неделю эксперимента происходит активация экспрессии данных белков, тогда как в течение 2-й и 3-й недели наблюдается снижение активности. Активность гена Gclc, кодирующего гамма-глутамилцистеинсинтетазу, наблюдается только в течение 1-й недели. Динамика экспрессии генов вышеперечисленных белков коррелирует с динамикой продукции свободных радикалов и является ее следствием. Возможно, наблюдаемая нами картина экспрессии генов - это результат развития адаптации. Фактор транскрипции Nrf2 активирует гены антиоксидантных белков, необходимых для восстановления окислительно-восстановительного баланса [28]. Гамма-глутамилцистеинсинтетаза вместе с глутатионсинтетазой обеспечивают синтез восстановленного глутатиона. Экспрессия гена Gclc усиливается в ответ на действие стрессовых факторов, приводящих к усилению продукции активных форм кислорода и азота. Повышенная экспрессия Gclc в начальной фазе эксперимента также является одним из звеньев развития адаптационного синдрома на фоне изменения содержания дейтерия. Таким образом, наблюдается картина развития адаптационного синдрома в результате изменения дейтериевого гомеостаза.

Существуют клинические и экспериментальные доказательства того, что между кишечником и мозгом существует двунаправленная связь. Микробиота кишечника влияет на развитие мозга, выработку нейромедиаторов, метаболитов и гормонов в кровь и лимфатическую систему через нейрональные, эндокринные и иммунные пути [29].

На фоне повышения содержания дейтерия в крови и тканях экспериментальных животных происходит изменение соотношения численности бактерий, населяющих кишечник. Данные литературы позволяют предположить, что изменение метаболического состояния в тканях головного мозга, являющееся следствием компенсаторной реакции на повышение уровня дейтерия, индуцирует изменения количественного состава микробиома [30, 31]. Из полученных результатов видно, что соотношение населенности Firmicutes/Bacteroides, а также изменение численности Actinobacteria, Deferibacteria, Betaproteobacteria, Epsilonproteobacteria имеет колоколообразную зависимость и коррелирует с изменением антиоксидантного/прооксидантного равновесия в тканях головного мозга. Согласно концепции "ось мозг-кишечник", нарушение дейтериевого гомеостаза запускает компенсаторные реакции в головном мозге, что ведет к изменению его биохимии и метаболизма. Эти изменения, в свою очередь, вызывают перестройку количественного состава кишечной микробиоты у экспериментальных животных.

Активные формы кислорода действуют как критические сигнальные молекулы для запуска воспалительных реакций в центральной нервной системе, они приводят к активации и секреции провоспалительных цитокинов [28]. Цитокины оказывают влияние на кишечник через энтеральную нервную систему, воздействуя напрямую на афферентные нервные окончания либо через общий кровоток. В результате такого воздействия происходит нарушение перистальтики и проницаемости кишечного барьера, что ведет к размножению условно патогенных бактерий филума Proteobacteria. Известно, что различные метаболические нарушения в организме приводят к интенсификации размножения данных представителей кишечной микрофлоры и кишечному воспалению. Также на начальных этапах потребления животными утяжеленной воды происходит повышение численности Firmicutes и снижение Bacteroides. Возрастание численности Firmicutes в кишечнике также характерно во время нарушения метаболических процессов в организме [32]. Следует отметить, что на более поздних сроках эксперимента наблюдается восстановление кишечной микробиоты на фоне снижения продукции свободных радикалов и цитокинов, что может являться свидетельством завершения периода адаптации.

Согласно теории воздействия кишечник-мозг, колебания состава микробиома кишечника могут привести к метаболическим изменениям в головном мозге. Из данных литературы известно, что рост бактерий зависит от изотопного соотношения дейтерий/протий в среде [1]. При этом различные бактерии могут по-разному реагировать на этот фактор. Можно предположить, что по мере изменения концентрации дейтерия в организме экспериментальных животных могла меняться активность и, соответственно, численность тех или иных представителей кишечной микрофлоры. На начальных этапах воздействия утяжеленной водой, при минимальном изменении концентрации дейтерия в организме могли активизироваться условно патогенные представители Proteobacteria и Firmicutes, что ранее отмечалось при стрессовом воздействии [33]. Более высокие концентрации дейтерия могли привести к подавлению роста этих бактерий. Прогрессирование условно патогенных микроорганизмов в кишечнике на начальных этапах эксперимента, вероятнее всего, способствовало высвобождению токсичных метаболитов, которые через блуждающий нерв или через общий кровоток оказывали влияние на ткани головного мозга, усиливая действие дейтериевого стресса.

Заключение

Результаты исследования демонстрируют, что употребление крысами питьевого рациона с повышенной концентрацией дейтерия приводит к накоплению этого изотопа в плазме крови и коре головного мозга. Наиболее интенсивно изотопный обмен (дейтерий/протий) протекал в первые 8 дней эксперимента. На начальном этапе эксперимента было зафиксировано нарушение баланса между про- и антиоксидантными системами, однако при продолжении воздействия этот показатель возвращался к исходным значениям. Параллельно с ростом концентрации дейтерия в биологических средах изменялся и состав кишечной микробиоты, который также демонстрировал тенденцию к нормализации со временем. При этом потребление крысами обогащенной дейтерием воды приводило к существенно меньшему нарастанию окислительных процессов в крови и мозге при воздействии иммобилизационного стресса. Выявленный стресс-протекторный эффект объясняется механизмом перекрестной адаптации. Активация антиоксидантной системы в ответ на дейтериевый стресс предотвратила усиление окисления у крыс при последующей иммобилизации.

Таким образом, рост концентрации дейтерия запускает стресс-реакцию и компенсаторные механизмы адаптации. Это приводит к активации антиоксидантной защиты, что повышает устойчивость организма к иммобилизационному стрессу.

Литература

1. Basov A., Fedulova L., Baryshev M., Dzhimak S. Deuterium-depleted water influence on the isotope ²H/¹H regulation in body and individual adaptation // Nutrients. 2019. Vol. 11. P. 1903. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11081903

2. De Wit J.C., van der Straaten C.M., Mook W.G. Determination of the absolute hydrogen isotopic ratio of VSMOW and SLAP // Geostandards Newslett. 1980. Vol. 4, N 1. P. 33-36. DOI: https://doi.org/10.1111/J.1751-908X.1980.TB00270.X

3. Быков М.И., Джимак С.С., Басов А.А., Арцыбашева О.М., Шашков Д.И., Барышев М.Г. Сравнительная характеристика изотопного D/H состава и антиоксидантной активности свежевыжатых соков из овощей и фруктов, выращенных в различных географических регионах // Вопросы питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 89−96. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2015-00038

4. Villanueva G.L., Mumma M.J., Novak R.E., Käufl H.U., Hartogh P., Encrenaz T. et al. Strong water isotopic anomalies in the martian atmosphere: probing current and ancient reservoirs // Science. 2015. Vol. 348, N 6231. P. 218-221. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaa3630

5. Répás Z., Gyori Z., Buzás-Bereczki O., Boros L.G. The biological effects of deuterium present in food // Discover Food. 2025. Vol. 5, N 1. P. 57. DOI: https://doi.org/10.1007/s44187-025-00327-4

6. Козин С.В., Кравцов А.А., Елкина А.А., Злищева Э.И., Барышева Е.В., Шурыгина Л.В. и др. Изотопное замещение дейтерия на протий в тканях головного мозга крыс изменяет его резистентность к гипоксии // Биофизика. 2019. Т. 64, № 2. С. 362-370. DOI: https://doi.org/10.1134/S0006302919020169

7. Korchinsky N., Davis A.M., Boros L.G. Nutritional deuterium depletion and health: a scoping review // Metabolomics. 2024. Vol. 20, N 6. P. 117. DOI: https://doi.org/10.1007/s11306-024-02173-4

8. Kravtsov A., Kozin S., Basov A., Butina E., Baryshev M., Malyshko V. et al. Reduction of deuterium level supports resistance of neurons to glucose deprivation and hypoxia: study in cultures of neurons and on animals // Molecules. 2022. Vol. 27. P. 243. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules27010243

9. Lu Y., Chen H. Deuterium-depleted water in cancer therapy: a systematic review of clinical and experimental trials // Nutrients. 2024. Vol. 16, N 9. P. 1397. DOI: https://doi.org/10.3390/nu16091397

10. Seneff S., Kyriakopoulos A.M. Taurine prevents mitochondrial dysfunction and protects mitochondria from reactive oxygen species and deuterium toxicity // Amino Acids. 2025. Vol. 57, N 1. P. 6. DOI: https://doi.org/10.1007/s00726-024-03440-3

11. Яглова Н.В., Обернихин С.С., Тимохина Е.П., Яглов В.В., Назимова С.В. Изменения секреторных процессов в щитовидной железе и гипофизе при постепенном уменьшении содержания дейтерия в организме // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2022. Т. 174, № 12. С. 776-779. DOI: https://doi.org/10.47056/0365-9615-2022-174-12-776-779

12. Басов А.А., Быков И.М., Барышев М.Г., Джимак С.С., Быков М.И. Концентрация дейтерия в пищевых продуктах и влияние воды с модифицированным изотопным составом на показатели свободнорадикального окисления и содержание тяжелых изотопов водорода у экспериментальных животных // Вопросы питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 43-50. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2014-00048 PMID: 25816625.

13. Барышев М.Г., Басов А.А., Болотин С.Н., Джимак С.С., Кашаев Д.В., Федосов С.Р. и др. Оценка антирадикальной активности воды с модифицированным изотопным составом с помощью ЯМР-, ЭПР- и масс-спектроскопии // Известия Российской академии наук. Серия физическая. 2012. Т. 76, № 12. С. 1507-1510. DOI: https://doi.org/10.3103/S1062873812120039

14. Козин С.В., Лясота О.М., Кравцов А.А., Чихиржина Е.В., Ивлев В.А., Попов К.А. и др. Смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме лабораторных животных при пятикратном повышении концентрации дейтерия в питьевом рационе // Биофизика. 2023. Т. 68, № 2. С. 369-375. DOI: https://doi.org/10.31857/S0006302923020163

15. Джимак С.С., Барышев М.Г., Басов А.А., Тимаков А.А. Влияние воды со сниженным содержанием дейтерия на изотопный состав лиофилизированных тканей и морфофункциональные показатели организма у крыс из разных поколений // Биофизика. 2014. Т. 59, № 4. С. 749-756. DOI: https://doi.org/10.1134/S0006350914040101

16. Basov A., Fedulova, L., Vasilevskaya E., Dzhimak S. Possible mechanisms of biological effects observed in living systems during ²H/¹H isotope fractionation and deuterium interactions with other biogenic isotopes // Molecules. 2019. Vol. 24. P. 4101. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules24224101

17. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Дыдыкин А.С., Быков И.М., Лясота О.М. и др. Коррекция метаболических процессов у крыс при хроническом эндотоксикозе с помощью реакций изотопного (D/H) обмена // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2015. № 5. С. 518-527. DOI: https://doi.org/10.7868/S0002332915050069

18. Kozin S., Skrebitsky V., Kondratenko R., Kravtsov A., Butina E., Moiseev A. et al. Electrophysiological activity and survival rate of rats nervous tissue cells depends on D/H isotopic composition of medium // Molecules. 2021. Vol. 26. P. 2036. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules26072036

19. Zlatskiy I., Pleteneva T., Skripnikov A., Grebennikova T., Maksimova T., Antipova N. et al. Dependence of biocatalysis on D/H ratio: possible fundamental differences for high-level biological taxons // Molecules. 2020. Vol. 25. P. 4173. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules25184173

20. Svidlov A.A., Drobotenko M.I., Basov A.A., Elkina A.A., Gerasimenko E.O., Malyshko V.V. et al. Influence of the 2H/1H isotope composition of the water environment on the probability of denaturation bubble formation in a DNA molecule // Phys. Wave Phenom. 2021. Vol. 29, N 2. P. 180-185. DOI: https://doi.org/10.3103/S1541308X2102014X

21. Basov A.A., Elkina A.A., Samkov A.A., Volchenko N.N., Moiseev A.V., Fedulova L.V. et al. Influence of deuterium-depleted water on the isotope D/H composition of liver tissue and morphological development of rats at different periods of ontogenesis // Iran. Biomed. J. 2019. Vol. 23, N 2. P. 129-141. DOI: https://doi.org/10.29252/.23.2.129

22. Козин С.В., Кравцов А.А., Туроверов К.К., Фонин А.В., Чихиржина Е.В., Малышко В.В. и др. Изменение функциональной активности пероксидазы хрена и бычьего сывороточного альбумина в средах с различным изотопным ²H/¹H-составом // Биофизика. 2020. Т. 65, № 2. С. 229-236. DOI: https://doi.org/10.31857/S0006302920020039

23. Джимак С.С., Копытов Г.Ф., Кашаев Д.В., Соколов М.Е., Арцыбашева О.М., Шарапов К.С. и др. Применение ЯМР-спектроскопии для определения низких концентраций нерадиоактивных изотопов в жидких средах // Известия вузов. Физика. 2015. Т. 58, № 7. С. 47-52. DOI: https://doi.org/10.1007/s11182-015-0591-9

24. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.

25. Boros L.G., Seneff S., Túri M., Palcsu L., Zubarev R.A. Active involvement of compartmental, inter- and intramolecular deuterium disequilibrium in adaptive biology // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2024. Vol. 121, N 37. Article ID e2412390121. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2412390121

26. Yaglova N.V., Timokhina E.P., Obernikhin S.S., Yaglov V.V. Emerging role of deuterium/protium disbalance in cell cycle and apoptosis // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24. P. 3107. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24043107

27. Кравцов А.А., Лясота О.М., Козлова Е.А., Моисеев А.В., Козин С.В. Влияние концентрации дейтерия среды на кальциевый гомеостаз, мембранный потенциал митохондрий и гибель нейронов при глюкозной депривации // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2025. Т. 179, № 1. С. 37-42. DOI: https://doi.org/10.47056/0365-9615-2025-179-1-37-42

28. Gureev A.P., Chernyshova E.V., Krutskikh E.P., Sadovnikova I.S., Tekutskaya E.E., Dorohova A.A. Role of the Nrf2/ARE pathway in the mtDNA reparation // Front. Biosci. (Landmark Ed.). 2024. Vol. 29, N 6. P. 218. DOI: https://doi.org/10.31083/j.fbl2906218

29. Zhuang M., Zhang X., Cai J. Microbiota-gut-brain axis: interplay between microbiota, barrier function and lymphatic system // Gut Microbes. 2024. Vol. 16, N 1. Article ID 2387800. DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2387800

30. Osadchiy V., Martin C.R., Mayer E.A. The gut-brain axis and the microbiome: mechanisms and clinical implications // Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2019. Vol. 17, N 2. Р. 322-332. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cgh.2018.10.002

31. Mayer E.A., Tillisch K., Gupta A. Gut/brain axis and the microbiota // J. Clin. Invest. 2015. Vol. 125, N 3. Р. 926-938. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI76304

32. Chang C.J., Lin C.S., Lu C.C., Martel J., Ko Y.F., Ojcius D.M. et al. Ganoderma lucidum reduces obesity in mice by modulating the composition of the gut microbiota // Nat. Commun. 2015. Vol. 6. P. 7489. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms8489

33. Комиссарова Д.В., Каширина Д.Н., Пастушкова Л.Х., Гончарова А.Г., Усанова Н.А., Орлов О.И. и др. Условно-патогенная микрофлора кишечника человека и протеом крови хозяина - поиск взаимосвязей // Технологии живых систем. 2024. T. 21. № 1. С. 5-19. DOI: https://doi.org/10.18127/j20700997-202401-01

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии CC BY-NC-ND 4.0 (Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International)

© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа». Использование текстового и иллюстративного материала данного издания для обучения любых систем искусственного интеллекта, включая машинное обучение и нейросети, запрещено без письменного разрешения правообладателя.